Využití kapilární elektroforézy při studiu enzymů Zdeněk Glatz Frederic Reuss (1807) Katoforéza Elektroforéza (1909) Leonor Michaelis http://www.bioinfo.org.cn/book/biochemistry/chapt08/212-2.jpg http://plantphys.info/plant_physiology/images/enzmichaelis.gif Volná elektroforéza (1925) + + - - A+B C B+C A+B+C A+B+C A mA > mB >mC Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Volná elektroforéza Arne Tiselius (1902 –1971) Nobelova cena1948 http://home.comcast.net/~tm01001/Stamps/sweden_1478.jpg Zónová elektroforéza (1939) + + A+B+C A B C - - mA > mB >mC Skylab Skylab Stabilizace u uPorézní media u uKapilára u Porézní media u1939 Papír u1950 Agarový gel u1955 Škrobový gel u1957 Acetát celulosy u1959 Polyakrylamidový gel u1979 Agarosový gel Kapilární elektroforéza 1967 - Hjerten 3 mm kapilára Kapilární elektroforéza 1981 - Jorgenson Lukacsová 75 mm kapilára Beckman 1987 P/ACE™ MDQ DNA System 2003 - Projekt lidského genomu 2003 - Projekt lidského genomu Proč enzymy ? Enzymy – molekulární stroje Enzymy – molekulární stroje u 2 H2O2 O2 + 2H2O u uRychlostní konstanta : ØBez katalýzy - 0,23 s-1 ØPt - 1,3 . 103 s-1 ØEnzym - katalasa - 3,7 . 107 s-1 Enzymy – molekulární stroje figure 5-01 0 Pt Katalasa Enzymy – molekulární stroje uKatalasa u u2 H2O2 O2 + 2H2O u uČíslo přeměny 40 000 000 u u u u 1 molekula enzymu přemění 40 000 000 molekul substrátu za 1 s File:PDB 7cat EBI.jpg Escherichia coli Homo sapiens 3 000 bílkovin 25 000 bílkovin 101_0198 Enzymy – stanovení koncentrace e Koncentrace ↔ Katalytická aktivita Substrát « Produkt nBiochemie nMolekulární biologie n nKlinická diagnostika nFarmakologie – vývoj léčiv nBiotechnologické procesy nBioanalytická chemie Stanovení aktivity enzymů Metody používané pro stanovení aktivity enzymů uSpektrofotometrické uSpektrofluorimetrické uElektrochemické uRadiochemické uSeparační – HPLC, GC, CE u Enzyme Assays R.Eisenthal and M.J. Danson C:\Documents and Settings\arcturus\Dokumenty\Piešťany\0978019963820_500X500.jpg HPLC in Enzymatic Analysis E.F. Rossomando http://media.wiley.com/product_data/coverImage300/03/04711034/0471103403.jpg Proč enzymy a CE ? Výhody CE uAplikační diverzita •nabité i neutrální látky •nízkomolekulární i vysokomolekulární látky •chirální i achirální látky •bakterie i viry u u u ce-animation Výhody CE uAplikační diverzita uJednoduchá instrumentace u CZE, MEKC, CIEF, CITP NACE, MEEKC, CGE, ChCE CEC Výhody CE uAplikační diverzita uJednoduchá instrumentace uVysoké rozlišení a účinnost separací uMalá spotřeba vzorku uRychlost analýzy uMalá spotřeba chemikálií a malé množství odpadů u sejmout u u u uKapilára jako reakční prostor Výhody CE §„Pre-capillary“ §„On-capillary“ §„Post-capillary“ Studium enzymových reakcí pomocí CE HOMOGENNÍ Studium enzymových reakcí pomocí CE §„Pre-capillary“ provedení : u - kapilára je používána pouze pro separaci a u detekci u u - nutná manipulace mezi enzymovou reakcí a u separací u u Kinetické stanovení glutathion S-transferasa Šišková, Z. et al. J. Sep. Sci., 2005, 28, 1357. „End point“ stanovení cytochrom P450 2C9 Konečný, J. et al. Electrophoresis, 2007. 28, 1229. Studium enzymových reakcí pomocí CE §„On-capillary“ provedení : u - kapilára je navíc využita i jako reakční u prostředí u u - stanovení je automatizováno – dávkování, u smísení, inkubace, separace, detekce Þ CE u u u Elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza Electrophoretically Mediated MicroAnalysis EMMA rozdílná elektroforetická mobilita enzymu a jeho substrátu(ů) pro vyvolání reakce přímo v kapiláře J. Bao, F.E. Regnier, J. Chromatogr. 608, 217 (1992). Zpět na hlavnín stranu http://www.pluska.sk/thumb/images/css/flash/emma_tit.jpg?w=81&h=108&ip=6 Emma Poster EMMA - kontinuální mód E P Detection window A Substrate filled capillary + + - - EMMA – zonální mód S E P B Detection window - + + - EMMA – zonální mód uVýhody : ØMenší spotřeba vzorků – enzym, substráty, inhibitory u ØVyhodnocování EMMA – vyhodnocení plug-plug E.S .Kwak et al., Anal. Chim. Acta 397, 183 (1999). G6PDH Glu-6P + NAD+ 6P-Glu + NADH Kontinuální mód Zonální mód B.J. Harmon et al.,J. Chromatogr. A 726, 193 (1996). t0 D v1 v2 d tcontact tmerge A B C > > vypnutí el. napětí: “zero potential amplification” EMMA – zonální mód Studium enzymových reakcí pomocí CE §„Post-capillary“ provedení : u - vzorek je nejprve separován pomocí CE, u na konci kapiláry je reaktor, kde probíhá u enzymová reakce u u - uvedenou variantu nelze použít u u komerčních CE zařízení u u u A. Emmer, J. Roeraade, Chromatographia 39 (1994) 271. Studium enzymů pomocí CE ? (pre-capillary versus on-capillary) uOff-line – pre-capillary On-line – on-capillary Thermomixer CE System Inkubace Analýza Inkubace + analýza CE System µl nl Rhodanasa (EC 2.8.1.1) CN- + S2O32- ® SCN- + SO32- Homo sapiens Detoxikace kyanidu - otravy - cigaretový kouř - glykosinoláty Brassicacceae Acidithiobacillus ferrooxidans Biohydrometalurgie Životní prostředí thiobacil Volba separačních podmínek rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity CN- + S2O32- ® SCN- + SO32- 0.1 mM TTAB - 15 mM borát pH 9.0 blízká mobilita CN-, SCN- vysoká koncentrace CN- v reakční směsi Glatz, Z. et al J. Chromatogr A, 1999, 838, 139. rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity 100 mM b-alanin - HCl, pH 3.5 nízký EOF CN- = HCN , Volba separačních podmínek CN- + S2O32- ® SCN- + SO32- Analýza standardů rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity min 1 2 3 4 5 6 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 SO 2 3 2_ SCN _ "LONG END INJECTION" Kapilára: křemenná, vnitřní průměr 75 mm, celková délka 64.5 cm, efektivní délka 56 cm Dávkování : 50 mbar/6s Separační napětí: 18 kV (negativní polarita) Teplota kapiláry: 25 ± 0,1 °C Detekce: l = 200 nm (šířka pásu 20 nm) Vzorek : 1 mM S2O32-, 1 mM SCN-, 25 mM CN- v 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) Stanovení aktivity rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity Dávkování rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity instrumentace Long-end Čárový popisek 3: Short-end Short-end „Short end“ versus „Long end injection“ rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity „Short end“ versus „Long end injection“ Stanovení aktivity rhodanasa – pre-capillary stanovení aktivity S2O32- SCN- Volba separačních parametrů Stejný pufr použit jak pro enzymovou reakci, tak pro separaci produktů Þ Þ pH optimum rhodanasy: 8.5 rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů BGE pH 8.5 – (nepokrytá kapilára, PVA – pokrytá kapilára) Nováková, S. et al. Electrophoresis,, 2002, 23, 1063. Volba separačních parametrů Separace anorganických aniontů (S2O32- , SCN-) probíhá nejlépe při nízkém pH základního elektrolytu Þ eliminace EOF Þ pH optimum rhodanasy: 8.5 rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Kombinace metody EMMA s "partial filling technique" 25 mM HEPES (pH 8,5) Základní elektrolyt 100 mM b-alanin – HCl (pH 3.5) Dávkování 1. 25 mM HEPES pufr (pH 8.5) : 50 mbar/4s 25 mM HEPES (pH 8,5) Substráty v 25 mM HEPES (pH 8,5) Rhodanasa v 25 mM HEPES (pH 8,5) + - Detekce 200 nm nástřik vzorku rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Dávkovací a separační parametry 4. 25 mM HEPES pufr (pH 8.5) : 50 mbar/4s 3. Substráty ve 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) : 50 mbar/4s 2. Rhodanasa ve 25 mM HEPES pufru (pH 8.5) : 50 mbar/4s optimum Parametr Hodnota Přesnost migračních časů (n=10) 0,23 % Přesnost ploch píků (n=10) 3,88 % Separační napětí 18 kV (negativní polarita) rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Stanovení Michaelisových konstant Km > 1/KM(S2O32-) 1/KM(CN-) Stanovení Michaelisových konstant Km KM (CN-) = 7.60 mM KM (S2O32-) = 13.02 mM rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů E•S2O3 2- S2O32- SO32- E ES CN- SCN- rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů Br- S2O32- SCN- bez inhibitoru s inhibitorem Inhibice rhodanasy 2-oxoglutarátem (inhibitor přidán do zóny substrátů) Nováková, S. et al J. Chromatogr. A, 2003, 990, 189. rhodanasa – EMMA stanovení kinet. parametrů E•S2O3 2- S2O32- SO32- E ES CN- SCN- 2-OG ES • 2-OG cyanohydrin 2-OG KI (mM) inhibice S2O32 1.40 akompetitivní CN- 3.62 x 10-1 kompetitivní Diagnostika typu inhibice Haloalkandehalogenasa (EC 3.8.1.5) RX + H2O ® ROH + X- + H+ •Odbourávání halogenovaných derivátů uhlovodíků • •Enantioselektivní organické syntézy Volba separačních podmínek haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení 100 mM b-alanin - HCl, pH 3.5 UV 200 nm Separační napětí 18 kV (hegativní polarita) RBr + H2O ® ROH + Br- + H+ Glatz, Z., et al. J. Chromatogr. A, 2000, 895, 219. Volba separačních podmínek haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení Nepřímá detekce RCl + H2O ® ROH + Cl- + H+ ? Nepřímá detekce haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení 5 mM chroman 0.5 mM TTAB pH 8.5 Nepřímá detekce – 315 nm / 375 nm Separační napětí 15 kV (negativní polarita) Stanovení aktivity substrát 1-brombutan haloalkandehalogenasa – pre-capillary stanovení Přímá detekce Nepřímá detekce Základní elektrolyt 20 mM b-alanin - HCl, pH 3.5 - přímá detekce separační napětí 29,9 kV (negativní polarita) nebo 10 mM chroman 0.1 mM CTAB pH 9.2 - nepřímá detekce separační napětí 18 kV (negativní polarita) haloalkandehalogenasa – EMMA Dávkovací a separační parametry Dávkování 1. 20 mM glycinátový pufr (pH 8.6) : 50 mbar/4s 4. 20 mM glycinátový pufr (pH 8.6) : 50 mbar/4s 3. Substrát ve 20 mM glycinátovém pufru pufru (pH 8.6) : 50 mbar/4s 2. Enzym ve 20 mM glycinátovém pufru (pH 8.6) : 50 mbar/4s Telnarová, M. et al. Electrophoresis, 2004, 25, 290. Stanovení Michaelisovy konstanty Km substrát 1-brombutan haloalkandehalogenasa – EMMA Přímá detekce Nepřímá detekce Stanovení Michaelisovy konstanty Km substrát 1-brombutan haloalkandehalogenasa – EMMA Přímá detekce Nepřímá detekce KM = 0,17 mM KM = 0,59 mM Stanovení inhibiční konstanty Ki substrát 1-brombutan; inhibitor 1,2-dichloethan haloalkandehalogenasa – EMMA Telnarová, M. et al. Electrophoresis, 2004, 25, 1028. haloalkandehalogenasa – EMMA Přímá detekce Nepřímá detekce KI = 0,63 mM KI = 0,44 mM Stanovení inhibiční konstanty Ki substrát 1-brombutan; inhibitor 1,2-dichloethan „Pre-capillary“ enzymové stanovení stanovení aktivity uVysoká účinnost uVysoké rozlišení uRychlost analýzy u u u Studium kinetiky dvousubstrátové enzymové reakce (60 experimentů) * spotřeba vzorku enzymu – 20 µl !! * doba studie – 3 hodiny SE !! (10 hodin LE) „On-capillary“ enzymové stanovení studium kinetiky uVysoká účinnost uVysoké rozlišení uRychlost analýzy uAutomatizace uMalá množství vzorku u u EMMA současně jako předseparační metoda ? Sulfotransferasa (EC 2.8.2.1) Øcytosolická - biotransformace/detoxikace xenobiotik (II fáze) Ømembránově vázaná - sulfatace glykoproteinů Ø > Reakce Velmi silný inhibitor reakce KI = 0.4 mM Velmi nestabilní 80 % (20 % PAP) sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů 274 nm ~1 mg 4900 Kč Vytisková, S. et al. J. Chromatogr. A, 2004, 1032, 319. sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Předseparace PAP od PAPS – MEKC (cholát) Standard Migrační čas (s) Mobilita (cm2V-1s-1) Rychlost (cm s-1) PAP 246 -3.90 x 10-4 -0.106 PAPS 339 -4.03 x 10-4 -0.130 Separační odmínky: BGE: 150 mM HEPES, pH 6.5 + 20 mM kyselina cholová Kapilára: LT=31.2 cm (LE = 21cm), 75mm I.D. Napětí: + 10 kV Teplota kapiláry: 37 °C Detekce: 260 nm Dávkování: 0.3 psi/ 5 s 1mM PAP nebo 115 mM PAPS Světlý svislý PAPS Krok Zóna Tlak pi (psi) Čas (s) Napětí (kV) 1. Dávkování PAPS PAPS 0.5 5 / 2. Předseparace od PAPS / / 60 15 3. Dávkování S 4-NP 0.3 5 / 4. Dávkování E SULT1A1 0.3 5 / 5. Smísení a enzymová reakce / / 60 5 6. Inkubace / / 120 0 7. Separace / / 300 10 sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů Dávkování a inkubace E PAPS + PAP Světlý svislý PAP S + - detekce nástřik vzorku P Stanovení Michaelisovy konstanty pro 4-nitrofenol sulfotransferasa – EMMA stanovení aktivity a kinetických parametrů 0.1 µM pNP 0.2 µM pNP 0.3 µM pNP 0.5 µM pNP 1 µM pNP 1.5 µM pNP 2.5 µM pNP KM = 0.8 mM Stanovení substrátů metodou EMMA ? stanovení kyanidu metodou EMMA po enzymatické konverzi na thiokyanatan CN- + S2O32- ® SCN- + SO32- 20 mM S2O3- v 25 mM HEPES (pH 8,5) 20 mM S2O3- v 25 mM HEPES (pH 8,5) Vzorek CN- Rhodanasa a 20 mM S2O3- v 25 mMHEPES (pH 8,5) detekce nástřik vzorku Papežová, K. et al. J. Chromatogr. A, 2006, 1120, 268. Dávkování a inkubace stanovení kyanidu metodou EMMA po enzymatické konverzi na thiokyanatan Vzorek lysatu erythrocytů (LOD 3 µM) stanovení kyanidu metodou EMMA po enzymatické konverzi na thiokyanatan Využití metody EMMA v proteomice ? Vzorek 2D Elfo 1D, 2D HPLC, CE, HPLC-CE, CE-HPLC Tryptické štěpení MS/MS Zeisbergerová, M. et al. Electrophoresis, 2009, 30, 2378. integrace „on-line“ tryptického štěpení do CE Separační napětí 18 kV (negativní polarita) 25 mM Tris-HCl (pH 8,5) Trypsin ve 25 mM Tris HCl (pH 8,5) Protein ve 25 mM Tris HCl (pH 8,5) Detekce 200 nm nástřik vzorku 25 mM Tris-HCl (pH 8,5) Trypsin ve 25 mM Tris HCl (pH 8,5) Dávkovací a separační parametry Základní elektrolyt 0,1 M fosfátový pufr pH 2,5 nebo 0,1 M mravenčanový pufr pH 2,5 integrace „on-line“ tryptického štěpení do CE Optimalizace β-kasein, cytochrom c Teplota kapiláry 35 oC Množství trypsinu 0,1 mg/ml „Zero potential amplification“ 0 s integrace „on-line“ tryptického štěpení do CE cytochrom c off-line štěpení – 12 hodin + 1 hodina analýzy on-line štěpení – 1 hodina včetně analýzy EMMA – využití Ø Enzymové systémy • Aktivita enzymů • Koncentrace substrátů a inhibitorů • Michaelisovy a inhibiční konstanty Ø Neenzymové systémy • GSH, HCys, Cys, DTT • Ca(II) • Gentamycin a kanamycin • Kreatin • Cr(VI) a Co(II) Využití metody CE při studiu metabolismu léčiv http://miro.ifsc.usp.br/pkdb/img/home/06.jpg Vývoj nového léčiva - LADME Vývoj nového léčiva Cytochromy P450 (CYP) RH + O2 + NADPH ® ROH + NADP+ + H2O Homo sapiens 50 různých CYP izoforem podíl na metabolismu 80 % známých léčiv Jaterní plátky, hepatocyty, mikrosomy, rekombinantní enzymy promývání mezi analýzami - dynamické pokrytí kapiláry!!! BGE – Detektor – Roztok enzymu Roztok substrátu Reakční směs Produkt reakce – 1 0,5 x u EMMA – CYP3A4 + dextrometorfan HLM CYP3A4 EMMA – CYP3A4 + dextrometorfan Zeisbergerová, M. et al. Electrophoresis, 2009, 30, 2378. Míchání difuzí V. Okhonin, X. Liu, S.N. Krylov, Anal. Chem. 77 (2005) 5925. TDLFP = Transverse diffusion of laminar flow profiles1 Míchání difuzí TDLFP = Transverse diffusion of laminar flow profiles1 R. Řemínek, M. Zeisbergerová, M. Langmajerová, Z. Glatz, Electrophoresis, 34 (2013) 2705. Míchání difuzí – CYP2C9 + diclofenac BGE – Detektor – Roztok enzymu Roztok substrátu Reakční směs Produkt reakce – 1 0,5 x R. Řemínek, M. Zeisbergerová, M. Langmajerová, Z. Glatz, Electrophoresis, 34 (2013) 2705. Míchání difuzí – CYP2C9 + diclofenac Km = 2,66 ± 0,18 μM; Vmax = 7,91 ± 0,22 nmol/min/nmol; n = 1,59 ± 0,16; IC50 = 0,94 ± 0,04 μM ; Ki = 0,39 ± 0,07 μM Míchání difuzí – CYP2C9 + diclofenac Kombinace TDLFP s MS detekcí Langmajerová, et al. Electrophoresis, v tisku. Chiralita – chirální separace ? pomocí CE Thalidomid Thalidomid thalidomide thalidomid2 Chirální separace Cyklodextriny Ketamin anestetikum a analgetikum v humánní a veterinární medicíně http://i.imgur.com/ISibs.png CYP3A4, CYP2B6, CYP2C9 TDLFP ketaminu 50 mM TRIS-fosfátový pufr (pH 2.5) obsahující 3 % (w/v) vysoce sulfatovaný γ-cyclodextrin KM (µM) Vmax (nmol/min/nmol) 74.22 ± 5.75 15.66 ± 0.52 79.54 ± 8.49 10.13 ± 0.48 62.91 ± 8.02 8.18 ± 0.40 66.45 ± 6.62 7.47 ± 0.31 Kinetická studie Řemínek, R. et al. Electrophoresis, v tisku. Inhibiční studie EMMA versus TDLFP uEMMA + homogenní reakční směs u - nutné optimalizovat u u uTDLFP + universálnost u - homogenita ??? u u u u uEnzymový reaktor uIMER Studium enzymových reakcí pomocí CE HETEROGENNÍ IMER uVyšší stabilita enzymu u uMožnost kombinace se separačními metodami – HPLC, CE u uVýhodnější poměr substrát/enzym → vyšší citlivost, selektivita, reprodukovatelnost atd. u uMožnost opakovaného použití u CYP 2CD IMER Schejbal, J. et al. Electrophoresis, v tisku. Studium enzymových reakcí pomocí CE EMMA TDLFP IMER Příspěvek Čechů k separačním metodám Příspěvek Čechů k separačním metodám Vám děkuji za pozornost!