Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Úvod: Chemická struktura nukleových kyselin, transkripce a její regulace o prokaryot (sigma factor, LAC operon, aktivátory a represory) a eukaryot (zesilovače transkripce, epigenetika), translace a její regulace u prokaryot a eukaryot. Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 2 Sylabus 1.Chemická struktura nukleových kyselin, transkripce a její regulace o prokaryot (sigma faktor, LAC operon, aktivátory a represory) a eukaryot (zesilovače transkripce, epigenetika), translace a její regulace u prokaryot a eukaryot. 2.Modelové organismy využívané v biotechnologii – bakterie (E. coli), kvasinky (Pichia, Saccharomyces) a houby (Penicillium), Caenorhabditis elegans (háďátko), Drosophila melanogaster, Danio rerio (Dánio pruhované), myš domácí, živočišné buněčné kultury, Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní), viry (bakteriofágy, retroviry). Replikace DNA u eukaryot a prokaryot, opravné procesy, in-vitro syntéza DNA (PCR, reverzní transkripce). 3.Základní technologie rekombinantní DNA - enzymy, vektory, metody transformace, konstrukce genových knihoven. Techniky pro editaci genomu (ZFNs, TALENs, CRISPR). 4.Rekombinantní proteiny – exprese proteinů v bakteriích (klonovací strategie, použití kodónů, omezení toxických efektů v důsledku nadprodukce, zvýšení stability a sekrece, glykosylace), exprese proteinů v eukaryontních buňkách (kvasinky, hmyzí buňky, savčí buňky), výhody a nevýhody jednotlivých expresních systémů 5.Genomika a genová exprese – techniky mapování genů, nekódující části genomu, bioinformatické nástroje, farmakogenetika, DNA mikroarrays, RNA-seq techniky, metagenomika, epigenetika. ̶ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 3 Sylabus 6.Technologie založené na RNA – rozdělení RNA, význam ne-kódujících RNA, antisense RNA a umlčování genů, ribozymy 7.Technologie v imunologii – protilátky (struktura, funkce), cílený návrh protilátek, monoklonální protilátky, ELISA, vakcíny (tvorba a výroba, identifikace potenciálních nových antigen, DNA vakcíny) 8.Transgenní rostliny - tkáňové kultury, genetické úpravy rostlin (Ti plazmid), funkční genomika, biotechnologické aplikace. Transgenní zvířata – techniky tvorby, metody kontroly exprese transgenu, aplikace RNA-technologií, příklady transgenních zvířat. 9.Genová terapie – vrozené defekty u vyšších organismů, identifikace vadných genů, obecný princip genové terapie, genová terapie pomocí retrovirů a adenovirů, agresivní genová terapie, využití RNA v rámci terapie, cílená editace genů. 10.Nanotechnologie – nanočástice, kvantové tečky, DNA origami. Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 4 Struktura nukleových kyselin ̶DNA a RNA - polymery skládající se z podjednotek nazývaných nukleotidy ̶Nukleotid – fosfátová skupina, cukr (ribóza, deoxyribóza), báze (A,G,C,T,U) ̶Fosfát propojuje dva cukerné zbytky pomocí fosfodiesterové vazby ̶Nejvíce stabilní struktura – dvou řetězcová molekula DNA v anti-paralelní orientaci vláken (dvoušroubovice) ̶Purinové báze se párují s pyrimidinovými (A-T, G-C, A-U) pomocí vodíkových vazeb; G-C pár stabilnější díky třem vazbám Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 5 Struktura nukleových kyselin Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems Zápatí prezentace 6 Analogy bází nukleových kyselin ̶Lock Nucleic Acid (LNA), Bridged Nucleic Acid (BNA) ̶2’-O a 4’-C atomy kruh ribózy jsou spojeny pomocí methylenového můstku ̶Fixace kruhu ribózy v optimální konformaci pro Watson-Crick párování ̶Pár se rychleji tvoří a má vyšší stabilitu ̶LNA oligonukleotidy jsou ideální pro detekcí krátkých nebo velmi podobných cílů v rámci DNA/RNA ̶Vyšší specifita sond v rámci qPCR (detekce SNPs), jedinečné rozlišení mikroRNA rodin, vyšší stabilita (in vitro/in vivo), velmi účinná inhibice malých RNA in vivo. Adobe Systems Zápatí prezentace 7 Analogy bází nukleových kyselin ̶Peptide Nucleic Acids (PNAs) – Nielsen et al., Science, 1991 ̶DNA analogy, fosfodiesterová vazba je nahrazena N-(2-aminoetyl)glycinem ̶Syntetická kostra - jedinečné vlastnosti v rámci hybridizace ̶PNA je nenabitá = v rámci hybridizace nedochází k elektrostatické repulzi = vysoká stabilita PNA-DNA, PNA-RNA duplexů ̶PNA hybridizuje nezávisle na koncentraci solí v roztoku ̶Nedochází k degradaci PNA pomocí nukleáz nebo proteáz a nejsou rozpoznávány polymerázami ̶PNA se může vázat v anti-paralelním i paralelním uspořádání, tvořit triplex (Hoogsteenovo párování) ̶ N-(2-Aminoethyl)glycine (CAS 24123-14-6) | Glentham Life Sciences Adobe Systems Zápatí prezentace 8 Peptide Nucleic Acids (PNAs) Brind'Amour, Julie. (2020) Hoogsteen (1963) Acta Crystallographica. 16 Watson and Crick (1953). Nature 171 Adobe Systems Zápatí prezentace 9 Peptide Nucleic Acids (PNAs) ̶Použití PNAs in vivo limituje nízký prostup do buněk – spojení s DNA oligomery, ligandy receptorů nebo peptidy penetrujících do buněk ̶Využití PNA: - specifické doručování do jádra - využití v rámci PCR a Q-PNA PCR - vazba nukleových kyselin (DNA/RNA – capture) - hybridizační techniky (PNA-FISH) Pellestor et al. 2004 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 10 Konformace DNA ̶Pravotočivá dvoušroubovice, 1 otáčka cca. 10 páru bazí, 34 Å ̶Může zaujímat různé konformace: B-forma - nízká koncentrace solí (11 bp/otáčku) A-forma - vysoká koncentrace solí (11 bp/otáčku) Z-forma - levotočivá dvoušroubovice (12 bp/otáčku) Picture The six base pair parameters; twist, roll, tilt, rise, shift and slide. DNA base pairs are shown by rectangular solids (top). Schematic view of the adjacent base pairs, and the covalent bonds along the backbones, which are simply modeled by two springs (bottom). The half of the length and width of of the base pairs are shown by l and w, respectively, and b equals to the rise of undeformed DNA. At each base pair, we consider a localized Cartesian coordinate system xyz. Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 11 G-kvadruplexy ̶Tvorba v G-bohatých oblastech ̶Struktura stabilizovaná Hoogsteenovým párováním a monovalentním kationtem (K+ > Na+ >Li+) ̶Čtyř-řetězcová nekanonická struktura DNA ̶Klíčové funkce v transkripci, replikaci, stabilitě genomu a epigenetické regulaci ̶Význam v léčbě nádorů (použití molekul stabilizujících strukturu G4) ̶Objevena celá řada proteinů interagujících specificky s G4 Spiegel et al. 2020 Adobe Systems Zápatí prezentace 12 Sbalení nukleových kyselin ̶Molekula DNA je příliš dlouhá – nutná kondenzace ̶U bakterií dochází k nadšroubovicovému vinutí (supercoiling) pomocí enzymu DNA gyrázy (levotočivé zkroucení) ̶Rozvolnění kondenzované struktury pomocí topoizomerázy I ̶U eukaryot je DNA navinuta na histony nesoucí kladný náboj – chromatin ̶Nukleozom se skládá z cca. 200 bp a devíti proteinů (H2A (2x), H2B (2x), H3 (2x), H4 (2x) a H1) ̶Chromatin je dále stočen do helikální struktury (30-nm vlákna, 6 nukleozomů/otáčku) ̶Vlákna jsou přichycena na chromozomální ose pomocí tzv. “matrix attachment regions“ (MAR) ̶MAR mají cca. 200-1000 bp a jsou bohaté na A/T Adobe Systems Zápatí prezentace 13 Sbalení nukleových kyselin Bakterie Eukaryota 30-nm vlákna, 6 nukleozomů/otáčku Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 14 Centrální dogma molekulární biologie ̶Klíčové vlastnosti živých tvorů - schopnost reprodukovat vlastní genom - tvořit vlastní energii ̶Nutnost organismů vyrobit proteiny kódované v rámci své DNA ̶Proteiny – tvorba energie, kontrola replikace, vnitro- a mezibuněčná komunikace ̶Centrální dogma molekulární biologie: DNA je přepisována do RNA, která je následně překládaná do proteinů ̶ Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 15 Transkripce ̶Tvorba kopií RNA na základě DNA kódu ̶Zahrnuje: - rozvinutí DNA - rozpletení vláken na počátku transkripce - odstranění histonů - tvorba RNA pomocí enzymu RNA polymerázy (5´→3´procesivita) ̶“Housekeeping“ geny přepisovány kontinuálně ̶ Indukovatelné geny přepisovány jen za specifických podmínek (lac operon) ̶ Výsledný kódovaný produkt – protein (mRNA), RNA (tRNA, rRNA, snRNA, ribozym) ̶ Cistron (strukturní gen) - kódující oblasti genů pro proteiny nebo ne-translatované RNA ̶ Otevřený čtecí rámec (ORF) – úsek DNA kódující protein nepřerušený STOP kodónem What Is Transcription? (Biology) — Definition & Process - Expii If the wild type phenotype is restored by both cis and trans arrangements it is concluded that the two mutations are in different genes and hence that the phenotype is determined by more than one gene. If the trans test is negative and the cis positive this means that the two mutations are in the same gene. If both tests are negative then at least one of the mutations must be dominant. Thus the double test provides a means of fine mapping of genes. Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 16 Transkripce ̶Každý gen má před kódující sekvencí promotor ̶Bakteriální promotory - oblast -10(TATAA) a -35(TTGACA) ̶Konstitutivní geny – velká shoda ̶Řízené geny – aktivační proteiny/transkripční faktory ̶Transkripce: - Místo začátku transkripce - 5´netranslatovaná oblast (5´UTR) – vazba ribozómu - otevřený čtecí rámec (ORF) – vlastní protein - 3´netranslatovaná oblast (3´UTR) – regulace míry translace ̶ Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 17 RNA polymeráza ̶Složená s několika podjednotek - sigma podjednotka – rozpoznání oblasti -10 a -35 - vlastní enzym katalyzující syntézu (5´→3´) ̶Enzym má pět podjednotek (2 x a, b a b´, w) - b a b´ - vlastní katalytické místo - a podjednotky napomáhají rozpoznat promotor ̶Po vazbě RNA polymerázy – tvorba transkripční bubliny ̶RNA polymeráza používá nekódující řetězec (antisense) ̶Sekvence RNA shodná s kódujícím řetězcem ̶RNA syntéza začíná od purinu obklopeného pyrimidiny (CAT, CGT) ̶Rychlost syntézy 40 bazí/sekundu ̶ Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 18 Jie Chen et al. PNAS 2010;107:28:12523-12528 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 19 Jie Chen et al. PNAS 2010;107:28:12523-12528 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 20 Ukončení transkripce ̶Transkripce je ukončena terminačním signálem ̶Rho-nezávislý terminátor - typicky GC-bohatá vlásenka následovaná poly-T místem - RNA polymeráza většinou odpoutá v polovině poly-T sekvence ̶Rho-závislý terminátor - obsahují dvě obrácené vlásenky - Rho je homohexamerní RNA závislá ATPáza - váže se na C-bohatou oblast před místem terminace - pohybuje se po RNA dokud nedostihne RNA polymerázu u vlásenky Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 21 Organizace chromozómů ̶Prokaryota - vzdálenost mezi geny malá - geny jedné metabolické dráhy vedle sebe (operon) - polycistronní mRNA ̶Eukaryota - monocistronní mRNA - u polycistronní se přepisuje pouze první cistron Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 22 Transkripce u Eukaryot ̶Účast tří RNA polymeráz: - RNA polymeráza I (transkripce velkých ribozomálních RNA) - RNA polymeráza II (transkripce genů kódujících proteiny) - RNA polymeráza III (transkripce tRNA, 5S rRNA, malé RNA) ̶RNA pol. II potřebuje pro transkripci: - iniciační box, TATA box, elementy vázající transkripční faktory - základní transkripční faktory - specifické transkripční faktory - TATA box protein (TBP) Yokoyama, 2019 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 23 Aktivace RNA polymerázy II ̶TFIID→TFIIB →RNA pol. II/TFIIA →TFIIF →TFIIE,TFIIJ,TFIIH ̶TFIIH fosforyluje RNA pol. II ̶TFIIH zůstává asociovaný s RNA polymerázou II Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 24 Regulace transkripce u prokaryot ̶Zapojení aktivátorů a represorů transkripce - aktivátory – pozitivní regulace - represory – negativní regulace ̶Vazba na promotorovou oblast DNA ̶Blokace vazby RNA polymerázy nebo počátku transkripce ̶Většina genů je kontrolována kombinací faktorů ̶Regulační proteiny mohou zpomalovat elongaci nebo ji předčasně ukončit ̶Anti-terminátorové proteiny obchází místo ukončení transkripce ̶Klíčová role různých sigma (s) podjednotek - s70 (RpoD) – rozpoznává většinu house-keeping genů - s32 (RpoH) – aktivace genů souvisejících s teplotním šokem (chaperoniny a proteázy) Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 25 Teplotní šok Heat shock response major seminar Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 26 Laktózový operon ̶Regulační proteiny transkripce existují v aktivní (vázající se) a inaktivní (nevázající se) formě ̶Přechod mezi jednotlivými formami vazbou signálních molekul nebo induktorů ̶lac operon = polycistronní - lacZ (b-galaktozidáza), lacY (laktóza permeáza), lacA (laktóza acetyláza) ̶lacI = represor lac operonu, kódován v opačném směru ̶Promotor obsahuje lacO vazné místo (operátor) a Crp místo pro vazbu CRP proteinu (cAMP receptorový protein ̶V případě nedostatku glukózy a přítomnosti laktózy: - zvýšená hladin cAMP - tvorba alolaktózy (analog isopropyl-thiogalaktozid, IPTG) pomocí b-galaktozidázy ̶ ̶ Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 27 Laktózový operon Wheatley et al., 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 28 Laktózový operon Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f02-09.jpg GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 29 Dvou komponentní regulační systém ̶Často dochází ke kovalentní modifikaci aktivátoru/represoru pomocí různých skupin (methyl, acetyl, AMP-/ADP-ribóza. ̶V případě dvou komponentního regulačního systému dochází k přenosu k přenosu fosfátu ze senzorové kinázy na aktivátor/represor (tzv. “phosphorelay system“) ̶ ̶ Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 30 Regulace transkripce u eukaryot ̶Daleko více komplexní ve srovnání s prokaryoty - DNA je navinuta na histonech - jaderná membrána nepropouští většinu proteinů do jádra - velká role epigenetických modifikací (DNA, histony) ̶Všechny transkripční faktory mají dvě vazné domény – DNA a transkripční aparát Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 31 Transkripční faktor GAL4 C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f02-10.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Ashkenazy et al, 2010 Repressor LexA or LexA is a transcriptional repressor (EC 3.4.21.88) that represses SOS response genes coding primarily for error-prone DNA polymerases, DNA repair enzymes and cell division inhibitors.^[1] LexA forms de facto a two-component regulatory system with RecA, which senses DNA damage at stalled replication forks, forming monofilaments and acquiring an active conformation capable of binding to LexA and causing LexA to cleave itself, in a process called autoproteolysis.^[2] Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 32 Regulace transkripce u eukaryot ̶Daleko více komplexní ve srovnání s prokaryoty - DNA je navinuta na histonech - jaderná membrána nepropouští většinu proteinů do jádra - velká role epigenetických modififikací (DNA, histony) ̶Všechny transkripční faktory mají dvě vazné domény – DNA a transkripční aparát ̶Transkripční faktory pracují skrze tzv. mediátorový komplex ̶Mediátorový komplex: - přenáší signál z aktivačních proteinů na RNA polymerázu II - obsahuje 26 rozdílných podjednotek tvořících jádro - je přímo asociovaný s RNA polymerázou II, kde čeká na informaci ̶ Transkripční faktory se mohou vázat také na tzv. zesilovače transkripce Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 33 Regulace transkripce u eukaryot Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 34 Izolátory (Insulators) ̶DNA sekvence zabraňující zesilovačům transkripce chybně aktivovat geny ̶Jsou umístěny mezi zesilovač a geny, které nesmí regulovat ̶Insulator binding protein (IBP) se váže na tyto sekvence a blokuje zesilovače transkripce ̶IBP se nemůže vázat na methylovanou DNA Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 35 AP-1 (aktivator protein-1) C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f02-12.jpg ̶Aktivuje široké spektrum genů ̶Nejlepší stimulátory AP-1 zahrnují růstové faktory a UV záření ̶Dimer dvou proteinů z Fos a Jun rodiny ̶Patří do rodiny bZIP DNA vazných proteinů ̶Stimulace AP - zvýšená exprese Fos a Jun proteinů - zvýšená stabilita Fos a Jun proteinů - fosforylace aktivační domény pomocí JNK (Jun aminoterminální kináza) ̶ Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems Zápatí prezentace 36 Zpracování eukaryotické mRNA Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 37 Zpracování eukaryotické mRNA ̶dochází k přidání čepičky na 5´konec mRNA (m7GTP) ̶dochází k přidání polyA konce na 3´konec pomocí poly-adenylačního komplexu ̶ ̶ Yadong Sun et al. PNAS 2018 mRNA translation initiation loop Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 38 Zpracování eukaryotické mRNA ̶Dochází k odstranění intronů z primárního transkriptu pomocí faktorů sestřihu v rámci spliceosomu Shi. Nature 2017 https://www.youtube.com/watch?v=JnBf3tq_aXY Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 39 Epigenetika ̶Jakákoliv jiná změna v rámci DNA, než v nukleotidové sekvenci A) post-translační modifikace histonů B) metylace DNA C) remodelace nukleozomu D) umlčení zprostředkované RNA ̶Většina epigenetických změn ovlivňuje přístup regulačních proteinů k DNA - rozvolněný chromatin (euchromatin) - snadný přístup regulačních proteinů - kondenzovaný chromatin (heterochromatin) – znemožněn přístup regulačních proteinů Frontiers In Bioscience, Landmark, 23, 2018 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 40 Epigenetika Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 41 Acetylace histonů ̶Histon-acetyltransferázy (HATs) – přenos acetylu na Lys zbytky na koncích histonů ̶ ̶ ̶ ̶ ̶Histon-deacetylázy (HDACs) – odstranění acetylu z Lys zbytků Lysine acetylation mechanism Lysine deacetylation mechanism Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 42 Metylace histonů ̶Lysin-metyltransferázy (KMTs) – přenos methylové skupiny na Lys zbytky na koncích histonů ̶ ̶ ̶ ̶ ̶Lysin-demetylázy (KDMs) – odstranění methylové skupiny z Lys zbytků ̶ Lysine mono-, di- and trimethylation Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 43 Metylace DNA ̶U prokaryot metylace odlišuje nově syntetizované vlákno od templátu. ̶U eukaryot metylace umlčuje různé geny a brání jejich expresi. ̶Metylace se objevuje v motivech CpG nebo CpNpG - udržovací metylázy – metylace nově syntetizovaného vlákna DNA - de novo metylázy – nově přidávané metylace do DNA - demetylázy – odstranění nechtěných metylací z DNA ̶Celá řada genů v blízkosti tzv. CpG ostrůvků ̶Při metylacích rozsáhlých úseků na DNA CpG ostrůvky váží metylcytosin vázající proteiny, které zároveň aktivují histondeacetylázy = tvorba heterochromatinu Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 44 Metylace cytosinu Cytosine methylation mechanism Deamination of cytosine and 5-methylcytosine Base flipping in DNA methylation Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 45 Proces translace ̶Přenos informace v mRNA do konkrétního proteinu ̶Každá aminokyselina je v mRNA kódována v rámci tří bazí nazývaných triplety/kodony ̶Jednotlivé kodony v rámci mRNA rozpoznávají molekuly transferové RNA (tRNA) ̶Aminokyseliny jsou připojovány k příslušným tRNA pomocí enzymů aminoacyl-tRNA syntetáz ̶ ̶ ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f02-16.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f02-15.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 46 Syntéza proteinů u prokaryot ̶Probíhá v ribozomech - 30S (16S rRNA + 21 proteinů) - 50S (5S, 23S rRNA + 34 proteinů) ̶Velká podjednotka = tři vazná místa – A (akceptor), P (peptide) a E (exit) ̶Translace začíná na AUG kodónu po Shine-Dalgarno sekvenci (UAAGGAGG) ̶Translace je iniciována derivátem Met (N-formyl-methionin) navázaný na 30S podjednotku ̶Iniciační faktory – složení 30S iniciačního komplexu ̶tRNAifmet se váže do P-místa ribozomu, A-místo obsazuje daná tRNA, peptidyl-transferázová aktivita 23S rRNA katalyzuje tvorbu peptidové vazby ̶Přidávání dalších AK v rámci elongace vyžaduje elongační faktory, stop kodón váže RFs ̶Několik ribozomů se většinou váže na mRNA za tvorby polyzomu ̶ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 47 Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 48 pET28 vektor Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 49 Syntéza proteinů u eukaryot ̶Translace probíhá v cytoplasmě (drsné ER) ̶Nedochází ke spojení procesu transkripce a translace ̶Probíhá v ribozomech - 40S (18S rRNA + 32 proteinů) - 60S (5S, 5.8S a 28S rRNA + 47 proteinů) ̶mRNA neobsahuje Shine-Dalgarno sekvenci, rozpoznání čepičky a Kozak sekvence ̶První aminokyselina je Met bez modifikace ̶Celá řada eukaryotických proteinů je následně ještě post-translančně modifikována ̶ mRNA translation initiation loop Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE - Úvod 50 Syntéza proteinů u eukaryot Clark and Pazdernik, 2016