Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Základní technologie rekombinantní DNA: Základní technologie rekombinantní DNA - enzymy, vektory, metody transformace, konstrukce genových knihoven. Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 2 Restrikční enzymy ̶Bakteriální enzymy vážící se na specifickou sekvenci a štípající obě vlákna ̶Ochrana bakterií před cizí DNA (viry) ̶Jsou citlivé na metylaci DNA ̶Rozlišujeme dva základní druhy: Typ I – štípou řetězec DNA 1000 a více bazí od rozpoznávané sekvence Typ II - štípou řetězec DNA v místě rozpoznávané sekvence (tupé, ostré konce) Počet rozpoznávaných bází určuje míru fragmentace cílové DNA ̶Spojení fragmentů - ligáza (T4 ligáza) Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 3 Restrikční enzymy (struktura) Pingoud and Jeltsch, 2001 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 4 Restriction Fragment Length Polymorphism Restriction fragment length polymorphism (RFLP) and detection of alleles. Restriction enzyme digestion of DNA occurs at specific DNA sequences (m). If a polymorphism (change in DNA sequence) occurs in a restriction enzyme site near a gene of interest different sized molecules (corresponding to the alleles) will be produced that can be demonstrated on electrophoresis. Použití mis-match primerů Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 5 Fragmentáza ̶Používaná k fragmentaci DNA u NGS ̶Směs dvou enzymů (DNasa I a SD (strand-displacement) polymeráza) Ignatov et al. 2019 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 6 Klonovací vektory ̶Specializované plazmidy (jiné elementy) nesoucí cizorodou DNA za účelem studia/manipulací ̶V současné době používáme rovněž arteficiální chromosomy a viry ̶Základní vlastnosti klonovacích vektorů: - malá velikost (snadná manipulovatelnost a izolace) - snadný přenos mezi buňkami transformací - snadná izolace z hostitelského organismu - snadná detekce a selekce - výskyt ve větším počtu kopií (kontrola ori místem) - mnohočetné klonovací místo pro vložení klonované DNA - Metoda detekce přítomnosti vložené DNA ve vektoru ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-14.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 7 Klonovací vektory ̶Možnosti kontroly vložení DNA: - inserční inaktivace (gen rezistence na ATB) - ccdB gene (gen smrti interferující s aktivitou DNA gyrázy) https://link.springer.com/article/10.1007/BF00280310) - alfa komplementace (b-galaktozidáza) ̶Kvasinkové vektory založená na 2m circle - ori místo dvou organismů, Cen sekvence - selekce na základě syntézy AK C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-15.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 8 Virové vektory ̶Bakteriofágové vektory - upraveny, tak že mohou nést ne-virovou DNA v kapsidě - spojení cos sekvencí = tvorba replikační formy (RF) replikované valivou kružnicí - může být vložen insert o velikosti 37 až 52 kb - využití pomocných virů pro sbalení DNA do virových částic ̶Cosmidy - vysoce modifikovaný lambda vektor mající pouze cos místa - nutnost sbalení pomocí pomocného fága C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-17.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 9 Arteficiální chromozomy ̶Slouží pro manipulace s velkými částmi DNA (150 – 2000 kb) ̶Zahrnují: - kvasinkové arteficiální chromozomy (YACs) - bakteriální arteficiální chromozomy (BACs) - P1 bakteriofágové arteficiální chromozomy (PACs) ̶YACs obsahují centromeru a telomery pro trvalé udržení v kvasince ̶BACs jsou cirkularizovány a množeny v bakteriích (ori místo a gen rezistence) Trends in Biotechnology 2000, DOI: (10.1016/S0167-7799(00)01438-4) Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 10 Transformace DNA ̶Transformace je proces, kterým se cizí DNA zavádí do buňky. ̶Kompetentní buňky E. coli: - použití vápenatých iontů a teplotního šoku pro zvýšení permeability buněčné stěny a membrány - použití elektroporace pro otevření buněčné stěny a membrány ̶Kompetentní kvasinky: - kombinace octanu litného, jednovláknové nosné DNA a polyethylenglykolu (PEG) FAQ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 11 DNA knihovny ̶Používané pro: - nalezení nových genů - sekvenaci genomů - porovnání genů z různých organizmů ̶Základní kroky v rámci tvorby knihovny: - izolace chromozomální DNA - naštěpení DNA restrikčním enzymem - linearizace příslušného vektoru - vložení fragmentů do vektoru - transformace do E. coli C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-19.jpg Clark and Pazdernik, 2016 C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-20.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 12 Eukaryotické expresní khihovny C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-21.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-22.jpg ̶Vektor obsahuje sekvenci nutnou pro transkripci a translaci ̶Konstruovány z komplementární DNA (cDNA) ̶Identifikace nových genů, sestřihových variant Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 13 Klonovací strategie ̶TOPO klonování (Thermo) - využití topoizomerázy I - Vaccinia virus topoizomeráza I specificky rozpoznává sekvenci 5´-(C/T)CCTT-3´ - topoizomeráza je kovalentně přichycena na 3´konci vektoru Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 14 Klonovací strategie ̶TA klonování - využití vlastnosti Taq DNA polymerázy přidat na 3´konec A - pMiniT 2.0 (toxic mini-genes) (NEB) - pGEM-Teasy (modrobílá selekce) (Promega) Blue-White Screening & Protocols for Colony Selection | Sigma-Aldrich X-gal - Wikipedia Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 15 Klonovací strategie ̶GATEWAY klonovací vektory (Invitrogen-Thermo) - využití enzymů fága lambda integrázy a excisionázy - použití ENTRY a DESTINATION vektorů - LR reakce odstraňuje gen zájmu z attL míst a vkládá ho do attR míst - BP reakce odstraní gen zájmu z attR míst a vloží ho do attL míst. C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-28.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-29.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-27.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 16 Expresní vektory ̶Nejčastěji používaný promotor lacUV (upravený lac promotor) - místo pro vazby RNA polymerázy - místo pro lacI represor - místo počátku transkripce - místo ukončení transkripce ̶Další často používaný promotor je lambda left promotor (PL) - místo pro vazbu lambda represoru - nejčastější aktivace zvýšenou teplotou (42°C) ̶Expresní systémy rovněž využívají promotor vázající pouze RNA polymerázu T7 bakteriofága - kmeny E. coli nesoucí T7 RNA polymerázu po kontrolou induktoru ̶Expresní vektory často obsahují sekvence pro různé kotvy (6His, Myc, FLAG, S-tag, MBP) C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-23.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 17 Bakteriální expresní vektory C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f03-24.jpg ̶pET, prSET E. coli T7 expresní vektory - exprese v buňkách BL21(DE3)pLysS ̶pMAL expresní vektory - obsahují maltose-binding protein (MBP) Team:CIEI-BJ/Results - 2017.igem.org pMAL-pIII Vector | NEB Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Základní technologie rekombinantní DNA 18 Kvasinkové expresní vektory ̶Inducibilní AOX promotor (methanol) ̶Možnost intracelulární a extracelulární exprese ̶Exprese v kvasinkách P. pastoris a S. cerevisiae Pichia pastoris vector pPICZαA, B, C. Multiple cloning site (MCS) is flanked by S. cerevisiae α-factor secretion signal, c-myc, and 6 × HIS tags for immunological detection and purification. The TEF1 promoter and CYC1promoter are from S. cerevisiae . EM7 promoter is from E. coli. BamHI and BglII sites allow for cloning of multiple head-to-tail expression cassettes. (Reprinted with permission from Invitrogen Corporation  2006.) Team:CIEI-BJ/Results - 2017.igem.org Methanol metabolism in P. pastoris: AOX alcohol oxidase; CAT catalase;... | Download Scientific Diagram