Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Technologie založené na RNA 1 GENOVÉ TECHNOLOGIE Technologie založené na RNA rozdělení RNA, význam ne-kódujících RNA, antisense RNA a umlčování genů, ribozymy Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 2 Role nekódujících RNA ̶RNA hrají celou řadu rolí, které jsou široce využívané v biotechnologiích ̶Nejvíce pochopenou rolí je jejich účast na syntéze proteinů (mRNA, tRNA, rRNA) ̶Celá řada malých RNA hraje roli v sestřihu mRNA (snRNA, snoRNA, gRNA) ̶Ribozymy mají enzymatickou aktivitu – štěpení a ligace celé řady substrátů ̶V posledních letech popsána celá řada nových rolí (ncRNAs) ̶Některé třídy RNA regulují úroveň translace (antisense RNA) – vazba na komplementární mRNA ̶RNA hrají rovněž důležitou roli v obraně před RNA viry (RNAi) ̶Bakterie postrádají RNAi – mají CRISPR systém využívající crRNA ̶ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 3 Role nekódujících RNA Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 4 Role nekódujících RNA C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-01.jpg https://www.youtube.com/watch?v=2NS0jBPurWQ Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 5 Xist umlčení X-chromozómu Fig 5 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 6 Piwi- interagující RNA (piRNA) ̶24-30 nukleotidů dlouhé ̶monofosfátová skupina na 5´konci (U) a 2´O-methylová skupina na 3´konci ̶Kódovány v genomu v rámci klastrů nebo intronů jiných genů ̶Sekvence komplementární k endogením transpozónům ̶Jsou rozpoznávány rodinou Argonaut proteinů, štěpený na malé kousky vázající se na komplementární RNA transpozónů = štěpení zabraňující jejich posunu C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-02.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 7 lncRNA (long non-coding) Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 8 CRISPR ̶Hlavní ochranný systém před RNA vity i prokaryot ̶Nenachází se u eukaryot, pouze u prokaryot a archaea ̶Chrání před RNA i DNA viry, cizími plazmidy nebo transpozony ̶Je založen na paměťové stopě ve formě krátkých DNA sekvencí uložených mezi palindromickými repeticemi ̶CAS proteiny tvoří RNasy i Dnasy – velmi variabilní mezi bakteriemi ̶ Image Bhaya et al. 2016 Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 9 RNA ovlivňuje transkrpci ̶Genová exprese je modulována rovněž RNA ̶U bakterií se sRNA váží na mRNA a brání transkripci, některé ji naopak aktivují, některé se váží na proteiny (TFs) ̶U euakryot zabraňují translaci nebo spouští degradaci mRNA microRNA (antisense mechanismus) ̶V lidském genomu přibližně 20-40% protein kódujících genů mám antisense partnery (promotor, introny, exony, 3´UTR) ̶Antisense geny: - cis = vedle nebo uvnitř vlastního genu - trans = jiná lokace v rámci genomu ̶ ̶ C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-04.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 10 Antisense mechanismy Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 11 PTEN pseudogen ̶PTEN (phosphatase and tensin homolog) ̶Tumor-supresorový gen, jehož transkripce koreluje se závažností rakoviny ̶V rámci genomu přítomnost PTEN pseudogenu = tvorba tří ne-kódujících RNA C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-06.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 12 Použití antisense RNA ̶Dvě možné metody produkce: - chemická syntéza - klonování antisense RNA v opačném směru do vektoru = možná kontrola exprese ̶Tvorba sekundárních struktur může vést ke ztrátě funkčnosti Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 13 Modifikace syntetických oligonukleotidů ̶Zavádění chemických modifikací bazí pro zvýšení stability ̶Použití různých strategií: - fosfor-thio oligonukleotid (rezistentní k degradaci DNasou) - morpholin-antisense nukeotid (rezistentní k DNase a RNase H) - přidání O-alkylu na 2´OH skupinu ribózy (rezistentní k DNase a RNase H) - použití PNAs (rezistentní k DNase a RNase H) - použití chimérických oligonukletidů (rezistentní k DNase) C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-08.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-09.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 14 Antisense terapie ̶Dostání oligonukleotidů do buňky vyžaduje speciální přístupy ̶Existuje přirozený neznámý mechanismus vstupu oligonukleotidů do buňky = malá efektivita ̶Možné použití několika technik: - použití liposomů (neutrální, kladně nabité) - kationické polymery (poly-L-lysinem polyethylenimin) - přichycení na bazické peptidy (Tat protein, HA2 podjednotka viry chřipky) - použití streptolysinu O = tvorba pórů - mikroinjekce přímo do buňku - seškrábnutí buněk (poškození membrány) C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-10.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 15 RNA interference ̶RNA interference (RNAi) – dráha pro genovou regulaci, kde je krátký dvouřetězcový úsek RNA stimuluje enzymatickým komplex degradující mRNA ̶RNAi je popsán u savců, rostlin, hub, červů, hmyzu ̶RNAi rovněž zabraňuje přesunu transpozonů a je to ochrana před viry u rostlin ̶RNAi má dvě stádia: - iniciační fáze = tvorba zkrácené dsRNA z virové dsRNA, gDNA, aberantního transkriptu = štěpení endonukleasou Dicer (RNasa z rodiny III, 21-23 nukleotidů) na siRNAs - efektorová fáze = přenos siRNA na RISC (RNA-induce silensing complex) a tvorba ssRNA = po rozpoznání cílové sekvence vazba proteinu z Argonaut (AGO) rodiny = štěpení mRNA ̶Zesílení celého procesu pomocí RNA-dependentní RNA polymerázy (RdRP) – méně než 50 kopí siRNA vede k úplné degradaci cílové mRNA Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 16 RNA interference C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-12.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-13.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-14.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 17 Technologie RNAi u háďátka C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-16.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-17.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-18.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 18 Modulace genové exprese ̶MicroRNAs (miRNAs) mohou modulovat genovou expresi ̶Popsáno prvně v rámci vývoje háďátka ̶miRNAs regulují genovou expresi blokací translace ̶miRNAs jsou dnes popsány u rostlin i člověka ̶miRNAs blokují začátek translace nebo se váží na 3´UTR oblasti ̶Prvně dochází k tvorbě prekurzorové pri-miRNAs (cca. 70 nukleotidů) ̶Endonukleáza Drosha štěpí pri-microRNA na pre-miRNAs ̶Enzym Dicer rozpoznává stem-loop strukturu a odštěpuje smyčku ̶RISC komplex separuje řetězce od sebe C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-15.jpg Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 19 Riboswithes C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-22.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-23.jpg Ribozyme Riboswith B. subtilis Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 20 Ribozymy ̶RNA molekuly vázající se na specifické místo a katalyzující enzymatickou reakci ̶Některé jsou asociované s proteiny ̶V současné době popsáno osm základních tříd ̶Velké ribozymy (stovky-3000 bp): - samosestřižné introny skupiny I Tetrahymeny (nálevník) - mitochondrie, chloroplasty, viry, jaderné rRNA geny) - samosestřižné introny skupiny II (mitochondrie, chloroplasty, řasy) – nesestřihují se in-vitro - Rnasa P u bakterií – asociace s proteinem, štěpení 5´konce pre-tRNA molekul ̶Malé ribozymy (30-80 nukleotidů): - hammerhead a hairpin ribozymy (viroidy, virusoidy a satelitní viry) Why is Tetrahymena thermophila used as a model organism? - Quora Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 21 Ribozymy C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-25.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-26.jpg Schematic structure of RNase P in E. coli. (a) Bacterial P RNA... | Download Scientific Diagram Adobe Systems GENOVÉ TECHNOLOGIE – Genomika a genová exprese 22 Ribozymy C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-27.jpg C:\Users\zameer\Desktop\Clark\PPT Creation\eps - 800x800\\f05-29.jpg Hammerhead (Viroidy) Hairpin ribozym