Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Replikace a syntéza DNA: Replikace DNA u eukaryot a prokaryot, opravné procesy, in-vitro syntéza DNA (PCR, reverzní transkripce). Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 2 Replikace DNA ̶Zachování integrity organismu vyžaduje kompletní identickou replikaci genomu ̶Rozvinutí dvoušroubovice, tvorba Y-replikační vidlice ̶Začíná na chromosomu ve specifickém místě označovaném ori (origin of replication) ̶ori místo obvykle obsahuje vysoký podíl AT bazí ̶Komplementární řetězec je syntetizován komplexem faktorů a enzymů nazývaných replizom ̶DNA polymeráza syntetizuje pouze ve směru 5´ → 3´ - vedoucí vlákno se syntetizuje kontinuálně - spožďující se vlákno pomocí Okazakiho fragmentů - jednotlivé fragmenty na opožďujícím se vlákně jsou spojovány DNA ligázou ̶Tento způsob replikace nazýván semikonzervativní replikace C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-01.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 3 Replikace DNA ̶DNA má nad šroubovicové vinutí ̶Nutnost relaxace (gyráza) a rozvinutí dvoušroubovice DNA (helikáza) ̶Rozvinuté řetězce udržovány pomocí single-stranded binding proteins (SSB) ̶Pohyb DNA polymerázy – více pozitivního nad šroubovicového vinutí ̶Po replikaci cca. 5% bakteriálního genomu nutno odstraňovat pomocí gyrázy ̶V rámci replikace kruhových chromozómu může dojít ke katenaci sesterských kopií C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-04.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems Figure 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 4 Replikace DNA ̶Na počátku replikace RNA polymeráza nazývaná primáza nahrazuje SSB proteiny a syntetizuje krátké RNA primery (11-12 b) ̶Bakteriální chromozom je replikován převážně pomocí DNA polymerázy III ̶DNA je uzamčena do posuvné svorky pomocí vkládacího komplexu ̶Následně svorky váží hlavní enzymy pro replikaci – syntetizující a-podjednotka, korekční e-podjednotka a stabilizační q-podjednotka Figure 6 Kelch et al, 2012 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 5 Clamp loader ATPase Figure 4 Kelch et al, 2012 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 6 Core enzyme complex C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-02.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Qiang et al, 2018 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 7 Syntéza opožďujícího řetězce ̶Nese celou řadu zlomů, segmentů s RNA nebo mezer ̶DNA polymeráza I odstraňuje RNA a dosyntetizovává řetězec ̶RNA může být rovněž odstraněna RNasou H (odstraňuje RNA z heteroduplexu) ̶Výsledné fragmenty jsou spojeny DNA ligázou C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-06.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 8 Oprava chyb po replikace ̶Po dokončení replikace opravný systém opraví chyby (u E. coli MutSHL systém) ̶Při začlenění špatné báze vzniká ve dvoušroubovici výduť ̶Buňka předpokládá, že parentální báze je správná, kdy originální vlákno je identifikováno pomocí metylace ̶Po replikaci DNA je nové vlákno pomalu dometylováván pomocí DNA Adenosin (Dam) a cytosin (Dcm) methyláz ̶ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 9 Srovnání replikace - prokaryota ̶DNA replikace probíhá běžně dvousměrně – replikační vidlice postupují v opačných směrech ̶U bakterií proces replikace nazýváme tzv. theta replikací ̶Některé plazmidy a viry replikují genom procesem nazývaným replikace valivou kružnicí C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-09.jpg Adobe Systems Schema of telomerase and shelterin complex. Telomerase complex consists of the enzyme telomerase transcriptase (TERT), RNA component (TERC), and dyskerin protein complex (dyskerin, NOP10, NHP2, and GAR1). TERT adds new telomeres (TTAGGG repeats) onto the chromosome end by using the template provided by TERC. The shelterin complex consists of six proteins (TRF1, TRF2, RAP1, POT1, TPP1, and TIN2) and protects telomeres and regulates telomerase GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 10 Srovnání replikace - eukaryota ̶Eukaryota nemají ekvivalent DNA polymerázy I mající duální aktivitu (exonukleázová a polymerázová) ̶Objevuje se problém se zkracování konců lineárních chromozómů ̶No koncích chromozómů telomery (TTAGGG opakování u člověka) syntetizované na základě RNA templátu enzymem telomerázou C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-10.jpg •telomerase transcriptase (TERT) •RNA component (TERC) •dyskerin protein complex (dyskerin, NOP10, NHP2, GAR1) •shelterin complex (TRF1, TRF2, RAP1, POT1, TPP1 a TIN2) Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 11 Chemická syntéza DNA ̶H. Gobind Korana syntetizoval první aktivní tRNA molekulu o 72 nukleotidech (1970) ̶Arteficiální syntéza DNA je ve směru 3´ → 5´ - přichycení první báze na CPG (controlled pore glass) - 5´konec je zablokován pomocí DMT (dimethyloxytrityl) - DMT skupina je odstraněna pomocí slabé kyseliny (TCA) - další nukleotid je přidán ve formě tzv. phosphoramiditu aktivovaného tetrazolem - 5´- OH konce nezreagovaných nukleotidů jsou acetylovány pomocí anhydridu k. octové - opakování procesu ̶ Har Gobind Khorana Google Doodle (zleva) Har Gobind Khorana, Robert W Holley, Luis W Alvarez, Marshall W Nirenberg, Lars Onsager and Yasunari Kawabata při udílení Nobelovy ceny v roce 1968. Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 12 Chemická syntéza DNA C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-13.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-12.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-14.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 13 Chemická syntéza DNA C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-15.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-16.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-17.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 14 Polymerázová řetězová reakce K Mullis, F Faloona, S Scharf, R Saiki, G Horn, H Erlich. Specific enzymatic amplification of DNA in vitro: the polymerase chain reaction. Cold Spring Harb Symp Quant Biol;1986;51 DNA Gyaan » Dr. Kary Mullis, inventor of PCR technique, dies » C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-19.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 15 Modifikace PCR ̶Inverzní PCR ̶Použití degenerovaných bazí, zavedení restrikčních míst ̶Reverzně-transkripční PCR (RT-PCR) - 5´RACE, 3´RACE ̶PCR cílená mutageneze ̶Emulzní PCR ̶Droplet Digital PCR ̶LAMP ̶ ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-20.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-21.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f04-22.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 16 RACE PCR Rapid Amplification of cDNA Ends Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 17 PCR cílená mutageneze Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 18 Emulzní PCR Použito při NGS technologii (454, ion torrent) Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 19 Droplet digital pcr Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Replikace a syntéza DNA 20 Loop-Mediated Isothermal Amplification ̶Použití Bst polymerázy (Bacillus stearothermophilus DNA Polymerase I) ̶Probíhá isotermálně ̶Amplifikační faktor až 10E09 srovnatelný s 30 cykly PCR ̶Detekce v rámci 10-30 minut, fluorescence, kolorimetricky, turbidimetricky ̶Méně náchylná na inhibice – možno provádět přímo ze vzorku ̶ LAMP is more sensitive in the detection of cdtA than PCR amplification.... | Download Scientific Diagram