Sekvenátor II generace –MiniSeq, MiSeq, NextSeq, HiSeq, NovaSeq



Sekvenátor II generace
Příprava DNA knihovny
Vzorek DNA – fragmentace (Covaris, fragmentáza)
Začištění konců (DNA polymeráza)
Ligace adapterů (ligáza)
Výběr fragmentů dle velkosti (SPRI)
Amplifikace fragmentů
Sekvenace (Illumina, IonTorrent)
http://content.iospress.com/media/blc/2015/1-1/blc-1-1-blc150007/blc-1-1-blc150007-g007.jpg?width=7
55

Sekvenátor II generace



Sekvenátor II generace
Sekvenace amplikonů


Sekvenátor II generace
Sekvenace probíhá v klastrech


Sekvenátor II generace
1. Krok – hybridizace templátu na průtočnou celu


2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace


2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace


2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace


Sekvenátor II generace
2. Krok – Můstková PCR


2. Krok – Můstková PCR
Sekvenátor II generace


3. Krok – Linearizace
Sekvenátor II generace


4. Krok – Odštěpení reverzního vlákna
Sekvenátor II generace


5. Krok – Blokace volného 5‘ konce
Sekvenátor II generace


6. Krok: Čtení – hybridizace sek. primeru
Sekvenátor II generace


Chemie reverzibilních terminátorů
Sekvenátor II generace


Sekvenace pomocí syntézy (SBS)
Sekvenátor II generace


Sekvenátor II generace



Sekvenátor II generace



7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace


7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace


7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace


7. Krok – Pair-End sekvenace
Sekvenátor II generace


Čtení indexů
Sekvenátor II generace


Single index čtení
Sekvenátor II generace


Dual index čtení
(iSeq, MiniSeq, NextSeq,HiSeq)
Sekvenátor II generace




Pacific Biosystems Sequel product20150910_7921_PacBio_Sequel.CR2
Sequel System
PacBio System.PacBio-RS-II-machine
PacBio RS II
Sekvenátor III generace – PacBio
http://aa314.gondor.co/site_media/media/sponsor_logos/PacBio_ShortLogo_Color.png

Sekvenátor III generace – PacBio
•Sekvenace založena na Single Molecule, Real-Time (SMRT®) technologii
•
•Vyžívá tzv. Zero-Mode Waveguides (ZMWs) umožňujcící osvícení pouze spodní části jamky, ve které je
dole imobilizována DNA polymeráza
•
•Hlavní výhoda je možnost dlouhého čtění (až 20 kb)
•
•Další výhoda je možnost přímé detekce methylovaných bazí (epigenom)
http://aa314.gondor.co/site_media/media/sponsor_logos/PacBio_ShortLogo_Color.png

Sekvenátor III generace – PacBio
http://aa314.gondor.co/site_media/media/sponsor_logos/PacBio_ShortLogo_Color.png
Příprava knihovny
http://www.gatc-biotech.com/fileadmin/Kundendaten/Upload_8.0/Newsletter/Amplicon_Illustration_PacBi
o_484px.gif [USEMAP]
https://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI

Sekvenátor III generace
Oxford Nanopores
Výsledek obrázku pro oxford nanopore minion Výsledek obrázku pro oxford nanopore minion
•Základem technologie jsou nanopóry (nanodíry)
•Na začátku sekvenace je NK navázána na nanopór tvořený proteinem
•Poté je rozpletena a prochází přes nanopór, což generuje změnu proudu
•Na základě pozorovanéí zmšny jsou odečítání v reálním čase jednotlivé báze
•Umožňuje sekvenaci velmi dlouhých úšeku (desítky až stovky kilobází)
•Nevýhodou je vyšší chybovost, správnost >90%