Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Modelové organismy: Modelové organismy využívané v biotechnologii – bakterie (E. coli), kvasinky (Pichia, Saccharomyces) a houby (Penicillium), Caenorhabditis elegans (háďátko), Drosophila melanogaster, Danio rerio (Dánio pruhované), myš domácí, živočišné buněčné kultury, Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní), viry (bakteriofágy, retroviry). Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 2 Modelové organismy ̶DNA se nachází ve všech živých organismech a virech ̶Detailně je zkoumán pouze zlomek tzv. modelových organismů ̶U modelových organismů dnes známe kompletní genom ̶Modelové organismy využíváme: - jako model pro studium podobných organismů - v celé řadě biotechnologických procesů MIT engineers have programmed viruses called bacteriophages to kill different strains of E. coli, by making mutations in a viral protein that binds to host cells. Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 3 Bakterie ̶Tahoun modelových organismů ̶Tvoří cca. 50% všech živých organismů (5 x 1030) ̶Schopnost přežití v extrémních podmínkách –teplota (Thermus aquaticus), pH (Acidothiobacillus) ̶Nejčastěji využívaná je Escherichia coli: - gram-negativní tyčka - na povrchu má cca. 10 flagel a tisíce pili - většina kmenů je neškodná - E. coli O157:H7 – dva toxiny zodpovědné za krvavé průjmy ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-05.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 4 Bakterie With 'recoded' synthetic genome, scientists give life new dictionary - STAT Cultural Characteristics of E. coli Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 5 E. coli ̶Rychlý nárůst kultury ̶Může růst pouze v médiu obsahujícím minerální soli a cukr ̶Tekutá kultura vydrží týdny v lednici ̶Může být zamražena na -70°C až na 20 let ̶Může růst jak za aerobních tak anaerobních podmínek ̶Má jeden kruhový chromosom obsahující asi 4000 genů C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-07c.jpg Clark and Pazdernik, 2016 C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-08.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 6 Plasmidy ̶V rámci strategie přežití nutná kompetice s ostatními organismy ̶Celá řada bakterií sekretuje toxiny nazývané bakteriociny ̶E. coli produkuje tzv. koliciny (E1, M) – proděravění plasmatické membrány, degradace DNA/RNA ̶Imunitní proteiny bakterie neutralizují účinek toxinů ̶Schopnost produkce kolicinů je dána přítomnosti plazmidů (ori místo) ̶Tyto plazmidy byly modifikovány pro biotechnologické účely ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-09.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 7 Plasmid pET28 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 8 ̶Bacillus subtillis – produkce proteáz a amyláz ̶Pseudomonas putida – schopnost degradace celé řady aromatických látek ̶Streptomyces coelicolor – degraduje celulózu a chitin, produkce celé řady antibiotik ̶Corynebacterium glutamicum – produkce L-glutamátu a L-lysinu ̶Streptococcus zooepidemicus – produkce k. hyaluronové ̶ Bakterie v biotechnologii Gram Positive vs Gram Negative | Technology Networks Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 9 Eukaryota ̶Celá řada eukaryot je diploidní (dvě kopie každého chromozomu) ̶Celá řada rostlin je naopak polyploidní (pšenice = hexaploidní, rajče = tetraploidní) ̶U zvířat je rozdíl v zárodečných a somatických buňkách - z diploidních zárodečných linií vznikají haploidní gamety (vajíčka a spermie) - somatické buňky jsou diploidní – somatické mutace se přenáší v rámci organismu - somatické mutace se nepřenáší na potomstvo ̶U většiny rostlin jsou buňky totipotentní ̶U zvířat tuto vlastnost nesou pouze kmenové buňky Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells in Medicine and Research Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 10 Somatické mutace C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-11.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 11 Kvasinky a Houby ̶Houby jsou tradičně používány v biotechnologii – Penicillium roqueforti (Roquefort), P. candidum, caseicolum a camembertri (Camembert), Aspergillus oryzae (sojová omáčka), Penicillium notatum (Penicilin), Aspergillus niger (k. citronová) ̶Obvykle kultivovány v bioreaktorech ̶Kvasinky mají výhody bakterií i eukaryot ̶Nejpoužívanější kvasinkou je Saccharomyces cerevisiae ̶Genom kvasinek je oddělen jadernou membránou ̶S. cerevisiae má 16 chromosómu obsahujcích telomery a centromery ̶Některé kvasinky mají extrachromozolální elementy, tzv. 2.micron circle. ̶ ̶ Bioreactor - Wikipedia Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 12 Kvasinky C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-12.jpg ̶Kvasinky se množí pučením ̶Pučení vytváří identické buňky – dělení mitózou ̶Kvasinky mají diploidní a haploidní fáze v rámci životního cyklu ̶Za kritických podmínek kvasinky podstupují meiózu – tvorba haploidních spor, tzv. askospor v asku) ̶Za příznivých podmínek spory klíčí a vzájemně konjugují za tvorby diploidních buněk ̶U kvasinek může dojít ke konjugaci pouze mezi dvěma různými pářícími typy (a, a) ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-14.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 13 Pichia pastoris Pichia pastoris (P. pastoris) Cell Lines - Creative Biolabs Methanol metabolism pathway in Pichia pastoris | Download Scientific Diagram Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 14 Caenorhabditis elegans (Háďátko obecné) ̶Malá nematoda (hlístice) žijící v převážně v půdě s kořenovou zeleninou ̶Má dvě pohlaví – 99.9% hermafrodit (samooplodnění) a 0.1% sameček ̶Tělo tvoří jednoduchá trubice pokrytá kutikulou ̶Uvnitř těla – 959 somatických buněk zahrnujících cca. 300 neuronů ̶Hlavička má celou řadu senzorických orgánů (chuť, čich, teplota, hmat) ̶Tělo je průsvitné = snadné použití fluorescenčních technik, generační cyklus 3 dny ̶Poprvé u něj provedena RNA interference – ideální nástroj pro reverzní genetiku ̶První známý úplný genom mnohobuněčného organismu (100 MBp) ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-15.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-16.jpg https://www.hsph.harvard.edu/mair-lab/c-elegans/ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 15 Drosophila melanogaster (octomilka) ̶Hojně požívaný organismus v genetických studiích ̶Snadné pěstování , 2-týdenní životní cyklus ̶Z vajíčka se líhne larva (24h), několik larválních stádií po dospělce ̶Dostupná celá řada mutantů – identifikace genů podílejících se na vývoji (homologie s člověkem) ̶Genom má 165 Mb – 3 páry autosomů a X/Y chromosomy ̶Během rychlého larválního vývoje vznik polyténích chromozómů ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-17.jpg Clark and Pazdernik, 2016 C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-18.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 16 Danio rerio (Dánio pruhované) ̶Jednoduchý modelový obratlovec využívaný v molekulární biologii ̶Jednoduché pěstování a množení v akváriích, dostupnost celé řady mutantů ̶Embryonální vývoj mimo tělo matky, vývoj z jedné buňky po jedince trvá 24 hodin ̶Embryo je průsvitné – snadné sledování efektu mutací na vývoj ̶Genom obsahuje 25 párů chromozómů (1700 Mb), 70% genů kódujících proteiny u člověka má ortology u Dánia ̶Model studia celá řady lidských onemocnění ̶Embrya jsou často používána pro skríning nových léčiv ̶ ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-19.jpg https://theconversation.com/animals-in-research-zebrafish-13804 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 17 Arabidopsis thaliana (Huseníček rolní) ̶Nejpoužívanější modelový organismus v rostlinné genetice a molekulární biologii ̶Podobná odpověď na stresové faktory a choroby jako hospodářské plodiny ̶Mnoho genů zodpovědných za vývoj a množení je shodných s hospodářskými plodinami ̶Snadné pěstování, nenáročnost na prostor, generační doba 6-10 týdnů, mnoho semen ̶Může být udržována v haploidním stavu ̶Malý genom – pět chromosomů (125 Mb), 25 000 genů - rýže (430 Mb), 40 – 50 tis. genů - pšenice (17 Gb), rajče (950 Mb), tabák (4.5 Gb) Arabidopsis Plant [image] | EurekAlert! Science News Epigenetic mutant strains of Arabidopsis thaliana | Okinawa Institute of Science and Technology Graduate University OIST Cell & Plant Physiology Laboratory - Arabidopsis thaliana cultures in agar media Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 18 Viry ̶Entity na hraně definice života, patogeny napadající hostitelské buňky ̶Skládají se z proteinové obálky nazývané kapsida obalující DNA/RNA genom ̶Nachází se u všech živých organismů (bakterie, rostliny, živočichové) ̶Bakteriální viry = bakteriofágy (fágy) - přichycení na hostitele - vstup virového genomu - replikace virového genomu - výroba nových virových proteinů - složení nové virové částice - uvolnění virionů z hostitele ̶Mnoho virů prochází latentní fází – lysogenie u bakterií ̶Často dochází k integraci voru do genomu hostitele – tvorba proviru (profágu) C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-23.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Modelové organismy 19 Viry ̶Můžeme rozdělit na základě tvaru kapsidy (sférické, komplexní, vláknité) ̶Komplexní = bakteriofágy (T4, P1, Mu) ̶ssRNA viry mají pozitivní (+) nebo negativní (-) genom ̶Retroviry obsahují reverzní transkriptázu (přepis RNA do DNA), pomocí long terminal repeats (LTRs) se integrují do genomu ̶ ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-24.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f01-25.jpg Clark and Pazdernik, 2016