Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Genomika a genová exprese techniky mapování genů, nekódující části genomu, bioinformatické nástroje, farmakogenetika, DNA mikroarrays, RNA-seq techniky, metagenomika, epigenetika Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 2 Rekombinantní proteiny ̶Proteomika identifikuje relevantních proteiny ̶Potřeba jejich detailního studia a charakterizace ̶V případě praktického využití potřeba produkce ve velkých objemech ̶Přes 100 rekombinantních proteinů je dnes užíváno jako terapeutika ̶Vyjma protilátek mohou být rozděleny na: - náhradu za chybějící nebo chybné proteiny - zvýšení hladiny existujícího proteinu - inhibici infekčního agens - přenášení jiných molekul ̶Exprese genů ve velkokapacitním měřítku přináší celou řadu problémů: - nestabilita více-kopiových plazmidů, cena antibiotik Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 3 Exprese v bakteriích ̶Pro zvýšení exprese se používají speciální plazmidy = expresní vektory - silný promotor, adekvátní ori místo, selekční marker pro antibiotikum ̶Exprese eukaryontních proteinů je více problematická ̶Nutná záměna promotoru, absence sestřihu, nízká míra translace - slabá interakce ribozomu s RBS místem, nestabilita mRNA, limitní množství tRNA ̶Nutnost použití speciálně upravených vektorů C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-01.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 4 Inzulín ̶První geneticky upravený (E. coli – 1979) komerčně produkovaný proteinový hormon (Eli Lilly,1982, https://www.youtube.com/watch?v=3uNsBAbpE-8). ̶Preproinsulin – Proinsulin - Insulin Diabetes Mellitus Subtypes C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-02.jpg Clark and Pazdernik, 2016 PDB-101: Global Health: Diabetes Mellitus: Drugs: Insulin: Insulin Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 5 Rekombinantní Inzulín https://www.youtube.com/watch?v=5eKdZ0dVCCo&t=606s https://www.youtube.com/watch?v=VKpthcW1llU&t=214s https://www.youtube.com/watch?v=N7vxq948l-U&t=30s ̶Epxrese obtížná vzhledem ke komplikovanému zpracování ̶E. coli nemůže preproinzulín zpracovat na inzulín ̶E. coli netvoří správně S-S vazby v cytoplazmě - možnost využití DsbC periplazmatické disulfid oxidoreduktázy ̶Nakonec využit postup dvou arteficiálních minigenů ̶ Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 6 ̶Inzulín má tendenci tvořit hexamery, které jsou neaktivní ̶Problém v rámci injekčního podání – lokálně vysoká koncentrace ̶ Rekombinantní Inzulín C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-04.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-05.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 7 Rekombinantní Inzulín ̶Uvedení „rychlého“ inzulínu (NovoLog) společností Novo - přítomnost mutace ProB28Asp ̶Později uvedení tzv. „pomalého“ inzulínu (Lantus) společností Sanofi-Aventis - přítomnost mutace AsnA21Gly + 2 x Arg na konci B-řetězce ̶ What Are The Different Types of Insulin? - Diabetes Self Caring Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 8 E. Coli OrigamiTM 2 Exprese Oncostatinu M (OSM): A (37°C), B (18°C). C-kontrola bez IPTG, I-lyzát, P-pelet, S-solubilní frakce (Nguyen et al., 2019, SciRep) ̶Nesou mutaci v gene thioredoxin reduktázy (trxB) a glutathion reduktázy (gor) ̶Zvýšení tvorby disulfidických vazeb v cytoplazmě E. coli ̶Vhodné pro proteiny vyžadující tvorbu S-S můstků pro správné složení Production of disulfide-bonded proteins in Escherichia coli - ScienceDirect Berkmen, 2012 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 9 Translační expresní vektory ̶Vytvořené pro expresi proteinů (pET, pRSET) - maximální inicializace translace - konsensní RBS místo - ATG kodón v optimální vzdálenosti 8 bazí od RBS - klonovací místo přímo v ATG kodónu (Nco I) ̶Možnost dalších komplikací v rámci skládání proteinu C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-06.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 10 Efekt kodónů ̶Exprese proteinů v jiných organismech (eukaryontní v bakteriích) ̶Různé organismy upřednostňují jiné kodóny pro danou AK - optimalizace použitých kodónů v rámci syntézy genu – až 10ti násobné zvýšení produkce - dodání tRNA nesoucí vzácné kodóny do organismu - E. coli ROSETTA – sedm tRNAs pro vzácné kodóny (AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC, and CGG) ̶ ̶ ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-07.jpg Competent Cells - Bacterial Expression | Life Science Research | Merck Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 11 Toxický efekt nadprodukce Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside - Wikipedia C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-09.jpg Laktózový operon Operon pro arabinózu Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 12 Autoindukční médium Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 13 Inkluzní tělíska ̶Špatně poskládané proteiny se hromadí v inkluzních tělíscích ̶Molekulární šaperony – napomáhají správnému sbalení ̶Možná sekrece proteinů do periplasmy nebo média ̶Proteiny lze solubilizovat z inkluzních tělísek chaotropním činidlem a zpětně poskládat ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-10.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 14 Sekrece proteinů ̶Možná exprese do periplasmy nebo média ̶Sekrece řízena hydorfobní sekvencí na N-konci štěpenou signální peptidázou - možné přidání signální sekvence k proteinu (riziko inkluzních tělísek) - možná fúze s přirozeně sekretovaným proteinem (maltóza-vázající protein v E. coli) - možná sekrece v gram-pozitivní bakterii (Bacillus) - využití speciálního sekrečního systému Typu I (sekrece hemolyzinu, E. coli) nebo Typu II (Endotixin A, Pseudomonas) - použití autotransportních proteinů Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 15 Sekrece proteinů C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-11.jpg Microorganisms 07 00594 g002 Clark and Pazdernik, 2016 Sekreční systémy typu I a II Auto-transportní proteiny Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 16 Proteinové glykosylace ̶Celá řada proteinů u vyšších organismů je glykosylovaná ̶Glykosylace je nutná pro správnou funkci – např. membránové proteiny ̶Bakterie provádí O-glykosylaci (u rodu Campylobacter objevena i N-glykosylace) ̶Eukaryotní organismy mají většinou N-glykosylace ̶Řešením pro expresi glykosylovaných proteinů jsou hmyzí buňky - jiný vzor glykosylace oproti savcům - řešením jsou upravené hmyzí buňky se savčí glykosylační drahou ̶Změna v glykosylačním vzoru může ovlivnit vlastnosti proteinu - rekombinantní lidsky erytropoetin obsahuje extra N-glykosylační místo (Asn-Xxx-Ser/Thr) - nižší afinita k receptoru, avšak delší poločas rozpadu prodlužuje celkově klinickou aktivitu ̶ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 17 Proteinové glykosylace C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-12.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 18 Exprese proteinů v eukaryotických buňkách ̶Celou řadu eukaryotických proteinů je efektivnější exprimovat v eukaryotických buňkách ̶Možnost post-ranslačních modifikací: - chemické modifikace tvořící nové aminokyseliny - tvorba disulfidických můstků - glykosylace - přidání funkčních skupin (mastné kyseliny, acetylace, fosforylace, metylace, sulfurylace) - odštěpení pre-kurzorových proteinů potřebných pro sekreci, složení a/nebo aktivaci Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 19 Kvasinky ̶Pro biotechnologii celá řada výhod: - snadná kultivace v malém i velkém měřítku - kvasinka S. cerevisiae považována za bezpečný organismus - kvasinky sekretují velmi málo vlastních proteinů – výhoda při sekreci exprimovaného proteinu - DNA může být snadno transformována (chemicky, enzymaticky, elektroporací) - charakterizace celé řady promotorů pro cílenou expresi - umí celou řadu post-translačních modifikací charakteristických pro eukaryontní organismy - glykosylace probíhá pouze u sekretovaných proteinů ̶Častá sekrece rekombinantních proteinů pomocí signální sekvence genu pro pářicí faktor a ̶Signální peptidáza rozpoznává sekvenci Lys-Arg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f10-14.jpg Clark and Pazdernik, 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Rekombinantní proteiny 20 Kvasinky ̶V současné době exprimovány v kvasince S. cerevisiae a P. pastoris: - insulin - srážecí faktor VIIIa - různé růstové faktory - virové proteiny pro výrobu vakcín nebo diagnostiky (HIV, HBV, HCV) ̶Nejčastější problémy exprese v kvasinkách: - ztráta expresních plazmidů v rámci velkoobjemových kultivací - sekretované proteiny zůstávají mezi PM a buněčnou stěnou - dochází k hyper-glykosylaci sekretovaných proteinů (řešení upravou kmenů) Sheng et al. 2017