Bi9393 Analytická cytometrie Biofyzikální ústav AVČR Královopolská 135 612 65 Brno e-mail: ksoucek@ibp.cz tel.: 541 517 166 Karel Souček, Ph.D. Lukáš Kubala, Ph.D. Soňa Legartová, Ph.D. Alena Hyršlová Vaculová, Ph.D. Mgr. Radek Fedr IBP-logo Cytometrie nCytometrie je souhrnné označení pro skupinu metod používaných pro měření různých charakteristik buněk. Proměnné, které lze měřit cytometrickými metodami, zahrnují velikost buňky, počet buněk, morfologii buněk (tvar a strukturu), fáze buněčného cyklu, obsah DNA a přítomnost či nepřítomnost specifických proteinů na buněčném povrchu nebo v cytoplazmě. Cytometrie se používá k charakterizaci a počítání krevních buněk v běžných krevních testech, jako je úplný krevní obraz. Podobným způsobem se cytometrie také používá ve výzkumu buněčné biologie a v lékařské diagnostice (například k odhalování rakoviny či AIDS). n nPrůtoková cytometrie nSpektrální průtoková cytometrie nHyperspektrální cytometrie nObrazová cytometrie nHmotnostní cytometrie nCytometrie in vivo Struktura kurzu nPřednášky -8 lekcí o průtokové cytometrii a aplikacích -1 lekce o mikroskopických technikách -1 lekce o základech analýzy obrazu -2 lekce studentských prezentací - nBi9393c Analytická cytometrie-cvičení nNavazuje na přednášky z oblasti průtokové cytometrie, blokově ve skupinách na začátku zkouškového n nTest nKurz bude zakončen zkouškou ve formě testu shrnujícího látku za celý semestr. Výsledek testu bude tvořit 75% celkového hodnocení. nSeminář nKaždý student bude prezentovat krátký seminář jehož téma bude konzultováno s přednášejícím a bude se týkat zaměření kurzu. Na základě této prezentace bude udělen zápočet a hodnocení vlastního semináře se bude také z 25-ti % odrážet v celkové známce. Seminář studentů nTéma semináře: Jak ve své DP/DSP používám/chci použít/ mohl bych použít metody analytické cytometrie. nCílem je demonstrovat pochopení principů ze kterých vychází a jejich uplatnění v biologii. nPrezentace musí být připravena např. v PowerPoint(u). Prezentaci je doporučeno předložit v předstihu přednášejícímu ke konzultaci a posouzení. nDélka prezentace je 5 minut (~ 2 min představení podstaty Vaší experimentální práce) + diskuse Informační zdroje – průtoková cytometrie nPractical Flow Cytometry, Howard M. Shapiro, Wiley-Liss; 4th edition nCytometry: New Developments, Volume 75, Fourth Edition (Methods in Cell Biology), Zbigniew Darzynkiewicz, Academic Press; 4th edition nFlow Cytometry with Plant Cells: Analysis of Genes, Chromosomes and Genomes; Jaroslav Dolezel (Editor), Johann Greilhuber (Editor), Jan Suda (Editor), February 2007 n Více informací o knihách o průtokové cytometrii najdete na: http://www.cyto.purdue.edu/flowcyt/newbook.htm 0471411256 cover_cytometry Informační zdroje – průtoková cytometrie (metody a protokoly) nThe Handbook of Flow Cytometry Methods nCurrent Protocols in Cytometry nCompany web pages –e.g. http://www.ebioscience.com/resources/best-protocols/flow-cytometry-protocols.htm –https://www.thermofisher.com/cz/en/home/references/protocols/cell-and-tissue-analysis/flow-cytomet ry-protocol.html CPC robinson Informační zdroje – cytometrie (časopisy) nCytometry Part A nhttps://onlinelibrary.wiley.com/journal/15524930 n n n nCytometry Part B: Clinical Cytometry nhttps://onlinelibrary.wiley.com/journal/15524957 Cytometry Part A Cytometry Part B: Clinical Cytometry Informační zdroje - mikroskopie nTaatjes D. J. Cell Imaging Techniques, Methods and Protocols, Humana Press, Totowa, New Jersey, 2005 nStephens D. Cell Imaging, Scion Publishing Ltd., 2006. nPawley, J. (Ed.), Handbook of Biological Confocal Microscopy, 3rd ed., 2006 nFluorescence Microscopy: From Principles to Biological Applications nUlrich Kubitscheck (Editor), ISBN: 978-3-527-32922-9, 2013, Wiley-Blackwell n 158829157X 1904842046 http://media.wiley.com/product_data/coverImage300/26/35273292/3527329226.jpg Informační zdroje – (Internet) nPurdue University, Cytometry Labs nhttp://www.cyto.purdue.edu/ nInternational Society for Advancement of Cytometry nhttp://www.isac-net.org/ nExcyte nhttps://expertcytometry.com nhttps://twitter.com/ISAC_CYTO nhttps://twitter.com/flowcytometryUK nhttps://twitter.com/FlowJoNow n Twitter logo and symbol, meaning, history, PNG n nhttps://www.csac.cz Obecný úvod do průtokové cytometrie nZákladní principy, možnosti průtokové cytometrie a její aplikace nHistorie Tyto částice mají něco společného … Algae Chromosomes Blood cells Protozoa … určité parametry těchto částic mohou být měřeny pomocí průtokové cytometrie. bd_logo cell signaling cyflowsl Komerční zařízení a vývoj Accuri C6 Flow Cytometer facsariaII_overview influx_image bd_lsr_cell_analyzer lsrii_product facscanto_overview facscalibur_overview image2 CYAN http://www.bioscience.co.uk/userfiles/images/Moxi_Flow_Smaller.png http://www.photonics.com/images2/Website/2011/2011-07/IMS+BIO-FlowCytometry.jpg Co je průtokový cytometr? http://regmed.musc.edu/flowcytometry/images/InterrogationPoint.jpg Co můžeme analyzovat pomocí průtokové cytometrie? nPočítat částice v suspenzi nKvantifikovat rozptyl světla, a intenzitu fluorescence nHodnotit 10*5 až 10*6 částic za méně než 1 minutu nFyzicky separovat jednotlivé částice (populace) pro další analýzu Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jaké jsou principy? nRozptyl světla (Light scatter) pomocí laseru nebo UV lampy nDetekce specifické flurescence nebo celého spektra nHydrodynamicky zaostřený proud částic nElektrostatická separace částic nMožnost multivariační analýzy dat Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Definice nPrůtoková cytometrie (flow cytometry) –Meření vlastností proudících částic (buněk) –také známo jako Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) nPrůtoková separace (flow sorting) –fyzická separace částic (buněk) na základě parametrů měřených průtokovou cytometrií Technické součásti nZdroje světla nDetekční systémy nFluidní systém nSeparace nSběr dat nAnalýza dat J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Technické součásti nDetekční systémy Fotonásobiče (Photomultiplier Tubes (PMTs)) dříve 1-2 nyní >8 Diody dříve detekce rozptylu světla (light scatters) nyní i detekce fluorescence nZdroje světla Lasery (350-363, 420, 457, 488, 514, 532, 600, 633 nm) Argon ion, Krypton ion, HeNe, HeCd, Yag UV (Arc) Lampy Mercury, Mercury-Xenon J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Netechnická část je neméně důležitá … n(ne)specifické značky/sondy nprotilátky nbiomarkery npříprava, zpracování materiálu/vzorků/tkání n… Historie barvení biologických materiálů Až do poloviny 19. století – byly používány pouze přírodní barviva Anton van Leeuwenhoek použil v roce 1719 šafrán na obarvení svalových buněk www.euronet.nl/users/warnar/leeuwenhoek.html Historie barvení biologických materiálů Paul Ehrlich - 1879 použil kyselá a zásaditá barviva pro odlišení acidofilních,eosinofilních a neutrofilních leukocytů Clin Lab Med. 1993 Dec;13(4):759-71. The Ehrlich-Chenzinsky-Plehn-Malachowski-Romanowsky-Nocht-Jenner-May-Grunwald-Leishman-Reuter-Wright-Gi emsa-Lillie-Roe-Wilcox stain. The mystery unfolds. Woronzoff-Dashkoff KP. ix70biglightpaths Princip fluorescenčního mikroskopu - August Köhler - 1904 http://micro.magnet.fsu.edu/primer/anatomy/anatomy.html Historie barvení biologických materiálů Andrew Moldavan n Není jasné zda Moldavan vůbec svůj „počítač buněk“ sestrojil. Ve svém, článku popisuje mnoho problémů, ale žádné výsledky. Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells Andrew Moldavan Montreal, Canada Science 80:188-189, 1934 “The purpose of the experiment is to have each microscopical cell passing through the capillary tube, register itself automatically on the photoelectric apparatus, thus creating a micro-current which can be amplified and recorded.” J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Coons et al 1941 – vyvinuli techniku fluorescenčního značení protilátek - označili anti-pneumokokové protilátky pomocí antracénu. To jim umožnilo detekovat protilátky i patogeny v tkáni pomocí UV fluorescence. Immunological Properties of an Antibody Containing a Fluorescent Group Albert H. Coons, Hugh J. Creech and R. Norman Jones Department of Bacteriology and Immunology, Harvard Medical School, and the Chemical Laboratory, Harvard University Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 47:200-202, 1941 “Moreover, when Type II and III organisms were dried on different parts of the same slide, exposed to the conjugate for 30 minutes, washed in saline and distilled water, and mounted in glycerol, individual Type III organisms could be seen with the fluorescence microscope……” Coons a Kaplan (1950) - konjugovali fluorescein s isokyanátem (FITC) – získali lepší signál – dále od autofluorescence. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Friedman n Friedman (1950) – kombinoval kyselý fuchsin, akridinovou žlut´a berberin pro detekci buněk nádorů dělohy pomocí fluorescenčního mikroskopu 42685 Acid Fuchsin Acid magenta Acid rubin Acid roseine Absorption Max 540-545 von Bertalanffy & Bickis Ludwig von Bertalanffy (1901-1972) von Bertalanffy & Bickis (1956) - metachromatická fluorescence Akridinové oranže byla použita pro detekci RNA v tkáni - použili ji také pro rozlišení normálních a nádorových buněk 46005 Absorption Max 467 nm J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Stain Your Own Cell Thermo Fisher Scientific Logo P.J. Crossland-Taylor „Sheath Flow“ princip “Provided there is no turbulence, the wide column of particles will then be accelerated to form a narrow column surrounded by fluid of the same refractive index which in turn is enclosed in a tube which will not interfere with observation of its axial content.” J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Wallace Coulter • nWallace Coulter - Coulter orifice - 1956 - n(patent 1953) – měření změny vodivosti během průchodu buněk v suspenzi malým otvorem Originální patentová aplikace W.Coultera 1953 Photo by J.Paul Robinson J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Jak počítat buňky? nHemocytometer (Bürkerova komůrka) byla standardem pro počítání buněk do ~ 1950 nRozměry jsou 3x3x0.1 mm. Obvykle jsou červené krvinky (1 x 106/mm3 )počítány po naředění 1:200 nLeukocyty (5x103/mm3) jsou ředěny 1:10 v roztoku lyzujícím červené krvinky nStatistická chyba: – koeficient variance (CV) je při 500 spočítaných buňkách 4.4% – chyba pipetování a ředění je ~ 10% Upraveno podle J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Roche Innovatis Cedex CellDrop - Denovix https://www.denovix.com/wp-content/uploads/2013/03/CellDrop_directpipette.jpg https://www.denovix.com/wp-content/uploads/2019/05/cell_gating.png https://www.denovix.com/wp-content/uploads/2019/01/293t_cluster_image.jpg https://www.denovix.com/wp-content/uploads/2019/01/CellDrop_aopi_result.jpg https://www.denovix.com/celldrop/ Coulter Counter DSC03890 DSC03891 První komerční verze CC Untitled-7 Coulter Counter © CC Beckman Coulter nMultisizer™ 3&4 COULTER COUNTER® Roche Innovatis CASY TT DSC03898 Cytograph. Stolní přístroj schopný měřit rozptyl světla He-Ne laseru (1970). Mack Fulwyler- sorter n Mack Fulwyler - sorter 1965 - Los Alamos National Labs – jeho sorter separoval částice na základě elektronicky měřeného objemu (stejný princip jako Coulter counter) a separoval pomocí elektrostatického vychýlení. n Cílem bylo sortrovat červené krvinky,protože u nich byla naměřena bimodální distribuce buněčného objemu. Princip separace byl založen na principu inkoustové tiskárny Richarda Sweeta ze Stanfordu (1965) n Po té co bylo objasněno, že bimodalita červených krvinek je artefakt byla tato skupina schopna separovat neutrofily a lymfocyty z krve. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 Untitled-6 Richard Sweet n Richard Sweet vyvinul elektrostatickou inkoustovou tiskárnu jejíž princip využil Mack Fulwyler pro svůj buněčný sorter. J.P. Robinson Purdue University BMS 631 DSC03894 Mack Fulwyler- sorter DSC03895 Mack Fulwyler- sorter K. Souček Leonard Arthur "Len" Herzenberg Klíčové „cytometrické“ publikace n1934: Moldovan – Fotoelektrické meření buněk v kapiláře n1947: Gucker – fotoelektrické počítání buněk n1949: Coultrův počítač částic n1961: Rotman poprvé používá fluorescenci pro kvantifikaci enzymatické reakce n1964: Sweet – elektrostatická inkoustová tiskárna n1965: Fulwyler – květen 1965 - patent elektrostatického sorteru n1965: Kanetsky – spektrofotometrické měření buněk n1965: Fulwyler – listopad 1965 – publikace o buněčné separaci v časopise Science n1968: Gohde – první článek o fluorescenční průtokové cytometrii (v němčině) n1969: Gohde – patent n1969: Van Dilla – druhý článek o fluorescenční průtokové cytometrii n1969: Mullaney – první článek věnující se popisu rozptylu světla jako cytometrického parametru n1969: Heryenberg – třetí článek o fluorescenční průtokové cytometrii n1973: Gohde – patent dvojího značení n1977: Gohde – popis kompenzací signálu při dvojtém značení n1978: Kachel – flow imaging – kombinace průtokové cytometrie a analýzy obrazu n1983: izolace a detekce jader (DNA) z tkání zalitých v parafínu n1984: kongres o nomenklatuře cytometrie DNA n1987: Graz - vysokorychlostní sortrování chromozómů n1991: Robinson – automatizace klinických systémů – průtokový cytometr a čtečka čárkových kódů n n Zdroj – ISAC 2006 –The Wall of History flyier K čemu to všechno je… například… Zackary http://app2.iris.usm.maine.edu/gulfofmaine-censusdev/wp-content/images/Technology/FlowCytobotFigure 02.jpg Naturejobs – the world's leading science jobs K čemu to všechno je… například… n n n38 miliónů lidí na světě je infikováno virem HIV (WHO, 2019) nročně zemře ~ 0,7 miliónu lidí na HIV/AIDS, 1,7 milionu nově infikovaných (v Africe je ~ 11 miliónu AIDS sirotků) nkvantifikace CD4 T lymfocytů byla/je klíčový parametr při monitorování onemocnění/léčby, od ~1985 nSince 2016, WHO recommended that all people living with HIV be provided with lifelong ART, including children, adolescents and adults, and pregnant and breastfeeding women, regardless of clinical status or CD4 cell count. By the end of 2019, 185 countries had already adopted this recommendation, covering 99% of all people living with HIV globally. nPrůtoková cytometrie je „zlatý standard“ nOptimalizované postupy a zařízení pro levné (< 3 EUR / vzorek) a rychlé detekce (250 vzorků / den) nAydogan Ozcan: „Kill the cost, safe life“ n n CyFlow® miniPOC Flow Cytometry On-a-Chip nMAGNETIC COUNTING –RESEARCHER: Hakho Lee, Assistant Professor of Radiology, Harvard Medical School PROJECT: Enumerating and characterizing circulating tumor cells PROBLEM: Circulating tumor cells (CTCs) are incredibly rare, with just a handful per milliliter of human blood. SOLUTION: Lee’s group fabricated a hybrid microfluidic device out of polydimethylsiloxane (PDMS) that can count CTCs in real time using tiny sensors called micro-Hall detectors. (Sci Transl Med, 4:141ra92, 2012) nPCR-ACTIVATED SORTING –RESEARCHER: Adam Abate, Assistant Professor of Bioengineering and Therapeutic Sciences, University of California, San Francisco PROJECT: Analysis of rare, uncultivable microbes PROBLEM: Developing specific antibodies for bacteria that cannot be cultured SOLUTION: As a postdoc in the Harvard University lab of droplet-based microfluidics pioneer David Weitz, Abate codeveloped a device that could sort droplets according to their fluorescence intensity. Unlike traditional microfluidics, in which molecules and cells flow naked through channels, droplet-based devices encapsulate molecules or cells in uniform, picoliter-scale aqueous reaction chambers encased in oil. nSORTING BY CELL DEFORMABILITY –PROJECT: Cancer cell phenotyping PROBLEM: Not every cell type has a known antigen that defines it. Plus, antibody binding may activate receptors, potentially changing the cell’s behavior. SOLUTION: A physicist by training, Guck used laser beams in his graduate work to study the physical properties of cells. Not all cells are equally squishy, he found: while normal cells are relatively rigid, cancer cells are more pliable. “The more aggressive the cell, the softer it is, and that may be necessary for it to pass into tissues,” Guck explains. nRAMAN-ACTIVATED CELL SORTING –RESEARCHER: Jian Xu, Professor and Director, and Bo Ma, Group Lead of Microfluidics, Single-Cell Center, Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology, Chinese Academy of Sciences PROJECT: Microbial biofuels development PROBLEM: Biofuels R&D requires identifying cells capable of specific carbon chemistries. But as these cells have yet to be cultured and studied, researchers have few if any molecular hooks for identifying and sorting them. SOLUTION: The team turned to a label-free method of single-cell interrogation known as Raman-activated cell sorting (RACS) (Anal Chem, 87:2282-89, 2015). http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/43034/title/Flow-Cytometry-On-a-Chip/ Figure1 Cellular Indexing of Transcriptomes and Epitopes by Sequencing (CITE-seq) https://www.biolegend.com/Files/Images/BioLegend/totalseq/basicTotalseq.jpg Co tomu předcházelo…a čeho jsme i nyní součástí… nRozvoj techniky umožňující rychlou a reprodukovatelnou detekci cytometrických parametrů. nNové vědecké poznatky vedoucí k definici vhodných diagnostických markerů. [USEMAP] http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/start.htm?loc=http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/gh/HTML/v ideo/video.html?v=Flowtheinvention.wmv ISAC presents: Mack Fulwyler - Innovator, Inventor & Pioneer [USEMAP] http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/seminalcontributions/fulwyler.html https://www.youtube.com/watch?v=3s5l2mepKkY https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/2/2f/Internet_Explorer_10_logo.svg/2000px-Inte rnet_Explorer_10_logo.svg.png https://www.youtube.com/yt/brand/media/image/YouTube-logo-full_color.png Shrnutí přednášky nÚvod do kurzu nZdroje literatury nHistorie průtokové cytometrie nZákladní principy Na konci dnešní přednášky byste měli: 1.vědět jaké jsou požadavky pro tento kurz 2.znát základní zdroje informací 3.mít stručný přehled o historii průtokové cytometrie 4.orientovat se v některých základních principech průtokové cytometrie