1
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Jan Preisler
Oddělení analytické chemie Ústavu chemie, 312A14, PřF UKB MU
tel.: 54949 6629, preisler@chemi.muni.cz
Kurs C7895 poskytne základy hmotnostní spektrometrie: přehled ionizačních
metod, hmotnostních analyzátorů, vybraných technik a aplikací. Důraz bude
kladen na hmotnostní spektrometrii biologických látek (ionizační metody
MALDI, ESI), moderní instrumentaci v hmotnostní spektrometrii (TOF,
iontové a orbitální pasti) a nejnovější vývoj v oboru.
Plán přednášek
Přednášky se konají online v úterý 10:00-11:50, případné změny budou
ohlášeny předem.
Plán přednášek „Sylabus C7895 MSBio 2020.pdf“, učební materiál „MS Bio
CZ 2020.pdf“ a „MS Bio ENG 2018.pdf“ jsou k dispozici na
http://bart.chemi.muni.cz/index.php/cs/teaching
Učební materiál je pouze osnovou k probírané látce. Doporučuji si jej
tisknout postupně předem a doplňovat do něj poznámky na přednášce.
Učební materiál i sylabus mohou být průběžně aktualizovány.
Doplňkové učebnice:
• http://holcapek.upce.cz/vyuka-ms-org-anal.php
• Chem. Listy 114, 126−132 (2020)
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 2
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Obsah
I. Úvod
II. Ionizační metody a metody zavádění vzorku
III. Hmotnostní analyzátory
IV. Biologické aplikace MS
V. Otázky
3
Úvod do hmotnostní spektrometrie. Stručná historie hmotnostní
spektrometrie: přehled metod a instrumentace. Základní koncepty MS
(rozlišení, citlivost).
Ionizační metody a metody zavádění vzorku: Elektronová ionizace (EI)
1
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
I. Úvod
• Zdroje informací o hmotnostní spektrometrii
• Stručná historie hmotnostní spektrometrie, přehled metod a
instrumentace
• Základní koncepty hmotnostní spektrometrie
5
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Studijní materiál
Poznámky z přednášek
Materiály použité při přednášce lze stáhnout z informačního systému nebo
http:\\bart.chemi.muni.cz
a používat při přednášce.
Neexistuje souhrnná česká učebnice nebo skripta moderní hmotností
spektrometrie se zaměřením na analýzu biomolekul.
Školy hmotnostní spektrometrie a HPLC-MS.
Doplňková literatura
• Robert J. Cotter: Time-of-Flight Mass Spectrometry - Instrumentation and
Applications in Biological Research, American Chemical Society, 1997.
• Richard B. Cole et al.: Electrospray Ionization Mass Spectrometry Fundamentals,
Instrumentation & Applications, John Wiley & Sons, Inc.,
1997.
6
1
2
3
4
5
6
2
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další zdroje informací
Internet
Učebnice http://www.ms-textbook.com/ nebo
http://www.spectroscopynow.com/Spy/basehtml/SpyH/1,1181,4-14-9-0-0-
education_dets-0-68,00.html
Souborný zdroj informací www.spectroscopynow.com
Protein Prospector prospector.ucsf.edu
Komerční společnosti, např. http://www.matrixscience.com/
atd. atd.
Specializované časopisy
International Journal of Mass Spectrometry
Journal of Mass Spectrometry
Journal of the American Society for Mass Spectrometry
Mass Spectrometry Reviews
Rapid Communications in Mass Spectrometry
7
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ionizační metody a metody zavádění vzorku
Doutnavý výboj (GD)
Elektronová ionizace (EI)
Chemická ionizace (CI)
Indukčně vázané plazma (ICP)
Ionizace rychlými atomy (FAB)
Ionizace (SIMS)
Thermosprej (TSI)
Ionsprej (IS)
Elektrosprej (ESI)
Plazmová Desorpce (PD)
Laserová Desorpce (LD)
Laserová desorpce za účasti matrice (MALDI)
Spojení separace a hmotnostní spektrometrie (on-line, off-line, čipy).
8
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní spektrometry
Základy iontové optiky. Simulace pohybu iontů, Simion
Energetické analyzátory
Magnetický sektor
Kvadrupólový analyzátor
Iontový cyklotron (ICR-FT-MS)
Iontová past (IT)
Time-of-flight hmotnostní spektrometr (TOFMS)
Nové hmotnostní spektrometry: Orbitrap, TOF-TOF, LIFT-TOF.
Tandemová hmotnostní spektrometrie (MS/MS, MSn)
Kolizně indukovaná disociace (CID)
Povrchově indukovaná disociace (SID)
Fragmentace ve zdroji (ISF) a mimo zdroj (PSD).
Principy vakuové techniky
Detektory a detekční elektronika
Chromatografie - MS (on-line, off-line, in-line MS)
9
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Aplikace MS
Analýza biologických látek:
• Proteiny, mapování peptidů, peptidové databáze, nové metody (ICAT)
• Analýza peptidů (disulfidové můstky, post-translační modifikace)
• Nukleové kyseliny
• Sacharidy
Analýza syntetických polymerů
A další...
10
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Stručná historie hmotnostní spektrometrie
1803 Daltonova atomová teorie
“hmota se skádá z atomů; všechny
atomy maji stejnou hmotu”
… ne tak docela: izotopy
Důkaz izotopů:
- spektroskopie: nepatrný posun čar
... vyžaduje kvalitní přístroj
- MS: snadné stanovení
11
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Doutnavý výboj jako iontový zdroj
1880’s Crookes: doutnavý výboj
H2 + H2
+ → (H2
+)* + H2
(H2)* → H2 + 4 h
vrstva iontu
------
++
++++p ~ 0.2 Pa
viditelný negativní výboj+ U
~ 700 V DC
I ~ 1 mA
o
12
7
8
9
10
11
12
3
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
První hmotnostní spektrometr
1911 J. J. Thomson: Parabola MS (Phil Mag. 1911, 21, 225)
“Paprsky pozitivní elektřiny” 1913
Doutnavý výboj v Ne při 1 Torr, dutá katoda, magnet
+
Ne
dutákatoda
fotografickádeska
magnet
selektrodami
-
vakuová
pumpa
doutnavý
výboj v Ne,
1 Torr
-
+
13
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fotografická deska jako detektor: čáry 20Ne a 22Ne na fotografické desce
První hmotnostní spektrometr
20Ne+22Ne+
14
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Magnetický sektor s energetickým analyzátorem
1919 F. W. Aston: Mass Spectrograph (Phil. Mag. 1919, 38, 209)
Magnetický sektor s energetickým analyzátorem
Většina přírodních izotopů stanovena do r. 1930
Nobelova cena za projev v r. 1934: “MS mrtva, vše hotovo …”
(+)
(+)
(-)
extrakce
a fokusace
(-)
+ + +
+ + +
+ + +
B
r = f(m/z)
selekce
kinetické
energie
štèrbina
analýza
hmotnosti
zdroj
detekce
15
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Stručná historie MS ve zbytku 20. stol.
1940 C. Berry: Elektronová ionizace (Electron Impact, EI)
Struktura organických sloučenin
1950-70 MS používáno ke strukturní analýze organických sloučenin
1980+ Analýza těžkých a velmi těžkých molekul díky novým ionizačním
metodám: FAB, PD, ESI a MALDI
Dnes MS pro kvalitativní, strukturní i kvantitativní analýzu
Široká škála komerčních hmotnostních spektrometrů
MS nezbytná pro analýzu organických a biologických molekul
16
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Základní koncepty hmotnostní spektrometrie
Hmotnostní spektrometr
přístroj, který z analyzované látky produkuje ionty a stanovuje jejich
hmotnost, přesněji poměr hmotnosti a náboje
Součásti spektrometru
1. Komora s iontovým zdrojem (zařízení na zavádění vzorku, iontová
optika)
2. Hmotnostní analyzátor (iontová optika, magnet, detektor)
3. Vakuové pumpy (nízké, vysoké a ultra vysoké vakuum)
4. Řídící a vyhodnocovací elektronika, software
17
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní spektrum
Iontový signál vs. m/z
Iontový signál
proud, často převeden na napětí, libovolné jednotky
normalizace signálu: intenzita nejvyššího píku = 100%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Int.
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
Mass/Charge
normalizace iontového signálu
18
13
14
15
16
17
18
4
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní spektrum
Hmotnost, m
a.m.u., u, Da (Dalton), počet atomových hmotnostních jednotek
číselně rovný molární hmotnosti
m/z - účinná hmotnost, Th (Thomson)
Počet nábojů, z
počet elementárních nábojů iontu
obvykle ±1
výjimky, např. elektrosprej: |z| >> 1
Ionty: pozitivní a negativní, ne kationty a anionty.
Hmotnostní spektrometrie, ne spektroskopie.
19
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vybrané veličiny v hmotnostní spektrometrii
Hmotnostní rozlišení
Míra separace dvou přilehlých píků.
Dvě definice:
1. FWHM (full width at half maximum), R = m/m
2. Max. hmotnost, při které lze ještě rozlišit píky s jednotkovým rozdílem
hmotností.
Energie iontu
• Joule, J
• elektronvolt, eV
atomy misto molů ... elektronVolty místo Joulů. 1 eV = 1.6 x 10-19 J
jednoduchost: urychlovací napětí = 100 V, náboj = 1 ... E = 100 eV
vhodné pro srovnání s energií ionizační, vazebnou, s energií fotonu atd.
Tlak, p
1 atm = 760 Torr = 101 325 Pa = 1,01325 bar = 14,70 PSI
20
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Použité zkratky
m hmotnost molekuly (u, a.m.u., Da)
z počet náboj; (-)
m/z účinná hmotnost (Th, Thomson), slang: hmotnost, hmota
e elementární náboj (1.6x10-19C)
U napětí (V)
E intenzita elektrického pole (V/m, N/C)
W energie, práce (eV, J)
v rychlost iontu (m/s)
r poloměr zakřivení (m)
L dráha (m)
l střední volná dráha molekuly
t čas, doba (s)
s srážkový průměr (m)
s2 srážkový průřez (m2)
m redukovaná hmotnost (a.m.u., Da, kg)
21
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Použité zkratky
n číselná koncentrace (m-3)
I proud (A), tok (m-2)
T teplota (K)
p tlak (Pa, Torr)
R rozlišení (-)
f frekvence (Hz)
w úhlová frekvence (rad/s, s-1)
a znak přímé úměry
LD detekční limit, též LOD, limit of detection (obvykle mol, g, M)
S/N poměr signálu k šumu (signal-to-noise ratio)
RSD relativní směrodatná odchylka (relative standard deviation)
22
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Izotopové paterny organických molekul
Izotopy uhlíku: 99% 12C, 1% 13C
Patern jako funkce počtu uhlíkových atomů v molekule:
C: 99% 12C 1% 13C
C2: 98% 12C12C 2% 12C13C 0.01% 13C13C
C3: 97% 12C12C12C 3% 12C12C13C 0.04% 12C13C13C 10-4 % 13C13C13C
Binomická řada
Relativní výskyt lehkého izotopu, a
Relativní výskyt těžkého izotopu, b
Počet atomů, n
Např. pro n = 2: (a+b)2 = a2 + 2ab + b2
Monoizotopická molekula obsahuje dané atomy ve formě jediného izotopu
(u org. molekul obvykle atomy C - pouze izotopy 12C)
23
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Izotopové paterny organických molekul
Relativní výskyt molekul v %:
C60: 12C60 100
12C59
13C 66
12C58
13C2 21
12C57
13C3 4.6
C100: 12C100 100
12C99
13C 110
12C98
13C2 60
12C97
13C3 22
(normalizováno na výskyt monoizotopické molekuly /pouze 12C/ = 100 %)
Se stoupajícím n přestává být monoizotopická forma dominantní a intenzity
různých forem jsou porovnatelné (široká obálka) ... viz příklad dále.
24
19
20
21
22
23
24
5
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Praktický dopad výskytu izotopů
- Snížení citlivosti
- Nutnost vysokého R při vysoké m/z pro správné stanovení m/z
+ Použití izotopových vnitřních standardů
Příklad:
5 peptidů/proteinů s poměrem zastoupení prvků
C : H : N : O : S = 30 : 45 : 6 : 6 : S
R = 20 000
C30H45N6O6S C60H90N12O12S2
C90H135N18O18S3 C180H270N36O36S6 ... navíc ukázán pro ruzná R
C270H405N54O54S9 C360H540N272 O272S12
C900H1350N180O180S30 C1800H2700N360O360S60
25
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
616 617 618 619 620 621 622 623 624 625
Mass/Charge
Molecular formula: C30H45N6O6S Resolution: 20000 at 50%
617.3
618.3
619.3
620.3 621.3 622.3 623.3
26
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
1234 1236 1238 1240
Mass/Charge
Molecular formula: C60H90N12O12S2 Resolution: 20000 at 50%
1234.6
1235.6
1236.6
1237.6
1239.6
27
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
1852 1854 1856 1858
Mass/Charge
Molecular formula: C90H135N18O18S3 Resolution: 20000 at 50%
1852.9
1851.9
1853.9
1854.9
1855.9
1857.9
28
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
3704 3706 3708 3710 3712 3714
Mass/Charge
Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 20000 at 50%
3705.9
3704.9
3707.9
3708.9
3703.9
3709.9
3710.9
3712.9
29
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
5555 5560 5565 5570
Mass/Charge
Molecular formula: C270H405N54O54S9 Resolution: 20000 at 50%
5559.8
5560.8
5557.8
5561.8
5562.85556.8
5563.8
5564.85555.8
5566.8 5569.8
30
25
26
27
28
29
30
6
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
13405 13410 13415 13420 13425
Mass/Charge
Molecular formula: C360H540N272O272S12 Resolution: 20000 at 50%
13414.4
13412.4
13416.4
13411.3
13417.4
13410.3 13418.4
13419.4
13409.3
13420.4
13408.3
13422.4
31
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
18520 18530 18540
Mass/Charge
Molecular formula: C900H1350N180O180S30 Resolution: 20000 at 50%
18533.4
18535.418530.4
18536.4
18529.4
18537.5
18528.3
18538.5
18527.3
18539.5
18526.3
18541.5
18524.2
18544.6
32
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
37050 37060 37070 37080
Mass/Charge
Molecular formula: C1800H2700N360O360S60 Resolution: 20000 at 50%
37066.0
m/z ~ 12
33
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
3695 3700 3705 3710 3715 3720
Mass/Charge
Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 500 at 50%
3706.6
m/z ~ 9
34
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
3695 3700 3705 3710 3715 3720
Mass/Charge
Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 2500 at 50%
3706.2
m/z ~ 4.5
35
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
3695 3700 3705 3710 3715 3720
Mass/Charge
Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 5000 at 50%
3705.9
3704.8
3707.9
3708.9
3703.8
3709.9
3711.0
3714.0 3718.0
36
31
32
33
34
35
36
7
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0
20
40
60
80
100
%Int.
3695 3700 3705 3710 3715 3720
Mass/Charge
Molecular formula: C180H270N36O36S6 Resolution: 10000 at 50%
3705.9
3704.9
3707.9
3708.9
3703.9
3709.9
3710.9
3713.9 3717.9
37
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vícenásobně nabité ionty
• Typický příklad: vícenásobně nabité ionty [M+zH]z+ z elektrospreje
"Obálka" ve tvaru zvonu.
• Mezery nejsou ekvidistantní (narozdíl od izotopového paternu).
Př.:
m = 10 000 Da
z 4 5 6 7 8 9 10
m/z 2501 2001 1668 1429 1251 1112 1001
m/z
S
38
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Co můžete říci o tomto spektru?
Pozn: Jedná se o část hmotnostního spektra jediné organické sloučeniny.
Hodnoty m/z byly určeny s tolerancí ~ 0.1.
m/z
S
1000.0
1000.3 1000.7
1001.0
39
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
II. Ionizační techniky a zavádění vzorku
vzorek (atm. tlak) → vzorek (vakuum)
Nežádoucí jevy
• nárust tlaku v iontovém zdroji
• ochlazování a mrznutí vzorku v důsledku vypařování
• adsorpce látek ze vzduchu (např. vody) na stěny iontového zdroje
Rozdělení vzorků podle skupenství
• Tekuté vzorky
plynné vzorky
kapalné vzorky (kapalný analyt, rozpuštěný analyt)
• Tuhé vzorky
těkavé (lehké sloučeniny)
netěkavé (polární, polymerní látky)
40
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zavádění vzorků
Off-line
On-line
In-line
Počet zaváděných vzorků
• 1 vzorek
• Více vzorků
• sériově (diskrétní vzorky nebo spojitý tok)
• paralelně
sonda
ventil
ventil atmosferický tlak
iontový zdroj
(vakuum)
vzorek
těsnění
k pumpě
z
z
sonda
ventil
ventil atmosferický tlak
iontový zdroj
(vakuum)
vzorek
těsnění
k pumpě
z
o
sonda
ventil
ventil atmosferický tlak
iontový zdroj
(vakuum)
vzorek
těsnění
k pumpě
z
o
sonda
ventil
ventil atmosferický tlak
iontový zdroj
(vakuum)
vzorek
těsnění
k pumpě
o
41
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Elektronová ionizace, EI (Electron impact)
Klasická ionizační technika.
Elektrony emitované ze žhavého vlákna jsou urychleny středně velkým
napětím.
Energie elektronu, E(e-) = urychlovací napětí x náboj (1).
Typická energie: 70 eV.
+15 V
-55 V
e-
ABC+
komora
žhavené
vlákno
×
přívod plynu ABC ve směru kolmém
k svazku elektronù (×)
42
37
38
39
40
41
42
8
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mechanismus EI
Interakce elektronu s molekulou analytu ABC:
e- (rychlý) + ABC → ABC+ + 2 e- (pomalé)
Výsledná rovnice,
ABC → ABC+ + eje
charakterizována ionizační energií ABC, H(ABC).
Ionty ABC+ s přebytkem energie se mohou dále rozpadnout:
(ABC+)* → AB+ + C, A + CB+ atd.
Stupeň fragmentace závisí na energii elektronů, E(e-) a na struktuře
analytu:
a) E(e-) ~ ionizační potenciál  tvorba molekulárních iontů.
Ionizační potenciál jednoduchých organických molekul ~10 – 12 eV.
b) E(e-) >> ionizační potenciál  fragmentace.
Typ fragmentace záleží na struktuře analytu; sloučeniny s podobnou
strukturou mají podobná fragmentační spektra.
Interpretace spekter. Knihovny spekter (> 100 000 spekter).
43
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mechanismus EI
Prahová energie, AE (appearance energy) při níž se objeví dané
fragmenty, nemusí být větší než H(ABC)!
ABC → ABC+ + e- Ionizační energie ABC, H(ABC)
ABC → AB+ + C + e- Prahová energie AB+, AE(AB+)
AE(AB+) = H(ABC) + D(ABC+) Dissociační energie ABC+, D(ABC+)
Absorpce elektronů při průchodu plynem ionizované látky
Úbytek proudu elektronů, dI při průchodu infinitesimálně tenkou vrstvičkou
analytu:
dI = -acIdx,
po integraci:
I = Io e-acx.
I proud elektronů (A)
c koncentrace molekul ABC, (cm-3) (c = p/RT)
x tloušťka vrstvy (cm)
a průřez (cm2) … analogie koeficientu e v Lambert-Beerově zákonu
44
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Chemická ionizace (CI). Doutnavý výboj. Indukčně vázané
plazma (ICP). Ionizace rychlými atomy (FAB). Ionizace
(SIMS). Fotoionizace (PI). Plazmová Desorpce (PD)
2
45
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Chemická ionizace (CI)
20. léta 20. století A. J. Dempster
Tentýž iontový zdroj jako pro EI plus reaktivní plyn
Reaktivní plyn (RH)
CH4, butan, H2, NH3 atd.
p(ABC) < 10-4 Pa
p(RH) ~ 0.1 Pa (l ~ 0.05 mm, mnoho kolizí ve zdroji)
Mechanismus tvorby iontů
a) produkce RH+
e- (rychlý) + RH → RH+ + 2 e- (pomalý)
b) přenos náboje
RH+ + ABC → RH + ABC+
46
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mechanismus tvorby iontů při CI (pokr.)
c) přenos protonu (běžnější)
RH+ → R + H+ PA(R) protonová afinita
ABC + H+ → ABCH+ - PA(ABC)
RH+ + ABC → R + ABCH+ E = PA(R) - PA(ABC)
E < 0: exotermní, preferovaná reakce
E << 0: přebytek energie ABC+  fragmentace ABC+, strukturní analýza
E < 0, E → 0: ABC+ a ABCH+ převládají:
+ kvantitativní analýza
+ molekulová hmotnost ABC
+ vysoká ionizační účinnost (ABC)
- žádná informace o struktuře
47
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kolize molekul při CI
Střední volná dráha molekuly
Střední dráha, kterou urazí iont mezi 2 srážkami
l = (2ps2n )-1
l(cm) = 0.66/p(Pa) (pouze hrubý odhad)
Počet kolizí
z = ps2(8kT/(pm))1/2
m redukovaná hmotnost, m = (m1
-1 + m2
-1)-1
s kolizní průměr
s2 průřez molekuly
CI: 1015-16 kolizí, vysoká ionizační účinnost (ABC)
Porovnání CI vs EI
+ silnější signál
- vyšší šum
+ celkově vyšší poměr S/N (LOD organických látek ~ pg)
48
43
44
45
46
47
48
9
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Negativní chemická ionizace
Tentýž iontový zdroj jako pro EI plus reaktivní plyn
Mechanismus
1. Produkce termálních (pomalých) elektronů
e- (rychlý) + RH → RH+ + 2 e- (pomalý)
W(pomalý e-) ~ 3/2 kT
T ~ 400 K  E ~ 0.1 eV
2. Záchyt elektronu
ABC + e- → ABCPřednostně
u sloučenin s elektronegativními skupinami (PCB, NO3
- atd.)
LD ~ pg
49
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zavedení vzorku pro EI/CI
1.Plyn/těkavá kapalina
• Analýza zbytkových plynů ("residual gas analysis"):
otevřený iontový zdroj v komoře s plynem: p(komora) = p(plyn)
• Eluent ze separační kolony (GC-MS)
Problém: Vysoký proud plynu z klasických kolon GC
a) oddělení a sběr frakcí (split, splitter)
b) rozhraní (interface) pracující bez přerušení
i) tryskový separátor
(particle beam)
pro obohacení ABC
v nosném plynu
vyžaduje M(ABC) >> M(nosič)
... He jako nosný plyn
kolona MS
vakuová
pumpa
50
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zavedení vzorku pro EI/CI (pokr.)
ii) membránové interface - zavedení analytu přes membránu,
oddělení nosného plynu pomocí membrány
c) přímý vstup z kapilární GC kolony (nižší tok nosného plynu, He)
2. Těkavý, termálně stabilní pevný vzorek
Přímé vložení vzorku na sondě (sklo, keramika, ocel). Po vložení vzorku
do spektrometru dochází k jeho odpařování a ionizaci v plynné fázi.
51
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zavedení vzorku pro EI/CI (pokr.)
3. Netěkavé látky
- Velké molekuly
- Molekuly s mnoha polárními skupinami
… mnoho zajímavých sloučenin (proteiny, DNA, sacharidy)
a) Příprava těkavých derivátů a následná standardni ionizace (EI, CI).
Vhodné pro molekuly s M < 1000 Da.
Příklad: esterifikace, RCOOH + CH3OH → RCOOCH3
b) Použití klasické ionizace v desorpčním provedení. Vzorek nanesený na
sondě je vsunut do iontového zdroje, kde dochází k přímé interakci
elektronů se vzorkem v kondenzované formě.
c) Jiné ionizační techniky
“Měkká” ionizace: produkce molekulárních iontů aniž by došlo k jejich
tepelnému rozkladu: FAB, Elektrosprej, Laserové desorpční metody
52
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Anorganické iontové zdroje
Doutnavý výboj
Termální ionizace
Indukčně vázané plasma
Další techniky vhodné pro analýzu anorganických vzorků, např. laserová
desorpce, jsou použitelné i pro organické látky a biomolekuly a budou
zmíněny později
53
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Doutnavý výboj
První iontový zdroj (J. J. Thompson)
Analýza pevných vzorků, obvykle vodivých.
Přesná a celkem citlivá analýza: RSD ~1%, LOD ~1 ppb.
Výboj v Ar (p ~100 Pa): Ar+ vyrážejí atomy kovu M z destičky vzorku a
později je ionizují na M+.
(+)
anoda
(-)
katoda,
destička
vzorku
(-) vstup do
hmotnostního
analyzátoru
Ar
100 Pa
do MS,
0.1 Pa
54
49
50
51
52
53
54
10
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Termální ionizace (TI)
Vzorek nanesen na vlákně; vlákno odporově zahříváno.
Vypařování, atomizace a ionizace:
MX (s) → MX (g) → M (g) + X (g)
M (g) → M+ (g) + e- (vlákno)
k MS
(+) (-)
žhavené
vlákno
0.1
Pa
55
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Termální ionizace
Saha-Langmuirova rovnice
n(M+)/n(M)  exp[(W - IE)/(kT)]
Pracovní funkce kovu (vlákno), W ~ 4 eV
Kov K Ca Fe Zn
IE (eV) 4.6 6.0 7.8 9.4
(W – IE) (eV) -0.5 -1.5 -3.9 -5.4
účinné slabé
• Tři vlákna (s rozdílnou teplotou): Náhrada jednoho vlákna, které
odpařuje a ionizuje vzorek příliš rychle.
Stabilnější iontový tok (RSD pouze ~ 0.1 % !)
Užitečné pro stanovení izotopového zastoupení.
vlákno
e-
M(g)
M+(g)
56
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Indukčně vázané plazma
(Inductively Coupled Plasma, ICP)
1. Desolvatace MX (aq, aerosol)
2. Vypaření MX (s)
3. Atomizace MX (g): disociace na M(g) a X (g)
4. Ionizace na M+ (g)
aerosol
vzorku
Ar, 1L/min
radiální tok Ar,
10 L/min
plazmový
hořák
cívka
ionty
atomy
101 kPa 100 Pa 0.1 Pa
série otvorù
(differenciální pumpování)
57
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ICP
• Obvykle 3 vakuové stupně (diferenciální pumpování).
• Velmi účinná ionizace, n(M+)/n(Mtotal) = 90 – 100%.
• Ionty s jedním nábojem převládají.
• Nerovnovážný systém.
+ +
+
+
+
+
+
++
++
+++++
++
101 kPa 100 Pa
Plazma
58
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Diferenciální pumpování
101 kPa 1k Pa 100 Pa 1 Pa
pumpa 1 pumpa 2 pumpa 3
iontový
zdroj
MS
- často používaný koncept v MS
- použit u technik ionizace při atmosferickém tlaku
59
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ICP
Supersonická tryska
Žhavá plazma (5000 K) proudí dovnitř otvorem a expanduje nadzvukovou
rychlostí. Náhodný pohyb atomů na atmosferické straně je charakterizován
širokou distribucí kinetické energie (5000 K) a relativně nízkou střední
translační rychlostí. Uvnitř se atomy pohybují nadzvukovými rychlostmi s
velmi úzkou energetickou distribucí … supersonické ochlazení (~300 K).
Distribuce je později narušena srážkami s okolním plynem (barrel shock,
Machův disk).
Účinná ionizace
90 - 100 % většiny prvků ionizováno (velmi uniformní ionizace).
Vhodné pro stanovení izotopového zastoupení (nízká systematická
odchylka).
Nevýhody
• nevhodné pro určování struktury molekul
• interference
60
55
56
57
58
59
60
11
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ICP
Detekční limity
1 ppt (kvadrupól)
10 ppq (magnetický sektor)
pro srovnání: ICP-AES a AAS: ppm - ppb
ppm ppb ppt ppq
million 106 billion 109 trillion 1012 quadrillion 1015
Interference
1. Nespektrální
Posun ionizačních rovnováh v důsledku přítomnosti matrice, kyselin,
snadno ionizovatelných prvků atd.
2. Spektrální
Ionty izotopů
Izobarické molekulární ionty
61
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spektrální interference v ICP
Tvorba molekulárních iontů v ICP
1. Plyn plazmatu a jeho reakční produkty (Ar+, Ar2+, ArH+, ArO+, ArC+, ArN+
atd.)
2. Vzorek nebo solvent (hydridové ionty, OH+, ClO+, NO+, CaO+, LaO+ atd.)
3. Chemická ionizace plynů pozadí (H2O+, H3O+, CxHy
+ atd.)
Odstranění spektrálního rušení
1. Matematické korekce (např. ze známé distribuce izotopů)
2. Desolvatace aerosolu (např. vymrazení v kapalném N2)
3. Studené plazma (relativní změny ionizačního stupně)
4. Kolizní cela (termalizace iontů, posun reakčních rovnováh)
5. Spektrometr s vysokým rozlišením
62
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spektrální interference v ICP
Příklady izobarických iontů a rozlišení potřebného k jejich stanovení.
Izotop Rušící iont Rozlišení
39K 38Ar1H+ 5690
40Ca 40Ar+ 71700
41K 40Ar1H+ 4890
44Ca 14N14N16O+ 970
12C16O16O+ 1280
52Cr 40Ar12C+ 2380
56Fe 40Ar16O+ 2500
75As 40Ar35Cl+ 7770
80Se 40Ar40Ar+ 9690
Pozn.: vyšší rozlišení často znamená nižší citlivost.
63
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ionizace polem (Field Ionization, FI)
Vysoké elektrické pole mezi ostrými hroty, E > 109 V/m
Odstranění elektronu vnitřním tunelovým jevem.
64
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Desorpční ionizační techniky
LDI Laser Desorption/Ionization
1963 R. Honig
FD Field Desorption
1969 H. D. Beckey
PD Plasma Desorption
1974 R. D. MacFarlane
FAB Fast Atom Bombradment
1981 M. Barber
SIMS Secondary Ion Mass Spectrometry
1976 A. Benninghoven
MALDI Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization
1988 M. Karas & F. Hillenkamp, K. Tanaka
65
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Desorpce polem (Field Desorption, FD)
H. D. Beckey, Int. J. Mass Spectrom. Ion Phys., 1969, 2, 500-503
Vzorek je nasměrován (g) nebo nanešen (l, g) na emitor, žhavené kovové
vlákno se speciálně upraveným povrchem.
Analyty jsou tvořeny ve velmi vysokém elektrickém poli mezi ostrými hroty,
E > 109 V/m; elektrony jsou odstraněny vnitřním tunelovým efektem.
Často lze sledovat doprovodné ionizační mechanismy:
- termální ionizaci
- elektrosprej ... během nanášení kapalných vzorků
Vhodné pro analýzu organických analytů s M.W. < 2 kDa
66
61
62
63
64
65
66
12
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Field Ionization. Field Desorption
Zdroj: Bernhard Linden
probe for liquid injection, FD
surface of emitter
67
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MS sekundárních iontů
(Secondary Ion Mass Spectrometry, SIMS)
… Ionizace ionty
• Primární iontový svazek může být skenován, výsledkem je topografie
prvků vzorku, "MS image". Rozlišení vyšší než u optického skenování
(svazek primárních iontů lze lépe zaostřit, ~nm).
• Produkty … především atomy a neutrální molekuly, též ionty. Případná
postionizace možná, např. fotoionizace pomocí laseru.
• Anorganická i organická analýza, v poslední době i lehčí biopolymery za
účasti matrice, ”matrix-assisted SIMS”.
sonda
s pevným
vzorkem,
+3 kV
k MS analyzátoru
paprsek primárních
iontů, ~ 6 keV
68
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ionizace nárazem rychlých atomů
(Fast Atom Bombardment, FAB)
Ionizace podobná CI (organické molekuly, malé peptidy…).
Sestava: off-line i on-line (průtoková sonda; tzv continuous flow, CF-FAB).
Max. hmotnost ~ 10 000 Da. LOD ~ 10 pmol nebo až < 1 pmol (CF-FAB)
Obvykle z =  1.
Vzniklé ionty: ABCH+, [ABC+N2]+,[ABC+K]+,[ABC+H]-, fragmenty.
Rychlé
atomy Xe
E ~ 5 keV
(+)
(-)
Sonda s vrstvou
viskózního solventu a
analytu
(glycerol + ABC)
69
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Produkce rychlých atomů (Xe) pro FAB
1. Produkce rychlých iontů Xe+
2. Konverze Xe+ na Xe:
Xe+ (rychlý) + Xe (pomalý) → Xe (rychlý) + Xe+ (pomalý)
3. Eliminace (odklon) Xe+
zdroj
Xe
5 kV
zdroj
Xe
Xe+
rychlé
Xe, Xe+
(+)
(-)Xe+
rychlé
Xe
70
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
HK
FABMSspektrumpeptiduvnormálnímaCFmodu
Zdroj: R. Capriolli
71
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
CF-FAB MS/MS řetězce a lidského hemobloginu
HK
Zdroj: R. Capriolli
72
67
68
69
70
71
72
13
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fotoionizace (Photoionization, PI)
M + n h → M+ + eNutná
podmínka: nh > IE(M)
Typy fotoionizace
1. Jednofotonová ionizace (single photon ionization, SPI) n = 1
2. Multifotonová ionizace (multiple photon ionization, MPI) n > 1
• neselektivní analýza vhodná pro anorganické analyty
3. Rezonanční multifotonová ionizace (REMPI) n > 1
• pokud h = W (energie elektronového přechodu M)
• velmi selektivní a velmi citlivé stanovení
• aromatické molekuly, barviva, léky
73
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mechanismy fotoionizace
h h
h
h
h
e- e-
eSPI
MPI REMPI
IE(M)
74
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PI
Příklad uspořádání: LD-PI
PI jako postionizace pro laserovou desorpci
1. Puls desorpčního laseru 2. Desorpce obláčku (přev. neutralů)
3. Puls ionizačního laseru 4. Extrakce iontů
+ - + +
- + -
75
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Plazmová desorpce (PD)
1974 Ronald D. Macfarlane
(R. D. Macfarlane, R. P. Skowronski, D. F. Torgerson, Biochem. Biophys.
Res. Commun. 1974, 60, 616.; R. D. Macfarlane, D. F. Torgerson
Science 1976, 191, 920.)
• První technika použitá k ionizaci relativně velkých organických molekul
(~tisíce Da , př. inzulín, 5735 Da).
• Štěp z radioaktivního zdroje narazí do vzorku naneseného na fólii.
• Jiný štěp uvolněný z rozpadu téhož atomu 252Cf nastartuje záznam
signálu.
76
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Experimentální uspořádání PD
Zdroj: R. D. Macfarlane, R. P. Skowronski, D. F. Torgerson, "New approach
to the mass spectrometry of nonvolatile compounds", Biochem. Biophys.
Res. Commun. 60, 616-621, (1974).
77
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PD: příklad
Pozitivní PD MS ribonukleázy A z hovězí slinivky
(D. M. Bunk, R. D. Macfarlane Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1992, 89, 6215-6219)
78
73
74
75
76
77
78
14
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Charakteristika PD
• Radioaktivní zdroj kalifornia 252Cf. Energie fragmentů ~MeV.
• Tvorba molekulárních iontů, iontových klastrů a iontů s více náboji.
• Vhodné i pro těžké analyty
• Nevýhody
- radioaktivní zdroj
- zdlouhavá akumulace signálu
• Pro ionizaci těžkých analytů dnes upřednostňovány MALDI a ESI.
79
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Laserová desorpce/ionizace (LDI).
Laserová desorpce/ionizace za účasti matrice (MALDI).
Sprejové ionizace: Termosprej (TSI). Ionsprej (ISI).
Elektrosprej (ESI). Desorpční elektrosprej (DESI)
3
80
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
LDI, MALDI
Laserová desorpce/ionizace (Laser Desorption/Ionization, LDI)
S objevem laseru v 60. letech 20. století
Zpočátku anorganické (R. Honig, Appl. Phys. Lett. 1963, 2, 138-139),
později organické látky (M. A. Posthumus, P. G. Kistemaker, H. L. C.
Meuzelaar, M. C. ten Neuver de Brauw, Anal. Chem 1978, 50, 985).
Laserová desorpce/ionizace za účasti matrice (Matrix-Assisted Laser
Desorption/Ionization, MALDI)
Vhodná pro těžší analyty, polymery, biomolekuly.
Karas, M; Bachmann, D.; Bahr, U.; Hillenkamp, F. Int. J. Mass Spectrom.
Ion Proc. 1987, 78, 53 - 68.
Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T. Rapid
Commun. Mass Spectrom. 1988, 2, 151.
81
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zdroj:
www.nobel.se
October 9, 2002
ESI
MALDI
82
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
1987 Karas & Hillenkamp
melitin
kyselina nikotinová
m/z = 2845
1988 Tanaka
lysozym
Co/glycerol
m/z = 100 872 (heptamer)
83
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Schema MALDI (detail)
MALDI
Puls
laseru
Matrice
Analyt
Vrstva
vzorku
Plynná
fáze
84
79
80
81
82
83
84
15
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Schema LDI (MALDI)
laserový puls
U1 U2
(U1 > U2) pro +
sonda s tenkou
vrstvou vzorku
MS, obvykle
TOFMS
85
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip LDI a MALDI
1. Velmi krátký puls laseru, typicky t ~ ns (LDI, MALDI), max. ms.
Molekuly se odpaří dříve, než se rozloží.
Ochlazení expanzí: konverze Evib na Etrans (collisional cooling).
2. Energie je absorbována převážně matricí (M), ne analytem.
e (matrice) >> e (analytu), c(matrice) >> c(analytu)
Matrice → MH+, M+, M*, fragmenty, ionty fragmentů.
Analyt, rozptýlený v matrici, se odpařuje spolu s matricí.
3. Matrice se podílí na ionizaci analytu ABC.
Matrice je excitována po absorbci jednoho či více fotonů.
Dominantní ionizační mechanismus = přenos protonu:
MH+ + ABC → M + ABCH+.
86
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Požadavky na matrici (MALDI)
1.Absorbce při vlnové délce použitého laseru (UV, IR).
2.Tvorba žádoucích krystalů s analytem (empirie).
3.Obvykle kyselina (účinný přenos protonu na analyt).
4.Stabilní, nereagující s analytem, nepříliš těkavá.
Typy matricí
• aromatické kyseliny (Karas & Hillenkamp)
• glycerol s přídavkem jemného kobaltového prášku (Tanaka)
• modifikovaný povrch, např. Si - DIOS (Siuzdak), SELDI
87
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Běžné matrice pro MALDI
sinapinic acid (SA) gentisic acid (DHB)
(3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid) (2,5-dihydroxybenzoic acid)
a-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) 3-hydroxypicolinic acid
(HPA) (3-hydroxy-2pyridinecarboxylic
acid)
88
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Běžné matrice pro MALDI
ferulic acid dithranol (DIT)
(4-hydroxy-3-methoxycinnamic acid)
2',4',6'-trihydroxyacetophenone (THAP) 2'-6'-dihydroxyacetophenone
89
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Běžné matrice pro MALDI
nicotinic acid-N-oxide 2,-(4-hydroxy-phenlyazo)-benzoic acid
(HABA)
trans-3-indoleacrylic acid (IAA) picolinic acid (PA)
(2-pyridine carboxylic acid)
90
85
86
87
88
89
90
16
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Matrice - aplikace
peptidy < 10 000 CHCA, DHB
peptidy, proteiny > 10 000 SA, DHB
oligonukleotidy < 3 kDa THAP
nukleové kyseliny > 3 kDa HPA
syntetické polární polymery DHB
syntetické polární polymery DIT, IAA
karbohydráty DHB, CHCA, THAP
Přídavky komatricí (např. monosacharidů) – zlepšení krystalizace,
homogenity vzorku, rozlišení, potlačení fragmentace
91
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti matrice
CHCA: „horká“ matrice
peptidy < 10 000 Da
vhodná pro PSD (strukturní analýza)
DHB: „studená“ matrice
univerzální použití
92
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Lasery
UV-MALDI
337 nm dusíkový laser (nejlevnější a nejběžnější)
355 nm Nd:YAG (3xf)
266 nm Nd:YAG (4xf)
193 nm ArF ... fragmentace!
Pozn.: YAG lasery jsou dražší, ale mají delší životnost a dosahují vyšších
frekvencí (kHz vs. Hz).
IR MALDI
2.94 mm Er:YAG laser
10.6 mm CO2 laser
93
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv energie laseru
Velmi výrazná závislost spekter na energii laseru, přesněji na výkonu
vztaženém na plochu, tzv. hustotě výkonu (power density, PD).
Signál
(ABCH+)
PD
0
PDT
pracovní oblast
pokles rozlišení
fragmentace
94
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv energie laseru
Prahová hustota výkonu, PDT … výkon laseru vztažený na plochu, při
kterém se začínají objevovat píky iontů analytu ve spektru.
Při PD > PDT : Signál (ABCH+) = k.PDn, kde n = 4 – 6.
Malá změna energie vede k velké změně signálu iontu ABCH+.
V praxi obvykle běhěm měření pomalu zvyšujeme energii za současného
posouvání terčíku se vzorkem a sledujeme spektra z jednotlivých
laserových pulsů. Po zjištění prahové energie nastavíme energii asi 10–
30% nad prahovou hodnotou a akumulujeme spektra (100-1000) za
občasného posouvání terčíku.
95
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Akumulace spekter
zpravidla zaznamenáváme průměr z 100 – 1000 desorpcí
zvýšení odstupu signálu od šumu a reprodukovatelnosti
signál, S  n
šum, N  √n
signál/šum, S/N  √n
96
91
92
93
94
95
96
17
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MALDI MS spektrum
Modelové spektrum vzorku 2 peptidů, Pep1 a Pep2
[ABC+H]+, [ABC+2H]2+, dimer [(ABC)2+H]+
adukty s alkalickými kovy a matricí [ABC+Na]+, [ABC+K]+, [ABC+MH]+
fragmenty matrice a analytu, iontové klastry, např. [M2+Na]+
Potlačení matrice – v ideáním případě pouze pík analytu.
Iontový
signál
0 500 1000 1500
m/z
Na+
K+
ionty matrice,
fragmentů matrice
a analytu a aduktů
ionty
klastrů
Pep1H+
Pep2H+
Pep2Na+Pep1Na+
97
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Charakteristika MALDI
+ jedna ze dvou nejpoužívanějších metod pro biopolymery (vedle ESI)
+ měkká ionizace
+ jednoduchá spektra, většinou z = +1 nebo z = -1
+ pulsní ionizace (předurčena ke spojení s TOFMS)
+ limit detekce ~ amol (peptidy, při vhodné přípravě)
+ rychlá příprava a analýza vzorků
98
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Charakteristika MALDI
- obtížná kvantifikace (nutnost vnitřního standardu)
- hledání pravého místa na vzorku
- často intenzivní pozadí v oblasti nízkých m/z (matrice, fragmenty a
klastry matrice)
- vzájemné rušení analytů
99
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Příprava MALDI vzorků
MALDI vzorek = analyt + matrice
c(analyt) = 0.1-10 mM
c(matrice) = 1-100 mM
terčík: ocel, Al, syntetické polymery
detail
MALDI
vzorku
www.srsmaldi.com
100
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zásady při přípravě MALDI vzorků
• Rekrystalizace matrice
• Čerstvý roztok matrice
• Vhodná volba solventu (ACN, EtOH, MetOH, aceton, voda)
• pH matrice < 4 (úprava např. 0.1 % TFA)
• Analyt musí být rozpuštěný
• Purifikace analytu před MALDI analýzou
• Neznámý analyt – příprava série roztoků o různých koncentracích
• Nanesené vzorky jsou obvykle stabilní (skladování terčíků se vzorky)
• Dokonalé očištění terčíku
101
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Metody přípravy vzorků
• vysušení kapky směsného roztoku (dry droplet)
• smíchání a vysušení na terčíku (quick & dirty)
• urychlení vysoušení ve vakuu (vacuum drying)
• nejprve vrstva matrice v těkavém solventu (fast evaporation)
• vrstva matrice, pak vrstva matrice s analytem (overlayer)
• vrstvy: matrice, analyt, matrice (sandwich)
• krystaly rozdrceny, převrstveny roztokem vzorku (crushed crystals)
• rozpuštění vzorku v kapce acetonu (acetone redeposition)
• nanášení na rotující terčík (spin coating)
• pomalý růst krystalů (slow crystallization)
• nanášení elektrosprejem (electrospray deposition)
• modifikované terčíky - hydrofilní/hydrofobní rozhraní
102
97
98
99
100
101
102
18
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další metody přípravy vzorků
speciální metody (ES, nanášení ve vakuu, MALDI z aerosolu ...)
mikrometody
mikroterčíky, piezoelektrické pipetory, nanášení z kapiláry
velikost ohniska  velikost vzorku  maximální citlivost
vyšší hustota vzorků na terčíku
vzorek:
1 mm
laser:
50 mm
%.
S
S
vzorek
laser
250
1000
50
2
2
==
103
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv přítomnosti solí
MALDI spektrum vzorku peptidu v přítomnosti solí Na a K
odsolení vzorku nutné (přítomnost solí  tvorba aduktů , citlivost )
0 200 400 600 800 1000 1200
0.0
0.2
0.4
0.6
Signál
m/z
PepH+
PepNa+
PepK+
104
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Redukce vlivu solí
segregace na terčíku ... výběr vhodného krystalu pro desorpci
přídavek kyselin (TFA, HCOOH, HCl), NH4 solí
opláchnutí krystalů na terčíku
katex na terčíku
odsolení vzorku před nanesením: separace, dialýza, ZipTip (C18)
Na+ (odpad)
vzorek: peptid, Na+
H2O
peptid
(MALDI
terčík)
50% ACN1. 2. 3.
ZipTip
105
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Perspektiva MALDI
MS analýza početných sérií biologických vzorků
• peptidové mapování pro identifikací proteinů
(MALDI MS produktů enzymatického štěpení proteinů)
• peptidy, proteiny, oligonukleotidy, sacharidy
Mikrometody
Spojení se separačními technikami
• výhoda archivování vzorků na MALDI terčíku
• uvedení dostupných MS/MS spektrometrů pro MALDI
• doplňková technika k ESI (odlišná ionizační účinnost pro různé
analyty)
106
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MS analýza početných sérií biologických vzorků
1, 10, 96, 100, 384, 1536 ... vzorků/terčík
384 vzorků/terčík
107
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
m/z
500.0 1200.0 1900.0 2600.0 3300.0 4000.0
0
2.2E+4
0
20
40
60
80
100
Signal
1439.47 1639.51
1178.32
927.34 1193.37
1867.50
550.60
1567.36 1750.52
1249.36764.33555.31
2854.351419.39
2612.34
1682.50
3815.521905.46 2358.28
MALDI MS identifikace hovězího albuminu
z produktů enzymatického štěpení
Analyt: 1 pmol tryptického digestu BSA, odsoleno pomocí ZipTipC18
Matrice: 10 mg/ml CHCA v ACN/0.1% TFA : 70/30
Příprava vzorku: dried-droplet.
MS: Voyager DE-STR
108
103
104
105
106
107
108
19
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mikrometody - příklad
Ekstrom, S., Onnerfjord, P., Nilsson, J., Bengtsson, M., Laurell, T., MarkoVarga,
G. Anal. Chem. 2000, 72, 286-93
(A) úprava vzorku a
dávkování
(B) reaktor s
imobilizovaným
enzymem
(C) mikropipetor
(D) nanovialky (300 x
300 x 20 mm) na
MALDI terčíku
(E) automatizovaná
MALDI-TOF MS
109
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Srovnání LDI a MALDI
LDI MALDI
Ionizace relativně tvrdá měkká
Vzorek pouze analyt analyt v přebytku
matrice
Max. m (Da) <2 000 106
Typický analyt malé organické
molekuly, malé
peptidy, syntetické
polymery
peptidy,
proteiny,
DNA,
sacharidy, syntetické
polymery
110
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
On-line ionizační techniky
Ionizace za atmosferického tlaku
(Atmosferic Pressure Ionization, API, též sprejové ionizační metody)
Společné znaky
• Analyt: polární, často ionizovaný v roztoku.
• Vyhřívané kapiláry a jiné elementy iontového zdroje (stovky ºC)
• Přídavné elementy pro zvýšení ionizační účinnosti (svazek elektronů, el.
oblouk)
• Diferenciální pumpování
• Často po předcházející separaci ... 2D separace (MS jako druhý rozměr).
• Fáze ionizačního procesu:
1) tvorba kapek aerosolu
2) odpařování rozpouštědla
3) analýza iontů
111
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Termosprej (TSI)
• Roztok vře ve špičce kapiláry, tvoří se kapky, později suchý aerosol a
ionty MH+. Spektra podobná jako u CI, převládají molekulární ionty. Do
zdroje mohou být vloženy elektrody – přídavný výkon – vyšší účinnost
ionizace.
• Elektronegativní sloučeniny mohou tvořit negativní ionty. (Do komory
může byt vložen přídavný zdroj elektronů, aby zvýšil tvorbu negativních
iontů M-.)
• Použití těkavých pufrů - prevence zacpávání špičky kapiláry (NH4Ac).
vyhřívaná
kovová kapilára
(~ 200 ºC)
sprej
kapek
(-)
eluent z LC
nebo CE
kolony
k MS
k mechanické
pumpě (100
Pa)
112
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ionizace svazkem částic
(Particle Beam Ionization, PBI)
Typická sestava PBI pro GC a LC. (zdroj: www.micromass.co.uk )
113
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ionizace svazkem částic
(Particle Beam Ionization, PBI)
Princip
• Odvozen od “generátoru monodisperzního generátoru” aerosolu: R. C.
Willoughby, R. F. Browner, "", Anal. Chem., 56, 2626-2631, (1984)
• Velmi podobné TSI a vyhřívanému zmlžovači. Přídavný zdroj svazku
částic, obvykle He. Separátor He od iontů.
• Přídavný EI zdroj může být použit = výsledkem jsou EI spektra (s vyšším
šumem v důsledku přítomnosti iontů a molekul rozpouštědla).
Charakteristika
• Spektra podobná jako v případě TSI. Více fragmentů.
• Méně citlivý než TSI a ESI.
• Vhodný pro tepelně stálé, neiontové sloučeniny s nepříliš vysokou
hmotností.
114
109
110
111
112
113
114
20
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vyhřívaný nebulizér
• Spektra podobná CI, obvykle záchyt 1 protonu ([M+H]+).
• Nízké procento fragmentace (měkká ionizace).
• Vhodné pro střední hmotnosti (~2000 Da).
• Struktura? ... Nutno použít přídavnou kolizní celu (MS/MS).
vyhřívaný
element
Ionty extrahovány
skrz sérii otvorù
do MS
analyzátoru
plyn
plyn
LC, CE výboj
N2
(vysoušení
vzorku)
atmosferický
tlak
115
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontový sprej (Ion Spray, IS)
• Pouze pozitivní ionty proniknou přes elektrody, negativní jsou odstraněny.
• Vícenásobně nabité ionty [M+H]+, [M+2H]2+, [M+3H]3+, [M+4H]4+ atd.
• Plněné LC kolony se splitterem, mikrokolony, kapilární kolony.
Ionty
extrahovány
skrz sérii otvorů
do MS
plyn
plyn
LC, CE
vyhřívaný
element
N2
(vysoušení
vzorku)
atmosferický tlak
(-)(+)
116
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Elektrosprejová ionizace (ESI)
Electrospray, Nanoelektrospray
* Yamashita, M; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4451.
* Yamashita, M; Fenn, J. B. J. Phys. Chem. 1984, 88, 4671.
+ Wilm, M. S.; Mann, M. Int. J. Mass Spectrom. Ion Processes 1994, 136, 167.
Schema
1–5 kV
infúze, mLC, CE
jehla (křemen, pokovený
křemen, kov)
přídavná kapalina
(sheath liquid) není
nutná
atmosferický tlak vakuum
Protielektroda s otvorem,
"nozzle" (0 V)
vyhřívaná
kapilára
přídavný plyn
- není nutný
k MS
"skimmer"
100 Pa
117
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip ESI
+
-
+
+
+
-
-
-
+
+
++
+
+
+++
+++
+
+
+ ++
+++
+
+
+
+ +
-
--
-
+
+
++
++
++
++
++
++
++
++
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ -
118
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 119
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip ESI
• Tvorba Taylorova kužele vlivem elektrického pole. Koncentrace kladného
náboje v kuželi, destabilizace menisku a emise kapek s nadbytkem
kladného náboje.
• Snižování objemu a zvyšování hustoty povrchového náboje kapek díky
vypařování rozpouštědla.
• Nesymetrické štěpení nabitých kapek (Rayleighův limit stability); výchozí
kapka ztrácí ~15% náboje ale jen 2% objemu.
• Velikost kapek: mm → nm. Počet nábojů v kapce: 105 → 10. (Velikost
makromolekuly ~ nanometry.)
• Vznik iontů v plynné fázi.
• Sekundární reakce v plynné fázi.
• Transfer iontů do komory MS.
• Nedochází k výboji; výboj je nežádoucí.
120
115
116
117
118
119
120
21
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Provedení ESI
• Přídavný plyn – proud N2, vyhřívaná kapilára za otvorem: dokonalejší
desolvatace, zabránění tvorby klastrů.
• Koaxiální proud kapaliny možný (... přídavná koaxiální kapilára).
• Rozměry jehly: i.d. < 100 mm, o. d. 100 mm – 1 mm, hrot < 100 mm.
• Vzdálenost hrotu od protielektrody: 1 – 3 cm. Tok < 10 mL/min.
• Nanoelektrosprej: menší rozměry, bez přídavné koaxiální kapaliny a
nuceného pumpování, tok < 100 nL/min.
• Note: Nanospray = registrované komerční označení
121
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Provedení ESI
• Uspořádání trysky a otvoru
... oddělení iontů od balastu
- v ose (on-axis)
- mimo osu (off-axis)
- diagonální (tilted) a kolmé (orthogonal)
- Z-sprej
• Připojení el. napětí
- přes přídavnou kapalinu (sheath flow)
- kapalinový spoj (liquid junction)
- pokovený hrot kapiláry (sheathless inteface)
122
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti ESI
• Velmi “měkká” ionizace vhodná pro biomolekuly.
• Velmi vysoký limit max. hmotnosti, m ~ 106 (m/z mnohem menší).
Ionizace těžkých polymerů (i celého viru).
• Tvorba vícenásobně nabitých iontů [M+zH]z+
"Obálka" ve tvaru zvonu. Typické pro iontový sprej či elektrosprej.
Mezery nejsou ekvidistantní (narozdíl od izotopového paternu).
Př.:
m = 10 000 Da
z 4 5 6 7 8 9 10
m/z 2501 2001 1668 1429 1251 1112 1001
m/z
S
123
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Tvorba vícenásobně nabitých iontů
+ Vyšší z snižuje m/z  lze použít hmotnostní analyzátor s nižším limitem
max. hmotnosti i pro ionty o velmi vysoké hmotnosti.
+ Ke zjištění m a z stačí pouze 2 sousední píky:
(m/z)n = (m+n)/n
(m/z)n+1 = (m+n+1)/(n+1)
+ Ovlivnění náboje z ?
• pH roztoku: pH  z
pH  z, negativní náboj převládá
• b- zářič, jiný zdroj e- (záchyt e- analytem  z )
- Spektrum směsi složitější (ale může být vyhodnoceno). Jedna látka je
přítomna v několika formách a dává několik píků ve spektru ... komplexní
spektra, snížená citlivost.
- Často další píky, např. adukty [M+Na]+, [M+K]+ atd.
124
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ESI
• Aplikace elektrického pole (nozzle-skimmer)  fragmentace ve zdroji.
• K objasnění struktury - přídavná komora pro kolizní disociaci za prvním
MS.
• Signál v ESI je závislý na koncentraci analytu, c(analyt); při velmi nízkých
koncentracích je závislý na látkovém množství analytu (nanoelektrosprej).
• Signál α c(analyt) (10-7 – 10-3 M), při vyšších c se růst zpomaluje (plato).
• Nanosprej (nanospray) ... komerční název
125
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Faktory ovlivňující ESI
• Typ analytu
• Jehla, sprejovací špička (rozměry, uspořádání)
• Napětí mezi jehlou a protielektrodou
• Spotřeba roztoku (solventy, additiva, soli, iontově párovací reagenty)
• Průtok vzorku, přídavné kapaliny a sušícího plynu
• Teplota ústí kapiláry
126
121
122
123
124
125
126
22
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zásady v ESI
• Použití těkavých pufrů:
- CH3COOH
- HCOOH
- TFA (kyselina trifluoroctová)
- NH4
+ soli těkavých kyselin
• Koncentrace solí < 20 mM
• Vystříhat se použití síranů, fosfátů
• Pravoúhlý nebo Z sprej mohou částečně pomoci v případech, kde se
nelze řídit výše uvedenými zásadami.
• Pro pozitivní ionizaci pKa (elektrolyt) < pKa (analyt) – 2
• Pro negativní ionizaci pKb (elektrolyt) < pKb (analyt) – 2
• Důkladná příprava vzorku = snazší analýza
odsolení, odstranění surfaktantů a dalších příměsí
127
Přehled nejpoužívanějších API technik
• Nejpoužívanější API techniky v organické analýze: ESI, APCI a APPI
• APCI (Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
- pneumatický zmlžovač
- reagent = solvent (mobilní fáze), aditiva ... podobné CI
- energie pro uskutečnění reakce:
- elektroda pro koronový výboj před vstupním otvorem
- vyhřívaný zdroj
- nulové napětí na jehle (rozdíl oproti ESI)
• APPI (Atmospheric Pressure Photoionization)
- pneumatický zmlžovač
- UV výbojka (např. kryptonová) pro fotoionizaci
- nulové napětí na jehle (oproti ESI)
- vyhřívaný zdroj, případně další přídavné elementy
- APLI: budícím zdrojem je laser
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 128
Použití ESI, APCI a APPI
Schematické znázornění aplikačního použití
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
molekulováhmotnost
polarita
ESI
APCI
APPI
129
DESI
Desorption electrospray ionization
- elektrosprej v desorpčním provedení
- interakce s povrchem
- příklady aplikací: léčiva v tabletách
kokain na bankovkách
metabolity na pokožce
- široká skupina ambientních technik (DART, MALDESI, LAESI ...)
Z. Takáts, J. M. Wiseman, B. Gologan, R. G. Cooks Science 306, 471 (2004)
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 130
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analyzátory. Základy iontové optiky. Wienův Filtr. Energetické
analyzátory (E). Hmotnostní analyzátory. Magnetický sektor (B)4
131
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
III. Hmotnostní analyzátory
• Základy iontové optiky. Simulace pohybu iontů.
• Energetický analyzátor
• Hmotnostní analyzátory
• Detekce iontů
• Základy vakuové techniky
• Spojení separace – MS. Čipy
• Nové techniky/technologie
132
127
128
129
130
131
132
23
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Základy iontové optiky
Analogie se světelnou optikou
štěrbina štěrbina
čočka čočka
hranol, mřížka Wkin: energetický analyzátor, deflektor
m/z: hmotnostní analyzátor
zrcadlo iontové zrcadlo
optické vlákno iontový vodič
Odlišnosti od světelné optiky
vlnová délka, l kinetická energie, Wkin
hmotnost/náboj, m/z
index lomu neměnný možné ladění elektr. nebo magn. pole
časově proměnná pole během experimentu
nezávislé na intenzitě vzájemné odpuzování iontů
133
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Lorentzova a Coulombova síly
Magnetické pole o indukci B:
Fmagn. = ze ( v x B )
Coulombova síla v el. poli E:
Fel. = zeE
Celkově:
F = ze (E + v x B )
Pro jednoduchost dále pouze:
Fel. = zeE
Fmagn. = zevB
v
B
F
134
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Elementy iontové optiky
Štěrbina
 vymezení paprsku
 vymezení vs. propustnost
Deflektor
 odklonění iontů
 2 deflektory pro x, y skenování
+
+
+V
-V
135
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Čočka
(unipotenciálová, elektrostatická, einzel lens)
• analogie klasické čočky
• ohnisková vzdálenost může být změněna změnou napětí V
• vyšší iontová propustnost ve srovnání se štěrbinou
• fokální vzdálenost není funkcí m/z (pro ionty ze stejného iontového zdroje)
• ideální funkce pouze pro ionty o stejné kinetické energii - pokud je
vzájemné odpuzování iontů zanedbáno (space-charge effect)
• zobrazená čočka je jen jednou z mnoha možných sestav
+V
+
136
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontové zrcadlo (reflektor, reflektor)
Kinetická energie iontu vs. potenciální energie elektrického pole:
1) iontové zrcadlo: iont se vrací stejnou rychlostí, jakou
pronikl přes vstupní mřížku
2) energetický filtr: dostatečně rychlé ionty pronikaji druhou
mřížkou … polopropustné zrcadlo
Iontová zrcadla: s mřížkami a bez mřížek, různý průběh E
Použití: např. ke korekci počáteční energetické disperze v TOF MS.
+
+U0
vx
dvě mřížky
zeU
2
mvx

2
zeU
2
mvx

2
137
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Konstrukce iontového zrcadla se 2 stupni
mřížky: definice ekvipotencionálních rovin
prstence: elektrostatické stínění potenciálu okolí (vakuové aparatury)
potenciály prstenců a mřížek jsou definovány pomocí série rezistorů a U3
U1 ... urychlovací napětí
U3>U1(U2)
R1 R1 R1 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2
138
133
134
135
136
137
138
24
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti iontů
Vlastnosti iontu
m/z hmotnost/náboj
v rychlost (kinetická energie, W = mv2/2)
t čas
x, y, z souřadnice
a úhel (směr)
t0 čas zrodu (index0 … zrod iontu)
Vlastnosti skupin iontů
(nejčastěji o totožném m/z)
… popsány disperzemi, distribucemi v (W), x, y, z, t0, a
139
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti iontů
Př.: Distribuce počáteční rychlosti při MALDI
(Pv … pravděpodbnost výskytu molekuly o rychlosti v)
Pv
0 1000 2000 v0 (m/s)
protein
matrice
140
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Wienův rychlostní filtr
• Příčné elektrické pole mezi dvěma plochými elektrodami
• Příčné magnetické pole
• Vektor intenzity elektrického pole E je kolmý na vektor magnetické
indukce B
• Na iont půspbí opačně orientované el. a magn. síly
+
v
+ B
+V/2
-V/2
L
141
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Wienův rychlostní filtr
Pro iont letící středem filtru platí:
zeE = zevB ( )
... prolétají pouze ionty o určité rychlosti.
V případě, že všechny ionty byly urychleny napětím U, platí
… Wienův filtr lze použít k analýze hmotnosti (m/z).
B
E
v =
zeU
mv
=
2
2
U
E
eB
z
m
22
2
=
L
V
E =
142
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Energetický analyzátor; elektrostatický analyzátor
(ESA, E)
-V
+V
r
+U
+
iontový
zdroj
ESA
vstupní štěrbina
výstupní štěrbina
L
143
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Energetický analyzátor
Zrychlení: , kde .
Energie:
Poloměr zakřivení:
• Poloměr zakřivení je přímo úměrný kinetické energii iontu.
• Ve vztahu nehraje roli m/z.
• I tlustější rovnoběžné svazky iontů jsou zaostřeny.
• Zaostření může být optimalizováno v obou dimenzích, použije-li se plechů
zakřivených v obou rozměrech (i axiálně).
• Sektor – tvar výřezu z kruhu
zeE
r
mv2
= L
V
E
2
=
zeU
2
mv 2
=
E
U2
r =
144
139
140
141
142
143
144
25
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní analyzátory
Magnetický sektor (MAG, B)
Quadrupólový analyzátor (Q, q)
Iontový cyklotron (ICR-FT-MS)
Iontová past (IT)
Analyzátor doby letu, Time-of-flight (TOFMS)
145
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Magnetický sektor (MAG, B)
. . . . .
. . .
r
(+)
+
iontový
zdroj
B
vstupní
štěrbina
detektor
magnetický sektor
m2
m1
m1/z1 > m2/z2
Vektor intenzity magnetického pole B je kolmý k vektoru rychlosti iontů
proudících do sektoru z iontového zdroje.
146
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip magnetického sektoru
1.) Lorentzova síla = dostředivá síla:
2.) Kinetická energie = urychlovací energie:
r
mv
Bzev
2
=
v
eBr
z
m
=
zeU
mv
=
2
2
U
reB
z
m
2
22
=
147
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip magnetického sektoru
Způsoby skenování spektra:
• Posunem výstupní štěrbiny, r. Konst. U, B.
• Změnou U, konst. B. Problémy s nízkou extrakční účinností při nízkých
hodnotách U.
• Změnou B, konst. U. Dříve obtížné, nyní převládající řešení.
Peak switching
Skoková změna některé z proměnných. Vhodné pro monitorování
omezeného počtu druhů iontů (např. přepínáním U).
U
reB
z
m
2
22
=
148
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Tandem elektrostatický analyzátor - magnetický sektor
Přímá geometrie (Forward-geometry, ESA-MAG, EB)
1. energetický analyzátor: výběr iontů se specifickou kinetickou energií
2. magnetický sektor: hmotnostní analýza
B
MAG
-V
+V
ESA
+U
. . . .
. .
iontový
zdroj
detektor
+
149
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Tandem EB
• Disperze vlastností iontů (v, x, a) a nestabilita polí (B, U) ovlivňují kvalitu
spekter.
• Zařazení ESA před MAG řeší problém disperze rychlosti v (kinetické
energie Wkin) iontů vstupujícich do magnetického sektoru.
Praktické geometrie EB:
1. Nier-Johnsonova
90o ESA + 60o MAG
výstup stále zaostřen pro daný poloměr, r
vhodná pro skenovací spektrometry
2. Mattauch-Herzogova
31.8o ESA + 90o MAG
jedna fokální rovina pro ionty o různých hmotnostech
vhodná pro plošný detektor (fotodeska, pole)
3. Matsudova
vhodná pro kompaktní přístroje
150
145
146
147
148
149
150
26
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mattauch-Herzogova geometrie
151
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Nier-Johnsonova geometrie
152
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další kombinace E a B
Reversní geometrie (Reverse-geometry, BE)
1. magnetický sektor: hmotnostní filtr
2. energetický analyzátor: analýza iontů podle kinetické energie
MIKES (Mass-Analyzed Ion Kinetic Energy Spectrometry)
první MS/MS technika, tandemová hmotnostní spektrometrie (1973)
1. Magnetický sektor propustí ionty o určité hmotnosti.
2. Metastabilní ionty se rozpadnou v oblasti mezi magnetickým a
energetickým analyzátorem.
3. Dceřinné ionty vzniklé z rozpadu se rozdělí podle kinetické energie
v energetickém analyzátoru.
Celá řada hybridních přístrojů založených na E a B: EBE, BEB, EBEB,
BEBE ...
153
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kvadrupólový filtr (Q). Iontová past (IT). Lineární past (LT).
Iontový cyklotron (FT-ICR-MS). Orbitrap (O).
Elektrostatická past
5
154
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kvadrupólový hmotnostní filtr (Quadrupole MS, Q, q)
4 tyče hyperbolického (též kruhového, čtvercového nebo jiného) průřezu
U ... DC složka napětí
V ... AC (RF) složka napětí
w … úhlová frekvence, w = 2pf, f = 1 - 3 MHz, fázový posun 180o
U+Vcos(wt)
-U-Vcos(wt)
+
r
y
z
x
155
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kvadrupólový hmotnostní filtr
Rovina xz: těžké ionty procházejí
Rovina yz: lehké ionty procházejí
... pouze ionty o specifické m/z projdou kvadrupólovým filtrem, ostatní ionty
jsou odchýleny.
156
151
152
153
154
155
156
27
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 157
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Trajektorie iontů v kvadrupólovém filtru
xz xz
yz yz
158
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Trajektorie iontů v kvadrupólovém filtru
xz
xz
yz
yz
159
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Diagram stability
... grafická reprezentace řešení Mathieuových rovnic, které popisují pohyb
iontů v kvadrupólovém filtru.
( ) 22
8
r
z
m
eU
a
w
=
( ) 22
4
r
z
m
eV
q
w
=
konst. a/q
(konst. U/V)
a
q
m
m-1m+1
oblast
propustnosti
160
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Rozlišení
… je voleno hodnotou směrnice skenovací přímky (a/q)
161
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti kvadrupólového filtru
Zaznamenávání spektra
r a f obvykle konst., současné skenování U a V při konst. U/V.
Limit max. hmotnosti ~ 2 000.
[V, cm, MHz]
Zýšení limitu m/z : V, r, f.
Rozlišovací schopnost
řádově ~ 103
podobné pro všechny kvadrupólové analyzátory
( ) 22
0.316
max
fr
V
~
z
m
162
157
158
159
160
161
162
28
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti kvadrupólového filtru
Zvýšení rozlišení. (Rozlišení, R < 10 000, obvykle R < 2 000.)
• Pro urychlovací napětí, Uacc (směrem do kvadrupólu):
Pro danou délku kvadrupólu, l, musí být napětí Uacc dostatečně malé, aby
iont strávil v kvadrupólu desítky - stovky cyklů o frekvenci w během doby
průletu t.
• Zvýšení rozlišení též přesnější mechanickou výrobou.
2
2
z v
eUm acc
=
t
l
v =
acceU
z
m
l
t
2
2
=
163
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kvadrupólový filtr
Externí zdroj
• problémy s okrajovým polem (fringe field), nestabilní dráhy; významné %
iontů se nedostane dovnitř
• hmotnostní diskriminace - těžké ionty, které stráví delší dobu v okrajovém
poli, jsou více ovlivněny
• řešení:
- vstupní elektrostatická čočka
- vstupní RF kvadrupól (q), hexapól nebo oktapól
(pouze RF složka: a = 0, U = 0  neselektivní filtr propouštějící
všechny m/z ... iontový vodič )
Trojitý kvadrupól (QqQ)
• populární tandemový hmotnostní spektrometr pro CID
• prostřední kvadrupól (q, pouze RF složka) slouží jako kolizní cela
164
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kvadrupólová iontová past (Ion trap, IT)
1953 Wolfgang Paul (Paulova past) - téměř bez povšimnutí
1983 Finnigan - komerční přístroj (dnes nejprodávanější MS)
Schema iontové pasti Bruker, Model ESQUIRE-LC
DC: stejnosměrné napětí nebo zem
AC: stejnosměrné + střídavé napětí, U + Vcos(wt)
DC DCAC
vstupní
ionty
detektor
prstenec
víčka
z
r
165
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 167
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Diagram stability iontové pasti
( ) 22
16
r
z
m
Ue
az
w
=
( ) 22
8
r
z
m
Ve
qz
w
=
oblast stability:
ionty oscilují uvnitř pasti, jsou
"lapeny"
(storage mode)
oblast nestability:
ionty opouštějí past štěrbinami ve
víčkách
m3 > m2 > m1 (z = 1)
qz  V/(m/z) pro pohyb podél osy z (a = 0, U = 0)
Skenování: zvyšováním V jsou vypuzovány
nejprve lehčí a posléze těžší ionty
az
qz
m3 m2 m1
168
163
164
165
166
167
168
29
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontová past
• Experiment zahrnuje fáze ionizace, akumulace, sken a detekce.
• Akumulace ionů: ionty lze sbírat i během ionizačního pulsu - výsledkem
jsou velmi nízké detekční limity. Doba cyklu akumulace - detekce závisí
na požadavcích:
Vyšší citlivost … delší akumulace.
Širší rozsah m/z, vyšší m … delší sken.
Vyšší R … pomalejší sken.
• Rezonanční vypuzení (resonant ejection)
iontů o specifické m/z – přivedením přídavného RF signálu na víčka pasti.
Vytvoření "díry" v oblasti stability.
(1983, G. Stafford: “mass selective instability mode“)
• Pufrovací plyn (o nízké hmotnosti: He, 1 mTorr)
Mnohem lepší výsledky než pouze pro samotný analyt.
Srážky analytu s pufrovacím plynem vedou k lepší distribuci energie mezi
molekulami analytu. Výhodné pro spojení GC-MS.
169
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 170
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontová past
• MS/MS - past může nahradit tandem dvou spektrometrů
srážkově indukovaná (aktivovanou) disociace, většinou s He
CID, CAD: collisionally induced (activated) dissociation
• Vysoké R … v praxi řádově 103, obvykle do 5 000
• Max. hmotnost,
m/zmax řádově 103, ale i ~ 70 000 (rezonanční vypuzení)
• Miniaturizace: iontová mikropast, past na čipu (i pro kvadrupólový filtr)
+ celková velikost 1 cm
+ vhodné např. pro vesmírný výzkum
- mnohem náročnější tolerance, obtížná výroba
- horší parametry (R, m/zmax )
171
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontová past
• Iontová transmise
polovina iontů může být detegována
• Fyzická omezení
volba rozměrů, napětí a frekvence omezena.
• Maximální dynamický rozsah (106 pro 1 druh iontu) omezen:
- minimum citlivostí (i 1 iont může být detegován)
- maximum max. množstvím lapených iontů: pro vyšší množství iontů
než 106 přestává past postupně fungovat - vzájemné odpuzování
iontů. Pozor, jde o sumu iontů všech m/z !
172
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Lineární past
Lineární past neboli “2D past” vychází z kvadrupólového filtru/iontového
vodiče. Iontová past popsaná dříve je někdy označována jako “3D past”.
Ionty jsou injektovány do RF (RF-only) kvadrupólu a poté zadrženy
zvýšením potenciálu na postranních víčcích, takže oscilují v potenciálové
jámě kvadrupólu. Později jsou ionty postupně vypuzovány otvory v
tyčích nebo víčcích a detekovány.
Dva způsoby vypuzení iontů z LT:
A. Schwartz, J.C., Senko, M.W., Syka, J.E.P., J. Am. Soc. Mass Spectrom.
13 , 2002, 659.
B. Hager, J.W., Rapid Comm. Mass Spec. 16, 2000, 512.
173
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Lineární past s radiálním vypuzením
detector I
+
detector II
+
Ionty
jsou vypuzeny z LT v radiálním směru.
(Zdroj: Schwartz, J.C., Senko, M.W., Syka, J.E.P.,
J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 , 2002, 659.)
174
169
170
171
172
173
174
30
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Lineární past s axiálním vypuzením
Ionty jsou vypuzeny z LT podél osy kvadrupólu.
(Zdroj: J. C. Y. Le Blanc et al. Proteomics 3, 2004, 859-869.)
175
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Výhody 2D vs. 3D pasti
Účinnost zachycení: 50-75% (3-D: 5 % - 20%, a závisí na hmotnosti)
Účinnost extrakce: 25-50% (3-D : 20%)
Citlivost: 5-10 – násobný vzrůst
Iontová kapacita: 20 - 30 x vyšší než u 3-D
Lineární rozsah vzrostl o více než 2 řády až na 106
Rozlišení: ~10 000 při rychlosti skenu 300 a.m.u./s
Širší možností manipulací s ionty (akumulace, skeny...)
176
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Rozdíly mezi kvadrupólovým filtrem a pastmi
Kvadrupólový filtr
- nezachytává ionty
- pouze iont s jistou hodnotou m/z může projít filtrem v daném okamžiku
... skenující přístroj znamená ztrátu iontů a tím i nižší citlivost
(vyjma režimu single ion monitoring, kdy je výhodnější)
... “space charge“ jevy jsou mnohem méně výrazné, což vede k vyššímu
dynamickému rozsahu
177
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Srovnáni kvadrupólových analyzátorů
QIT QQQ LQIT
Citlivost ++ - ++
Dynamický rozsah - ++ +
Rozsah m/z - + +
MS3 ++ - ++
Neutral loss sken/Precursor sken - + +
Správnost m/z + - +
Rozlišovací schopnost + - +
178
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontový cyklotron (FT-ICR-MS)
(Fourier transform - ion cyclotron resonance - mass spectrometer)
• typ iontové pasti
• geometrie: kubická, cylindrická, hyperbolická
Past se skládá z dvou párů elektrod a dvou víček:
x
z
y
B
excitace
detekce
excitace
detekce
B
179
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
FT-ICR-MS
Ionty jsou zavedeny do pasti podél osy z (rovnoběžně s vektorem B),
lapeny v potenciálové jámě (zvýšením potenciálu na víčkách), excitovány
elektrickým polem kolmým k vektoru B a indukčně detekovány.
Pohyb iontu v magnetickém poli:
Úhlová (cyklotronová) frekvence:
r
mv
Bzev
2
=
( )z
m
Be
r
v
==w
+
+ + +
+ + +
+ + +
+ + + B
r
v+
180
175
176
177
178
179
180
31
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti FT-ICR-MS
- (supravodivý) magnet s velkou magnetickou indukcí B ~ 10 Tesla
- velmi nízký tlak, p < 10-7 Pa (UHV, ultra high vacuum)
- vysoká cena ~ 25 000 000 Kč
- omezený dynamický rozsah ~ 103, 100 až 105 iontů
+ velmi vysoká přesnost a správnost m/z, ~ ppm
+ velmi vysoké rozlišení, R ~ 106
+ multiplexová (Fellgettova) výhoda FT … všechny m/z se měří po celou
dobu  zlepšení S/N 103x, zvýšení rychlosti získávání 106x
+ vhodné k MSn, běžně n = 2 až 3, demonstrováno i n = 1
181
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fourierova transformace
... transformace signálu z časové do frekvenční (m/z) domény
Netlumený pohyb iontů o jedné m/z
Reálný signál z FT ICR MS
• Srážky s molekuly plynu a nehomogenita magnetického pole způsobují
pozvolný pokles signálu. Vyšší tlak  více srážek  nižší rozlišení.
• Lorentzovský tvar píku.
t
St
m/z
S
FT
t
m/z
S
FT
St
182
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip FT-ICR-MS
Ionizace pro FT MS
1. ionizace uvnitř: analyzátor = zdroj (např. EI, LDI)
2. externí zdroj a zavedení do cely
- iontové vodiče, kvadrupóly, elektrostatická čočka
- diferenciálně pumpované cely (iont se tvoří v první cele při vyšším
tlaku a poté je zaveden do detekční cely otvorem podél osy z)
Excitace
1. Impuls ... vysoká amplituda, krátké trvání
2. Chirp ... rychlý sken frekvencí v požadovaném intervalu frekvencí
3. SWIFT ... Stored Waveform Inverse Fourier Transform
excitační profil získaný iFT zvoleného profilu m/z
(iFT = inverzní FT, transformace z frekvenční (m/z) do časové domény)
183
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip FT-ICR-MS
Detekce
1.indukční - ionty indukují náboj v detekčních destičkách při průletu okolo:
nedestruktivní detekce (FT cyklotron)
2.destruktivní - ionty narazí do detekčních destiček (prostý cyklotron)
Záznam dat
• vyšší frekvence vzorkování  vyšší horní limit m/z.
Nyqistovo kritérium: nejvyšší detegovaná frekvence = vzorkovací
frekvence/2
• delší doba záznamu, t  vyšší rozlišení a nižší dolní limit m/z.
• Důsledek ... nutnost uchování velkého množství dat
- heterodyne, frekvenční směšovač (frekvenční posun signálu směrem
dolů umožní použít nižší vzorkovací frekvence)
184
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip FT-ICR-MS
Z-trapping
• Na víčka je vloženo napětí 1-5 V, aby ionty neopustily past ve směru osy z
– potenciálová jáma.
• V přídavném poli dochází k oscilaci iontů a rozštěpení původně jediného
pohybu na pohyb cyklotronový a magnetronový. Důsledkem jsou
komplikovanější kalibrace, posun píků a vyšší ztráta těžších iontů.
185
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
FT-ICR-MS
Rozlišení
Max. hmotnost. Ze vztahu pro střední kvadratickou rychlost termálního
pohybu,
,
který pre-excituje ionty, vyjádříme
.
V pasti s danými parametry (B, r) nemohou být uchovány ionty s hmotností
vyšší než
.
z
m
Bt
m
m
a

zeB
mkT
zeB
mv
r
2
==
m
kT
v
2
=
kT
)zeBr(
m
2
2
=
186
181
182
183
184
185
186
32
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní spektrometr budoucnosti?
... neexistuje jediné nejlepší řešení
Trendy
• Ústup magnetických sektorů
• Hybridní spektrometry
Rozšiřování moderních spektrometrů a jejich hybridů (iontové pasti,
ortogonální TOF analyzátory).
• Nové spektrometry
Elektrostatická past ”Orbitrap“
Lineární pasti kvadrupólového typu
187
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Elektrostatická orbitální past, ”Orbitrap“
A. Makarov, HD Technologies Ltd., USA, ASMS 1999
Princip
• Injektované ionty jsou lapeny v radiálním elektrostatickém poli mezi
centrální vřetenovitou elektrodou a dvěma prstenci, krouží kolem elektrody.
• Ionty zároveň oscilují podél osy elektrody a jsou indukčně detekovány.
• MS spektra jsou získána pomocí Fourierovy transformace signálu
zaznamenaného v čase; m/z je určeno z frekvence oscilací.
+
-
+
injektáž iontů
prstenec (+)
elektroda (-)
detekce
+
++
injektáž iontů
+
2 prstence (+)
centrální
elektroda
(-)
r
mv
qE
2
=
kmitavý
pohyb iontů
188
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti Orbitrapu
+ Velmi vysoké rozlišení jako u FT-ICR-MS (R = 50 000 – 500 000).
+ Velmi vysoká přesnost a správnost … jako u FT-ICR-MS.
+ Nepotřebuje magnet.
+ Nepotřebuje RF generátory.
- Vyžaduje velmi nízké tlaky … jako FT-ICR-MS.
- Náročná injektáž iontů do orbitrapu.
V současnosti velmi rychle se rozšiřující spektrometr, existuje několik
variant ve spojení s kvadrupólovými analyzátory
189
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Lineární elektrostatická past
Detekovaná frekvence = f(m/z)
Benner, Anal. Chem. 1997, 69, 4162-4168
Elektrody pastiDetekční trubice
pohybující se elektrony
indukují proud
190
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Time-of-flight hmotnostní spektrometr (TOF MS). Metody zvýšení
rozlišení TOF MS (reflektor, zpožděná a ortogonální extrakce)
6
191
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analyzátor doby letu (Time-of-flight MS, TOFMS)
Princip: m/z vypočten z doby letu iontů
1. Pulzni tvorba iontů
2. Urychlení iontů
Stejná urychlovací energie pro všechny ionty W(el.)
W(el.) = W(kin.)
3. Drift (let) iontů: separace iontů podle m/z
W(kin.) = mv2/2
4. Záznam iontového signálu v čase, I(t)
5. Stanovení m/z doby letu: transformace I(t)  I(m/z)
192
187
188
189
190
191
192
33
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Historie TOFMS
1946 princip TOF
W. E. Stephens, Phys. Rev., 1946, 69, 691
1948 první TOF spektrometr (ion velocitron)
A. E. Cameron, D. F. Eggers, Rev. Sci. Instrum. 1948, 19, 605
1955 iontový zdroj se 2 stupni
Wiley, W. C.; McLaren, I. H.; Rev. Sci. Instrum., 1955, 26, 1150
1973 iontové zrcadlo
B. A. Mamyrin, V. I. Karataev, D. V. Schmikk, and V. A. Zagulin, Sov.
Phys. JETP 1973, 37, 45
1995 pulsní extrakce („time-lag focusing“ v praxi)
Whittal, R. M.; Li, L., Anal. Chem. 1995, 67, 1950-1954
Brown, R. S.; Lennon, J. J., Anal Chem. 1995, 67, 1998-2003
Vestal, M. L.; Juhasz, P.; Martin, S. A, Rapid Commun. Mass Spectrom.
1995, 9,1044-1050
193
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Geometrie TOFMS
Lineární geometrie
... nejjednodušší sestava
(+)
iontový zdroj:
pulsní e- svazek,
laserový puls
odpuzovací
elektroda
(repeller)
~20 kV
driftová zóna, E = 0 detektor
vstupní a výstupní mřížky
194
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Geometrie TOFMS
Wiley-McLarenova lineární geometrie (1955)
... nastavení extračního el. pole nezávislé na celkovém urychlovacím
napětí, optimalizace spekter
(+)
iontový zdroj:
pulsní e- svazek,
laserový puls
odpuzovací
elektroda
(repeller),
~20 kV
driftová zóna, E = 0 detektor
výstupní
mřížka,
0 V
akcelerační
mřížka, 0 V
extrakční mřížka, ~17 kV
(+)
195
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Geometrie TOFMS
TOF MS s iontovým zrcadlem (reflektorem)
... dosažení lepších parametrů spekter
... možnost strukturní analýzy (PSD)
(+)
iontový zdroj: např.
pulsní e- svazek,
laserový puls
odpuzovací
elektroda
(repeller),
~20 kV
driftová zóna
(E = 0)
mřížky
zdroje
mřížky a
elektrody
reflektoru
iontový
deflektor
reflektor,
>20 kV (+)
(-)
(+)
detektor
196
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
trubice
detektor
iontový zdroj
laser
difúzní
pumpa
mechanická
pumpa
digitální osciloskop
generátor zpoždění
řídící jednotka
vakuová jednotka
zdroj vysokého napětí
MALDI TOFMS
197
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip TOFMS
1. Pulsní ionizace (doba pulsu ~ ns): rychlé vytvoření obláčku iontů (EI, LD,
MALD, PD …)
2. Extrakce a urychlení iontů v elektrickém poli
3. Separace iontů v driftové zóně při E = 0 (field-free region, flight tube)
4. Detekce iontů, záznam signálu, transformace do m/z domény
urychlovací energie kinetická energie
délka driftové zóny
doba letu
2
mv
Uez
2
=
t
L
v =
2
2
L
t
U
z
m
e2=
t
S
(m/z)1<(m/z)2
198
193
194
195
196
197
198
34
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Princip TOFMS
Přesnější vztah zahrnuje i čas strávený v prostoru iontového zdroje a
detektoru:
napětí: Us 0 0 Ud
vzdálenosti:
tTOF = ts + tL + td
Pozn.: 1) ts, tL, td a tedy i tTOF jsou přímo úměrné (m/z)1/2
2) pro hrubý odhad tTOF: tTOF ~ tL (L >> s, d)
s L d
s
s
zeU
ms
t
2
2
= )UUU(
ze
m
U
d
t dss
d
d 4
2
++=
s
L
zeU
mL
t
2
2
=
199
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
TOF: kalibrace m/z
m/z=(2eU/L2)t2

m/z=k1(t-t0)2

t=c0+c1(m/z)1/2
t=c0+c1(m/z)1/2+c2(m/z)
t=c0+ c-1(m/z)-1/2 +c1(m/z)1/2+c2(m/z)
korekce spuštění záznamu dat
korekce poč. rychlosti iontů před extrakčním pulsem
korekce neideálního tvaru extrakčního pulsu
200
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Principiální výhody a vlastnosti TOFMS
• Teoreticky neomezený rozsah m/z
• Ideální pro pulsní ionizaci
• Fellgettova výhoda: pro každý puls zaznamenáno celé spektrum, není
třeba skenovat
• Velmi krátká doba záznamu spektra (~10-4 s)
• Vysoká propustnost iontů ... předpoklad vysoké citlivosti
• Jednoduchost
201
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontové zdroje pro TOFMS
1. Zdroj pro plynné vzorky
2. Zdroj pro tuhé vzorky (desorpce)
(+) (-)
+
e-, ionty, laser …
(+) (-)
laser, ionty, atomy …
202
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ideální zdroj iontů pro TOFMS
Všechny ionty jsou vytvořeny:
• v čase t0 (doba tvorby, t = 0)
• ve vzdálenosti x0 (x … osa letu TOFMS)
(nejlépe v jednom bodě [x0, y0, z0])
• se stejnou rychlosti vx0 (, která nemusí být nulová,) podél osy x.
(nejlépe s vy0 = 0 a vz0 = 0)
y
z
x+
zdroj detektor
203
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reálný zdroj iontů pro TOFMS
Ionty jsou charakterizovány distribucemi:
doby vzniku t0,
místa vzniku x0, y0, z0,
počáteční rychlosti v0 (energie Wkin0),
a směru pohybu a (odchylka od osy letu x).
Důsledek: snížení rozlišení, R
Wiley-McLarenův zdroj pro plynné vzorky:
nastavením napětí na střední mřížce umožňuje kompromis distribuce v a x
za účelem dosažení optimálního rozlišení
(Wiley, W. C.; McLaren, I. H.; Rev. Sci. Instrum., 1955, 26, 1150)
204
199
200
201
202
203
204
35
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Iontový zdroj (detail)
205
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti iontů
Př.: Distribuce počáteční rychlosti iontů při MALDI
(Pv … pravděpodbnost výskytu molekuly s počáteční rychlostí v0)
Pv
0 1000 2000 v0 (m/s)
analyt
matrice
laser
206
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spojení MALDI-TOF MS?
Desorpční metody (MALDI, LDI) - speciální případ:
t0~ns zanedbatelné; (velmi krátký laserový puls)
x0~mm zanedbatelné; (tenká vrstva, malé krystalky vzorku)
z0,y0~ 50 mm zanedbatelné; (zaostřený laserový paprsek)
v0 >100 m/s nejvýznamnější příčina nízkého rozlišení
a0 ~100 přispívá k dalšímu rozšíření distribuce v
Energetická distribuce (v ~ 700 m/s, v > 500 m/s) způsobí, že ionty o
stejném m/z přiletí k detektoru v různou dobu.
207
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Pulsní tvorba iontů pro TOFMS
Extrakce konstantním elektrickým polem (DC)
pulsní ionizační paprsek + konstantní extrakční pole
2a. Pulsní extrakce, zpožděná extrakce
(pulsed extraction, PE; delayed extraction, DE)
pulsní ionizační paprsek + pulsní extrakční pole
2b.o-TOFMS s pulsní extrakcí
(orthogonal extraction, kolmá extrakce)
souvislá tvorba (přívod) iontů + pulsní extrakční pole
208
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Jak zvýšit rozlišení (MALDI-TOFMS)?
1. Vysoké extrakční napětí v lineárním TOF MS.
2. Reflektor.
3. Pulsní extrakce.
209
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
1. Vysoké urychlovací napětí
Zvýšením příspěvku elektrického pole se sníží vliv disperze počáteční
rychlosti iontů analytu.
m
zeU
vv
22
0 +=
příspěvek el. polepříspěvek desorpce
zeU
2
vm
2
mv2
+=
2
0

210
205
206
207
208
209
210
36
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv urychlovacího napětí
Př.: MALDI TOF peptidu o m = 2000 Da, z = 1, v0 = 750 m/s, v0(FWHM) =
500 m/s, L = 1 m. (2 ionty: v01 = 500 m/s, v02 = 1000 m/s.)
U = 1 kV: t1 = 101.673 ms, t2 = 101.284 ms R ~ 130
U = 10 kV: t1 = 32.190 ms, t2 = 32.177 ms R ~ 1300
Pv
0 500 1000 v0 (m/s)
50%
100%
500
m/s
211
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
2. Reflektor
(reflektor, iontové zrcadlo, rTOFMS)
• Ionty 1 a 2 o stejném m/z a různých rychlostech v1 a v2: Rychlejší iont
pronikne hlouběji do iontového zrcadla a jeho dráha je delší. Za určitých
podmínek dorazí oba ionty k detektoru II současně.
• Možnost použít více reflektorů (vícenásobný odraz).
(Mamyrin, B. A.; Shmikk, D. V.; Sov. Phys. 1979, 49, 762)
U2>U1
+
(+)
deflektor
(-)
detektor II
U1
zdroj
iontové zrcadlo
detektor I2
1
212
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Konstrukce reflektoru
Lineární reflektor ... E je konstantní podél osy reflektoru
Jeden stupeň ... intenzita elektr. pole, E je konstantní v celém reflektoru
(Alikhnov)
Dva stupně ... reflektor je rozdělen na 2 zóny s různou E
(B. A. Mamyrin, V. I. Karataev, D. V. Schmikk, V. A. Zagulin, Sov. Phys.
JETP 1973, 37, 45)
Nelineární reflektor ... E se mění podél osy reflektoru
Kvadratické pole (D. R. Jardine, J. Morgan, D. S. Alderdice, P. J.
Derrick, Org. Mass Spectrom. 1992, 27, 1077)
Zakřivené pole (T. J. Cornish, R.J.Cotter, Rapid Commun. Mass
Spectrom. 1993, 7, 1037-1040)
+ dřívější patenty (Japonsko, SSSR)
213
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Konstrukce reflektoru
mřížky: definice ekvipotenciálové plochy
prstence: elektrické stínění stěn vakuového systému
potenciál na prstencích definován sérií rezistorů
U3>U1(U2)
R1 R1 R1 R1 R1 R1 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2 R2
214
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Příklad konstrukce relektoru
215
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor s jedním stupněm
...
2
2
2
3
1
2
8
1
2
2
2
1
2
2
1
2
2
0
2
00
0 +











+−−





+−+−=
as
v
a
a
s
L
a
s
as
v
a
a
s
L
a
s
a
v
tt
rr
TOF
Ur
(-)
detektor
Us
s L1 (+)
L2 Lm
reflektor
L = L1 + L2 ... driftová zóna, E=0
a ... zrychlení ve zdroji, a=qEs /m
ar ... zrychlení v reflektoru, a=qEr /m
(Moskovets, E. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2000, 14, 150-155)






++=
ra
a
s
L
a
s
t
2
2
1
2
0
tTOF = ts + tL + tr ... součet časů ve zdroji, driftové zóně a reflektoru
216
211
212
213
214
215
216
37
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor se dvěma stupni
Reflektor se 2 stupni ... reflektor je rozdělen na 2 zóny s různou E
Pro kladné ionty:
s pozitivním potenciálem na prostřední mřížce, 0 > U2 > U3
- různá uspořádání s poměry délek stupňů ~1:2, ~2:3 aj.
- použití krátkého 1. stupně s vyšší intenzitou elektr. pole umožňuje
zkrátit celkovou délku reflektoru
s negativním potenciálem na druhé mřížce:
- vytvoření prostorového zaostření v prvním stupni
- různá hloubka průniku v druhém stupni (energetické zaostření)
217
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor se dvěma stupni
tTOF = f(Wkin, U2, U3)
energetická disperze ... hlavní příčina snížení rozlišení R
Mamyrin:
Řešení a
U3
+
U2
Wkin
0),,( 32 =


UUWf
W
kin
kin
0),,( 322
2
=


UUWf
W
kin
kin
218
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor se dvěma stupni
+ Vhodné pro energetickou disperzi do ~20%.
Např. pro energetickou disperzi 5% teoretické rozlišení až ~100 000
- Pouze ionty, které proniknou do hloubi reflektoru (85-100%) jsou
zaostřeny.
- K získání spektra iontů s vyšší energetickou disperzí je třeba zaznamenat
sérii spekter pro několik hodnot potenciálu reflektoru a výsledné
spektrum složit z kusů těchto spekter.
219
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor s nelineárním polem
Cíl: tTOF pro ionty všech m/z nezávislý na jejich Wkin
V kvadratickém poli
odraz iontu  f(Wkin0)
z ... osa změny potenciálu
a ... minimum paraboly
k a C ... konstanty
f ... frekvence oscilací
(Převzato z: A. A. Makarov, E. N. Raptakis, and P. J. Derrick, Int. J. Mass
Spectrom. Ion Processes 1995, 146/147, 165.)
Caz
k
zU +−= 2
)(
2
)(
220
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor s nelineárním polem
Další prakticky využitelná pole:
osově symetrický hyperbolický potenciál
planární hyperbolický potenciál
osově symetrický hyperlogaritmický potenciál
221
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor s nelineárním polem
lineární pole
nelineární (zakřivené,
kvadratické) pole
(T. J. Cornish, R. J. Cotter “Non-linear field reflector“, US Patent 5 464 985)
222
217
218
219
220
221
222
38
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Reflektor s nelineárním polem
Zpravidla kvadratické pole nebo jeho aproximace
Tvorba nelineárního pole
pomocí nestejných rezistorů v sérii
pomocí nestejných odstupů mezi prstenci či mřížkami
+ současné zaostření iontů s širokou disperzí Wkin , jako např. produktů
rozpadu za zdrojem PSD, pro všechny m/z
- složitější kalibrace
- ideální jen pro ionty pohybující se po ose reflektoru
... v praxi omezené R
223
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Opožděné zapnutí extrakčního napětí:
1. Puls laseru (t = 0)
2. Expanze iontů při vypnutém extrakčním poli po dobu t (delay)
3. Rychlé zapnutí extrakčního pole (t = t)
(Brown, R. S.; Lennon, J. J.; Anal. Chem. 1995, 67, 1998)
3. Pulsní (zpožděná) extrakce
Pulsed (delayed) extraction, Time-lag focusing
t
V(destička, repeller)
V(mřížka)
V
15 kV
0
0
t
12 kV
224
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Pulsní (zpožděná) extrakce
repeller mřížky detektordriftová zóna
1.
t = 0:
2.
t = t :
3.
t = tof:
+
+
E = 0
E > 0
+
+
+
+
např. 12 kV 12 kV 0 kV
např. 15 kV 12 kV 0 kV
225
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ortogonální extrakce (oTOFMS)
Pulsní extrakce pro kontinuální iontové zdroje
Proud iontů analytu je extrahován pulsním extrakčním polem kolmým
(ortogonálním) k vstupnímu iontovému svazku.
Ionty mají zpravidla stejnou vx (v0~0)
Obvykle reflektor pro dosažení vyššího rozlišení
(+)
svazek iontů analytu
z kontinuálního zdroje
repeller,
pulsní
napětí, U1
driftová zóna, E = 0 detektor
výstupní
mřížka,
0 V
akcelerační
mřížka, 0 V
extrakční mřížka, U2
226
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další faktory ovlivňující rozlišení TOFMS
• neideální iontový zdroj
• iontová optika
• dilatace letové trubice
• vlastnosti detektoru
• vzorkovací frekvence A/D převodníku
• příprava vzorku
• stabilita urychlovacího napětí
Př. vliv kolísání urychlovacího napětí:
m = const. Ut2 
dt dáno max. frekvencí AD převodníku, rychlostí detektoru a časovou
disperzí tvorby iontů
dU určeno drifty a kolísáním zdroje vysokého napětí






+==−
t
td
2
U
Ud
.
m
md
R 1
const
227
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv uspořádání na rozlišení
Striktní požadavek na paralelní uspořádání
MCP s úzkými kanálky
L
driftová zóna+
+
MCP
detektoriontový zdroj
+
+
3 mm
L
driftová zóna
MCP (detail)
10o
iontový zdroj
228
223
224
225
226
227
228
39
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv uspořádání na rozlišení
Rozlišení:
Např. pro R = 15 000 a L = 3 m:
L 100 mm
Pozn: MCP s úhly kanálků 10o a průměrem 10 mm:
L = 10 mm/tan(10o) = 57 mm
m
m
R

=
m
z
eU
t
L
=2
2
2
R
L
L
=
2
t
t
R

=
2
t = L/v

229
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv mřížek
Mřížky ... elektrody transparentní pro ionty
... v iontovém zdroji, reflektoru a před detektorem
MS s mřížkami
+ přesná definice potenciálu
- ztráty na mřížkách (náraz, odklonění, reakce)
- tvorba sekundárních iontů z materiálu mřížek
MS bez mřížek
- vyšší rozlišení, beze ztrát na mřížkách
- komplikovanější návrh (extra zakřivení drah iontů jako u čočky)
Více podrobností např. v: T. Bergmann, T. P. Martin, H. Schaber Rev. Sci.
Instrum. 1989, 60, 347.
230
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další parametry TOFMS
Terčík (MALDI): až 384 vzorků na terčíku o velikosti titrační destičky,
dostatečná plocha pro sběr eluentu z několika separací
Axiální ozáření vzorku laserem  vyšší rozlišení
Kolizní cela v iontovém zdroji  zvýšení výtěžku fragmentace
Délka driftové zóny (letové trubice): typicky 1-2 m, ale i 10 cm nebo 5 m
Iontový vodič – může být umístěný v trubici pro zvýšení propustnosti iontů
Detektor: mikrokanálková destička (MCP)
elektronové násobiče
hybridní detektory (scintilační vrstva + fotonásobič)
Detekční elektronika: AD převodník (8 bitů, 0.5 - 4 GS/s)
TD převodník + segmentovaný detektor
231
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MALDI analýza početných sérií vzorků
1, 10, 96, 100, 384, 1536 ... vzorků/terčík
384 vzorků/terčík
232
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Srovnání rozlišení systemů TOFMS
systémgeometrie extrakce R
TOFMS lineární DC 500
DE-TOFMS lineární pulsní 5 000
rTOFMS reflektor DC 10 000
DE-rTOFMS reflektor pulsní 20 000
orTOFMS reflektor pulsní 10 000
R ~ 100 000 v komerčně dostupných přístrojích
233
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vlastnosti TOFMS
1. Max. m/z teoreticky neomezená. Praktický limit: účinnost ionizace a
detekce, rozklad iontů během letu.
2. Celé spektrum je zaznamenáno najednou
3. Vysoká rychlost záznamu spektra (desítky ms).
Př.: inzulín (m/z = 5735) urychlený 15 kV překoná 1-metrovou driftovou
zónu za ~ 50 ms.
4. Vysoká propustnost iontů (desítky %).
5. Vysoká rozlišovací schopnost (R > 10 000).
6. Jednoduchost a relativně nízká cena.
7. Dostupné techniky pro MS/MS
234
229
230
231
232
233
234
40
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Shrnutí výhod TOF MS
Výhodné vlastnosti
max. m/z, rychlost a počet analyzovaných vzorků za čas, transmise,
rozlišení, relativně nízká cena
Obrovský rozmach TOF MS v posledních dekádách
MALDI + PE TOF, rTOF MS
API + oTOF MS
Nové techniky pro MS/MS (TOF-TOF, LIFT, QTOF)
Konkurenční techniky
LT, FT-ICR a hybridní MS
235
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Srovnání běžných hmotnostních spektrometrů
MS max. m/z [Da] R správnost m/z [Da] náklady
Q 103 103 0,1 ☺☺
IT, LIT 103 103 0,1 ☺
B 104 104 0,01 
TOF 105 104 0,01 ☺
O 103 105 0,001 
FT-ICR 104 106 0,0001 
Pozn:
Hodnoty v tabulce jsou pouze přibližné a vztahují se k běžným přístrojům,
parametery některých vědeckých nebo nových komerčních přístrojů
mohou být výrazně vyšší (i řádové odchylky).
236
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Simulace pohybu iontů
• Exaktní výpočet pohybu iontů složitý i pro poměrně jednoduchá elektrická
a magnetická pole.
• Simulace iontového pohybu: program Simion
Postup při řešení konfigurace iontové optiky pomocí progamu Simion:
1.Zadání geometrie (nákres elektrod).
2.Zadání potenciálů elektrod, definice magnetického pole.
3.Definice iontů (počet n, v0 , x0, y0, z0, a0, f0 ).
4.Simulace  výsledek (grafická reprezentace, text).
237
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Simion
Příklad: Simulace elektrostatické čočky pomocí programu Simion.
Čočka: 3 segmenty
průměr, d = 36 mm
délky segmentů, y1 = 28 mm, y2 = 26 mm, y3 = 32 mm
mezery mezi segmenty, l = 2 mm
počátek v xyz [0, 0, 0] mm
potenciály, U1 = 0; U2 = proměnné; U3 = 0
Ionty: počet, n = 5
hmotnost, m = 100
kinetická energie, W0 = 100 eV
souřadnice xyz [0, -30, 0] mm
a0(i) = (-4 + 2i )o , kde i = 0 … n – 1
Úkol: Ověřte funkci čočky při napětí na prostředním prstenci, U2 = 0, 85,
100, 120 a 133 V.
Řešení: Viz přílohy
238
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kolizně indukovaná disociace (CID). Tandemová MS (MS/MS).
Další možnosti disociace (ECD, ETD, fragmentace ve zdroji a
za zdrojem – ISD a PSD). Techniky TOF-TOF, LIFT
7
239
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Sken: záznam hmotnostního spektra
S(m/z) = f(X) = f(t)
Skenující přístroje Skenovaná veličina Doba skenu
magnetový sektor (B) B, U ~ 1 s
kvadrupólový filtr (Q) U+V, f ~ 0.1 s
iontové pasti (IT, LT) U, V, f ~ 1 s
Neskenující přístroje (přímý záznam signálu v čase):
průletový analyzátor (TOF) ~ 100 ms
iontový cyklotron (FT-ICR) ~ 1 s
orbitrap (O) ~ 1 s
Další neskenující přístroje mohou používat plošné detektory (array).
240
235
236
237
238
239
240
41
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Jednoduchá hmotnostní spektrometrie
Záznam „celého” spektra
… „kompletní“ informace
Záznam části spektra (zoom scan)
… vybraný interval m/z
www.jimkellyjr.com/2008_07_01_archive.html
241
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Jednoduchá hmotnostní spektrometrie
Záznam signálu vybraného iontu (selected ion monitoring, SIM)
Záznam signálu vybraných iontů (peak switching)
Techniky 2, 3 a 4:
… úspora dat, vyšší frekvence (spektra/s)
… významné uplatnění v chromatografii s MS detekcí
242
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Tandemová hmotnostní spektrometrie
Analýza iontů → fragmentace → analýza iontů
ionty prekurzorů produktové ionty
mateřské ionty dceřinné ionty
precursor/parent ions product/daughter ions
Klasický přístroj pro nízkoenergetickou CID:
trojitý kvadrupólový filtr (triple quad, TQ, QQQ, QqQ, Q3)
Q1: 1. analyzátor (MS1)
q2: kolizní cela (pouze RFQ)
Q3: 2. analyzátor (MS2)
Q1 q2 Q3
MS1 MS2CID
243
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Základní typy MS/MS
1. Skenování iontů produktů, dceřinných iontů
Product ion scan, daughter ion scan, fragment ion scan
Nastavení MS1, skenování MS2
2. Skenování iontů prekurzorů, výchozích látek, mateřských iontů
Precursor ion scan, parent ion scan
Skenování MS1, nastavení MS2
3. Skenování ztráty neutrální částice
Neutral loss scan
Skenování MS1 a MS2 zároveň, m/z = konst.
4. Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí
Selected reaction monitoring/multiple reaction monitoring
Nastavení MS1 a MS2 na vybrané m/z
244
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Skenování produktových iontů
(Product ion scan)
Nastavení MS1: propustit ionty o vybrané m/z
Skenování MS2: spektrum produktů vybraného prekurzoru
… užitečné při objasňování struktury
... fingerprint analyzované sloučeniny
… zjednodušení spektra
... zvýšení poměru signálu k šumu (S/N)
… pozor: MS1 není zárukou izolace jediného výchozího iontu
MSn ... hmotnostní spektrometrie n-tého stupně
245
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: skenování produktových iontů
MS–MS Fragmentation Patterns of
Cholesterol Oxidation Products
B. Rossmann, K. Thurner, W. Luf
Monatsh Chem 138, 437–444 (2007)
APCI QqQ
toxikologicky relevantní produkty
oxidace cholesterolu
246
241
242
243
244
245
246
42
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: skenování produktových iontů
247
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Skenování iontů prekurzorů
(Precursor ion scan)
Skenování MS1: spektrum iontů prekurzorů
Nastavení MS2: detekce produktových iontů o dané m/z
… pro identifikaci skupiny podobných sloučenin, sloučenin
s totožnou funkční skupinou či strukturním motivem
… zjednodušení spektra
... zvýšení S/N
248
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: skenování iontů prekurzorů
Parent ion scans of unseparated peptide
mixtures
M. Wilm, G. Neubauer, M. Mann Anal. Chem.
68, 527-33 (1996)
MS peptidu GLHINDYALNITKSFLLDK
Mr,avg = 2175,5; c = 10 fmol/mL
(B) Sken iontů prekurzoru pro immoniové
ionty isoleucinu a leucinu (m/z = 86 Da)
(C) Sken produktových iontů [M+3H]3+
249
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: skenování iontů prekurzorů
Parent ion scans of unseparated
peptide mixtures
M. Wilm, G. Neubauer, M. Mann Anal.
Chem. 68, 527-33 (1996)
(A) Pozitivní MS fosfopeptidu
EPQYPEEIPIYL,
Mr,mono = 1471,6; c = 1 fmol/mL.
(B) Sken iontů prekurzoru pro
fosfoskupinu (m/z = 79 Da) v
negativním modu při stejné
koncentraci vzorku
250
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Skenování ztráty neutrální částice
(Neutral loss scan)
Současné skenování MS1 a MS2
Konstantní rozdíl m/z propouštěných MS1 a MS2
… ztráta stejné neutrální částice
... vhodné pro látky se stejnou funkční skupinou
… zjednodušení spektra
... zvýšení S/N
251
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: skenování ztráty neutrální částice
Constant neutral loss scanning for the
characterization of bacterial
phospholipids desorbed by fast atom
bombardment
D. N. Heller, C. M. Murphy, R. J. Cotter,
C. Fenselau, O. M. Uy
Anal Chem 60, 2787 - 2791 (1988)
fosfoethanolamin: m/z = 141
fosfoglycerol: m/z = 172
methylfosfoethanolamin: m/z = 155
252
247
248
249
250
251
252
43
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: skenování ztráty neutrální částice
MS
MS/MS
NLS, m/z = 141
fosfoethanolamin
MS/MS
NLS, m/z = 155
methylfosfoethanolamin
253
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: skenování ztráty neutrální částice
MS
MS/MS
NLS, m/z = 172
fosfoglycerol
254
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí
… analogie SIM a peak switching v MS/MS
Monitorování vybrané reakce
(selected reaction monitoring, SRM)
Nastavení MS1: ionty prekurzoru o dané m/z
Nastavení MS2: produktové ionty o dané m/z
… velmi selektivní důkaz analytu, resp. jeho reakce
Monitorování více reakcí
(multiple reaction monitoring, MRM)
Nastavení MS1: peak switching – ionty prekurzorů o daných m/z
Nastavení MS2: peak switching – produktové ionty o daných m/z
… velmi selektivní důkaz analytů, resp. jejich reakcí
Vysoký S/N, používáno v kombinaci s chromatografickými technikami
255
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spojení MS s chromatografickými technikami
(MS chromatogram, ion chromatogram)
… záznam intenzity iontu(ů) v průběhu separace
Celkový iontový proud (Total ion current, TIC)
… monitorování širokého intervalu m/z (stovky a.m.u.)
… vhodný pro celkový obrázek o chromatografii a nalezení nových píků
… nevhodný při analýze komplexních směsí
Monitorování vybraného iontu (Selected ion monitoring, SIM)
… detekce při vybrané m/z
… pro experiment navržený pro monitorování pouze vybraného iontu
… pro více iontů peak switching
Monitorování vybrané reakce (Selected reaction monitoring, SRM)
… analogie SIM s využitím tandemové MS
… pro více rekcí multiple reaction monitoring, MRM
256
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spojení MS s chromatografickými technikami
Při vícerozměrných analýzách (LC-MS, GC-MS, CE-MS) jsou často
zaznamenávána celá spektra v průběhu separace. Z těchto dat pak může být
získán celkový proud, průběh intenzity pro daný m/z
Extracted ion chromatogram, XIC, EIC
Reconstructed ion chromatogram, RIC
„Rekonstruovaný“ chromatogram je obvykle horší kvality než „pravý“ SIM, resp.
MRM získaný na Q, resp. QqQ
Base peak intensity chromatogram, BPC
... intenzita dominantního píku vs. retenční čas
... může vypadat přehledněji než TIC díky ignorování sumy minoritních píků
257
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Kredit:ZbyněkZdráhal,ITBrukerHCTUltraTIC: MS
TIC: MS/MS
XIC: MS @ 701
MS @ 19,8 min
SpojeníMSschromatografickýmitechnikami
258
253
254
255
256
257
258
44
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: Monitorování více reakcí, MRM
B. Rossmann, K. Thurner, W. Luf Monatsh Chem 138, 437- 444 (2007)
259
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: HPLC – APCI – SRM
SRM pro dominantní reakce z předchozí tabulky
260
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: HPLC – APCI – MRM
261
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MRM: TIC a XIC
A multiple reaction monitoring method for absolute quantification of the
human liver alcohol dehydrogenase ADH1C1 isoenzyme
D. J. Janecki, K. G. Bemis, T. J. Tegeler, P. C. Sanghani, L. Zhaib, T. D.
Hurley, W. F. Bosron, M. Wanga, Anal.Biochem. 369, 18-26 (2007)
(A) TIC pro několik vybraných
peptidů
alkoholdehydrogenázy
(B) XIC specifického peptidu
alkoholdehydrogenázy,
prekurzor: z = 3
(C) XIC specifického peptidu
alkoholdehydrogenázy,
prekurzor: z = 2
(navíc standard pro kvantifikaci)
262
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Skenování v MS/MS
Objasnění struktury organických sloučenin
Analýza směsí analytů jako náhrada spojení separace - MS
• Při MS/MS se všechny analyty ionizují současně, izoluje se jeden
analyt po druhém (MS1) a po fragmentaci (CID) se identifikují (MS2).
• Pozor! U složitých směsí dochází k vzájemnému rušení při ionizaci.
Zlepšení poměru signálu k šumu, S/N
• Zvýšení selektivity  snížení šumu
• Zjednodušení spekter
• Všechny druhy skenů MS/MS
• Monitorování vybrané reakce/vybraných reakcí
263
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní spektrometry pro MS/MS
Trojitý kvadrupólový filtr (QqQ)
Iontové pasti (IT, LT, O, FT ICR)
Dvojitý magnetický sektor s obrácenou geometrií (BE, MAG-ESA)
Průletový analyzátor (TOF)
Hybridní spektrometry – kombinace výše uvedených, např. LT - FT ICR
Klasifikace tandemové spektrometrie
fragmentace v prostoru: 1, 3, 4, 5
fragmentace v čase: 2
264
259
260
261
262
263
264
45
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další hmotnostní spektrometry pro MS/MS
Dvojitý magnetický sektor s obrácenou geometrií (BE, MAG-ESA)
Izolace mateřského iontu, fragmentace v kolizní cele
Analýza kinetické energie, W
Pro dceřinné ionty platí W = f(m/z)
První technika MS/MS
(MIKES, Mass-Analyzed Ion Kinetic Energy Spectrometry)
Dokonalejší varianty: EBE, EBEB
EBqQ
EB: dokonalá selekce výchozího iontu
q1: kolizní cela
Q2: selekce produktů
Tandem kvadrupólový filtr - oTOF (QTOF)
TOF-TOF
265
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další hmotnostní spektrometry pro MS/MS
Tandem kvadrupólová iontová past - TOFMS (IT-TOFMS)
IT: možnost akumulace a MSn v prvním stupni.
TOF: citlivý detektor s vysokým rozlišením jako koncový stupeň.
Iontové pasti: kvadrupólová IT a FT-ICR-MS
možnost MSn
tentýž spektrometr jako pro MS, pouze jiný software
Postup:
izolace výchozího iontu (po akumulaci všech iontů)
excitace výchozího iontu (zvýšení amplitudy) po delší dobu
sken produktů (případně zpět k bodu 1 pro MSn, n >2)
Tandem LT – FT-ICR-MS
mnoho možných režimů skenů
266
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Typy disociace
Disociace ... monomolekulární reakce, t(indukce) << t(disociace)
Fragmentace může být způsobena:
1. Kolizí s atomem nebo molekulou
kolizně indukovaná disociace (collision-induced dissociation, CID)
2. Kolizí s povrchem
povrchem indukovaná disociace (surface-induced dissociation, SID)
3. Fotonem - fotodisociace (photodissociation, PD)
např. infrared multiphoton dissociation, IRMPD
4. Elektronem
disociace v důsledku záchytu e- (electron capture dissociation, ECD a
electron transfer dissociation, ETD)
Pozn.: Určení hlavní příčiny fragmentace někdy není jednoznačné, např.
fragmentace během MALDI (ISD and PSD) může být indukován jak
fotony, tak i kolizemi.
267
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Typy disociace
1. srážky s molekulami okolního plynu v kolizní cele při zvýšeném tlaku,
p ~100 Pa
CID/CAD collisionally induced/activated dissociation
2. srážky s povrchem: SID, surface induced dissociation
- povrch: vrstva organické látky (polymer nebo monovrstva malých
organických molekul, např. alkanthiolů) na vhodném substrátu (Au)
- srážky v důsledku urychlení el. polem, př.: napětí nozzle- skimmer
3. fotodisociace
RMPI, resonant multiphoton ionization
4. záchyt elektronu
ECD, Electron capture dissociation
ETD, Electron transfer dissociation
5. nadměrná excitace při ionizaci (např. vysoká energie při LDI a MALDI)
ISF, in-source fragmentation (fragmentace ve zdroji) … v TOF MS
PSD, post-source decay (rozklad vně zdroje) … v TOF MS
268
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Stabilita iontů
1. Stabilní: poločas rozpadu, t > 10-6 s
Iont prolétne celým MS, aniž by se rozložil.
2. Metastabilní: poločas rozpadu, t ~ 10-7 - 10-6 s
Iont se rozládá v průběhu letu hmotnostním spektrometrem.
3. Nestabilní: poločas rozpadu, t < 10-7 s
Iont se rozloží ještě ve zdroji.
Historické rozdělení - časy podle doby pobytu v magnetickém sektoru
Reakce: unimolekulární, bimolekulární
269
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Srážky iontů
Fragmentace
• cílená fragmentace za účelem studia struktury iontu
• obvykle s molekulami vzácných plynů – He, Ar
Elastické srážky
Kinetická energie zůstává zachována.
Neelastické srážky
Část kinetické energie se po srážce přemění na vnitřní energii iontu:
Ein <= E(Mt/(Mt + Mi))
t = terčík (target), i = ion
Těžší terčík  možné přenést více energie na iont
1 eV/iont ~ 100 kJ/mol (100kJ/5 g oplatků)
270
265
266
267
268
269
270
46
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Nízkoenergetické srážky iontů
Energie srážek: 1 – 100 eV
vibrační charakter excitace, interakce mezi iontem a terčem ~ 10-14 s
Účinnost srážek
obvykle dostatečná díky mnoha srážkám iontu v kolizní cele
Instrumentace
trojitý kvadrupólový filtr, iontové pasti, hybridní přístroje
V současnosti nejrozšířenější technika, nízkoenergetická CID
271
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vysokoenergetické srážky iontů
Energie srážek: keV
elektronový charakter excitace, interakce mezi iontem a terčem ~ 10-15 s
přeměněná energie ~ 1 – 3 eV
Účinnost srážek
He – snižuje úhlový rozptyl produktů
Ar, Xe – umožňuje účinnější konverzi energie
Instrumentace
hybridní sektorové přístroje, TOF-TOF
272
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Příklad: McLaffertyho přesmyk
Štěpení karbonylových sloučenin s vodíkem v g pozici na enolický fragment
a olefin indukované EI:
F. W. McLafferty, Anal. Chem. 31, 82 (1959).
D. G. I. Kingston et al., Chem. Rev. 74, 215 (1974); K. Biemann, Mass Spectrometry
(New York, 1962) p 119;
Djerassi et al., J. Am. Chem. Soc. 87, 817 (1965); 91, 2069 (1969); 94, 473 (1972)
M. J. Lacey et al., Org. Mass Spectrom. 5, 1391 (1971); G. Eadon, J. Am. Chem.
Soc. 94, 8938 (1972); F. Turecek, V. Hanus, Org. Mass Spectrom. 15, 8 (1980).
273
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mechanismus McLaffertyho přesmyku
274
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ECD, ETD
Electron capture dissociation
• interakce iontů s termálními elektrony (nízká E)
• aplikace: fragmentace peptidů (ionty c, z ), nevede k fragmentaci bočního
řetězce
• FT-ICR-MS
Electron transfer dissociation
• transfer elektronu z reagentu
• tentýž charakter fragmentace jako ECD
• kvadrupólové pasti
(Syka J.E.P,. Coon J.J., Schroeder M.J., Shabanowitz J., Hunt D.F. PNAS
101, 9528-9533, 2004)
275
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ECD
276
271
272
273
274
275
276
47
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ETD
277
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fragmentace ve zdroji
In-Source Fragmentation (ISF), In-Source Decay (ISD)
Využívaná zejména v MALDI TOFMS peptidů.
Zvýšení energie laseru při MALDI vede k nadměrnému "zahřátí"
molekul/iontů analytu (vibrace) a fragmentaci analytu přímo v iontovém
zdroji.
Intenzita fragmentů << intenzita mateřského iontu ([M+H]+).
Pulsní metody (Delayed Extraction) nutné pro:
dosažení dostatečné citlivosti
prodloužení délky pobytu iontů v iontovém zdroji (více srážek).
Převážně monomolekulární reakční mechanismus (narozdíl od CID).
278
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Charakteristika ISD
+ Není třeba reflektor.
- Vyžaduje pulsní extrakci.
- Příprava čistého analytu nutná (chybí možnost izolace výchozího iontu).
- Může vyžadovat speciální přípravu vzorku, např. zvýšenou koncentraci
solí.
Použití: MALDI TOFMS peptidů, sacharidů.
Převážně monomolekulární reakční mechanismus (narozdíl od CID).
279
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ISD. Analyt: 20 pmol KGF analogu. Matrice: kyselina sinapová. Laser: N2.
(V. Katta, D. T. Chow, M. F. Rohde Anal. Chem., 70, 4410-4416, 1998.)
280
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ISD
Analyt: oxidovaný B řetězec hovězího inzulinu
Matrice: thiomočovina
Laser: Er:YAG (l = 2936 nm)
(http://medweb.uni-muenster.de/institute/impb/research/hillenkamp/publicat/abs-cm99.html)
281
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fragmentace za zdrojem
(Post-Source Decay, PSD)
Iontový selektor (ion gate): výběr výchozího iontu (m/z interval 1 - 20 Da).
Analýzu produktů v reflektoru:
Ionty fragmentů analytu se tvoří během letu driftovou zónou (v
důsledku nadměrné excitace), např.:
ABC+ → AB+ + C
ABC+ → A+ + BC atd.
Bilance kinetické energie pro první rovnici:
mABCv2/2 = mABv2/2 + mCv2/2.
Čím těžší je fragmentový iont, tím vyšší má kinetickou energii a tím hlouběji
pronikne do reflektoru  delší doba letu.
282
277
278
279
280
281
282
48
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Prekursor ABC+
Fragmentace 1
Fragmentace 2
ABC+
AB+
C
A+
BC
v
v
v
v
v
222
222
vmvmvm AABABC +++

Fragmentace za zdrojem
283
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PSD: reflektor jako analyzátor energie a m/z
Klasický reflektor umožňuje zaostřit ionty produktů s disperzí energie (a
m/z) < 20%. Celkové PSD spektrum je proto nutné složit z více PSD
spekter získaných při různém potenciálu reflektoru.
Kvadratický reflektor umožňuje zaostřit ionty v širokém intervalu m/z.
+U20
+
(+)
deflektor/selektor
(-)
detektor 2
+U1
zdroj
(U2 > U1)
reflektor
detektor 1
pro neutrály
(BC, C atd.)
ABC+
AB+
A+
284
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MALDI PSD derivatizovaného peptidu YLYELAR
m/z
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
[Abs. Int. * 1000]
a Y
y R A
Spektrum složeno z několika spekter získaných při různém potenciálu
reflektoru. Zaostřeny pouze píky iontů, které pronikly hlouběji do
reflektoru. Použit reflektor se 2 stupni. (Zdroj: Z. Zdráhal)
285
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MALDI PSD peptidu
1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 m /z
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
a .i.
MALDI PSD – reflektor se 2 stupni. (Zdroj: Z. Zdráhal)
286
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MALDI PSD peptidu
200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
0
20
40
60
80
B
a1
b1
a2y3
b2
y4
a3
y5
b3
a4
y6
b4
b5
y7
a6
b6
y8
a7
b7
[M+H]
+
Intensity[%]
Mass/Charge
pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH2
MALDI PSD – reflektor s kvadratickým polem.
(O. Šedo et al. Anal. Chim. Acta 2004, 515, 261-269)
287
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ortogonální TOF: QTOFMS
reflektor
iontová
optika
detektor (+)
Q1: výběr prekursoru
Q2: CID
Q3: iontový vodič, zaostření
API, AP MALDI...
laser (MALDI)
• Nejběžnější příklad oTOF
• Vhodný pro MS/MS
(nízkoenergetické CID)
• Svazek iontů je po výstupu z Q3
široký (disperze x0), ale ionty
mají zanedbatelnou disperzi v0
ve směru letu v TOF
orthogonální TOF:
typicky pro API, ale i pro MALDI
axiální TOF:
typicky pro MALDI
288
283
284
285
286
287
288
49
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
TOF s CID?
CID (používané v QqQ, IT...)  ISD nebo PSD
Fragmentace v důsledku kolize iontu prekursoru s molekulou plynu
Kolizní komoraCollision chamber
- přídavná kolizní komora ve zdroji TOF má zanedbatelný vliv
Dva způsoby CID v TOF
1. QTOF (přesněji QqTOF)
2. TOF/TOF
289
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
QTOFMS: hybridní TOF MS
Využití výhod obou analyzátorů
Q: vhodné pro 1. MS, jako kolizní cela a pro úpravu iontového svazku
TOF: dobré parametry pro 2. MS
Výměnný iontový zdroj
oddělení ionizace od analyzátoru
vhodné pro kontinuální, kvazikontinuální i pulsní ionizační techniky
Př.: QTOFMS: API (kontinuální iontový zdroj)
AP MALDI (pulsní, kvazikontinuální iontový zdroj)
290
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hybridní instrument pro API a MALDI
QTOF Ultima
(Micromass/Waters)
291
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
QTOF Ultima
(Micromass/Waters)
Hybridní instrument pro API a MALDI
292
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
TOF-TOF
(Medzihradszky, K. F.; Campbell, J. M.; Baldwin, M. A.; Falick, A. M.;
Juhasz, P.; Vestal, M. L.; Burlingame, A. L. Anal. Chem. 2000, 72, 552).
293
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
LIFT TOF MS
MS-MS s využitím TOF principu, dokonalejší PSD (LIFT)
6 kV LIFT cela
15 kV (puls)
reflektor
22 kV
zdroj
15 kV (puls)
LIFT cela:
vstupní
mřížka
výstupní
mřížka
trubice s
mřížkami
294
289
290
291
292
293
294
50
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Detektory a záznam dat. Principy vakuové techniky.
Spojení separace a hmotnostní spektrometrie (on-line, offline,
čipy)
8 295
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Detekce iontů
Faradayův pohár, Faradayova miska
Elektronový násobič
Channeltron
Mikrokanálková destička (MCP)
Indukce (FT-ICR-MS, orbitrap)
“Daly” detektor
Plošné multikanálové detektory (array detectors)
Fotografická deska
Kombinace MCP a diodového pole (MCP-diode array)
aj…
296
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Faradayův pohár (Faraday cup)
- Velmi malé proudy
Př.: 100 iontů/s  1.6x10-17 A
-100 V
-10 V
+
297
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Elektronový násobič
• Obdoba fotonásobiče: konverzní elektroda se sérií dynod (s potenciálem
vzrůstajícím zleva doprava) a kolektorem. Elektronový násobič není
zapouzdřen ve skleněné baňce.
• Konverze iontu na elektron(y) na první elektrodě (např. Cu-Be).
Znásobování elektronů na dynodách. Záchyt elektronů na kolektoru,
vznik proudu.
• Zisk ~ 106
+
atd.
dynody-2 kV
kolektor, 0 V
298
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Channeltron
• Skleněná trubice s vrstvou polovodivého PbO uvnitř. Proud tekoucí
polovodivou vrstvou vytváří gradient potenciálu podél trubice (místo
dynod s diskrétním gradientem). Násobení elektronů jako v
elektronovém násobiči.
• Pro detekci kationtů nutná konverzní dynoda.
• Zisk ~ 106
-3
kV
-100 V
0 V
299
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mikrokanálková destička (microchannel plate, MCP)
Rozměry MCP
• tloušťka ~1 mm
• průměr 1 - 10 cm.
Mikrokanálky
• orientovány šikmo,
• průměr ~ 3 - 20 mm.
• Chevronová struktura
v sestavách více MCP.
• pokryté polovodivou vrstvou PbO,
... vznik gradienu napětí podél mikrokanálku
(kontinuální dynoda, násobení elektronů)
Plošný detektor vhodný pro TOFMS
Zisk jednoho MCP ~103, dvojitého MCP ~106.
+
+
+
+
+
-2.2 kV
-1.2 kV
-200 V
kolektor
0 V
2 MCP s mikrokanálky
300
295
296
297
298
299
300
51
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
“Daly” detektor
Iont → elektron(y) → 4 fotony (fosfor)
+ Velmi nízký šum.
+ Velmi vysoký výkon (fotonásobič obvykle v režimu počítání fotonů).
- Ruší světlo.
- Vyžaduje nízké tlaky (p < 10-5 Pa).
fotonásobič
+
tenký kovový film
vrstvička fofosforu
vyleštěná kovová
elektroda, -30 kV
301
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Plošné multikanálové detektory (Array detectors)
… např. pro magnetický sektor
Fotografická deska
- historický detektor, zdlouhavé zpracování
Kombinace MCP a diodového pole (MCP-diode array)
Zařazení optických vláken umožňuje dosežení vyššího plošného rozlišení.
Další detektory ... kombinace výše uvedených detektorů
Př.: MCP a fosforový scintilátor … izolace vysokého napětí
2 MCP
fosfor
svazek
optických
vláken
diodové
pole
+
+
302
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Záznam dat v MS
ionty
elektrony
proud
napětí
záznamové zařízení
náboj, q
konverze (konverzní účinnost, amplifikace)
I = q/t (t ... čas)
U = IR (R ... impedance)
Odlišná schemata pro
fotografickou desku
a scintilační detektory
303
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Záznam dat v MS
I(m/z) = f(X) = f(t)
Skenující přístroje Skenovaná veličina Doba skenu
MAG magnetický sektor B, U ~ 1 s
Q kvadrupólový filtr U, V, f ~ 0.1 s
IT, LT iontové pasti U, V, f ~ 1 s
Přímý záznam v čase:
TOF ~ 100 ms
FT-ICR iontový cyklotron ~ 1 s
Další neskenující přístroje mohou pužívat plošné detektory (array).
304
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Signál v MS
Osa y: návoj, proud, napětí, počet iontů???
a.u. (arbitrary units) nebo relativní intenzita
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
%Int.
600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000 2100 2200 2300 2400 2500
Mass/Charge
normalizace iontového signálu
305
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Záznamová zařízení
digitální převodníky
• A/D převodník (analog to digital)
• T/D převodník (time to digital)
fotografická deska (historický)
zapisovač signálu (historický)
analogový osciloskop s fotoaparátem (historický)
306
301
302
303
304
305
306
52
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Detekční elektronika - A/D převodník
Měřění (digitalizace) napětí
Základní parametry
počet bitů (rozlišení převodníku)
vzorkovací frekvence, počet vzorků za sekundu [vz/s, sample/s]
max. frekvence (cut-off frequency)
polarita: unipolární (negativní), bipolární
rozsah vstupního napětí
max. vstupní napětí
počet bodů (délka paměti, velikost pufru)
stabilita
aj.
307
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
A/D převodník (analog/digital)
Př.:
2-bitový převodník s rozsahem 0-3V a vz. frekvencí 10 vz/s
počet úrovní = 22:
perioda, T = 1/10 = 0.1 s
SA (V)
3
0
0 0.2 0.4 0.6 t (s) 0 0.2 0.4 0.6 t (s)
SD (#)
2
1
úroveň high-bit low-bit
0 0 0
1 0 1
2 1 0
3 1 1
308
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Přesnost záznamu
Přesnost (a správnost) měření dána počtem bitů AD převodníku
Např. pro 8-bitový převodník 28 = 256 úrovní:
nepřesnost odpovídá 1/2 úrovně
min. rel. chyba > (2x(počet úrovní - 1))-1 = (1/2x255)-1 ~ 0.2 %
počet bitů 1 8 12 16 24
počet úrovní 2 256 4 096 65 536 16 777 216
min. rel. chyba (%) 50 0.2 0.01 8x10-4 3x10-6
dyn. rozsah
(rel. chyba < 10%)
- 50 800 13 000 3 000 000
309
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Volba A/D převodníku
Příčiny:
nízká úroveň signálu
převodník s nízkým počtem bitů
100 102 104
0
2
4
6
8
10
Iontovýsignál
m/z
100 101 102 103 104 105
0
50
100
150
200
250
Iontovýsignál
m/z
Řešení:
• vyšší zisk detektoru
• převodník s vyšším počtem bitů
• akumulace více spekter (průměrování)
310
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Rychlost záznamu spektra
... dána vzorkovací frekvencí AD převodníku
Faktory: doba skenu
rozsah skenu
požadované rozlišení
požadovaná kvalita píku (počet bodů/pík)
Př. 1:
Požadavky na Q: doba skenu = 0.1 s, jednotkové rozlišení v rozsahu m/z =
200 – 2 000, >10 bodů/pík. Minimální vzorkovací frekvence?
min. vzorkovací frekvence = (2 000-200)x10/0.1 = 180 ksample/s
délka paměti = (2 000-200)x10 = 18 000 vz.
… pro 16-bitový převodník 36 kByte
311
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př. 2: Jak rychlý musí být A/D převodník pro TOFMS, abychom
zaznamenali iont letící 20 ms s rozlišením 2 000, chceme-li definovat pík
10 body?
t = 20 ms, R = 2 000
R = m/m = t/(2t)
t = t/2R = 20 ms/4000 = 5 ns (FWHM)
celý pík (~10 bodů) … 10 ns  tsample = 1 ns (1 ns/vz)
vzorkovací frekvence, f = 1/ tsample = 1 Gsample/s
Rychlost A/D převodníku
Signál
t
50%
100%
5 ns
20 ms
t
312
307
308
309
310
311
312
53
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv vzorkovací frekvence AD převodníku
(TOFMS)
5000
10000
15000
20000
25000
5000
10000
15000
20000
25000
Iontovýsignál(a.u.)
Time of flight ( ms)
2 Gsample/s 1 Gsample/s 500 Msample/s
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
18000
20000
10 ns10 ns10 ns
313
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
A/D - současný stav
Vysoký počet bitů: 24 bitů
• ale pouze při nízké vzorkovací frekvenci (1 kHz)
Vysoké vzorkovací frekvence: 20 Gsamples/s
• ale pouze pro nízkobitové A/D (8 bitů)
Vysoký výkon
• akumulace (průměrování) dat přímo v kartě
• komprese v kartě (algoritmy bez ztráty i se ztrátou dat)
• rychlý přenos dat z karty do PC
• ... PCI karta v počítači, přímé adresování PC paměti
314
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
T/D převodník (T/D converter, TDC)
Počítání pulsů
Náraz iontu na detektor → puls → zesilovač → diskriminátor → čítač
T/D převodník (time to digital)
1-bitový A/D převodník
2 úrovně: 0 a 1
Parametry:
časové rozlišení
(počet kanálů)
aj.
315
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
0 20 40 60 t (ms)
0 20 40 60 t (ms)
Akumulace n spekter
Analogové spektrum
(1 puls)
Digitalizované spektrum
(1 puls)
SA (V)
100 %
0
0 20 40 60 t (ms)
SD1 (#)
0
1
SDn (#)
0
n
Akumulované digitalizované
spektrum (n pulsů)
prahová úroveň signálu
316
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
T/D převodník (time/digital)
Ze skupiny iontů dopadajících na detektor během jedné periody je využit
pouze jeden.
Vhodný pro záznam signálu s vysokou opakovací frekvencí přijatelná
(statistika po naakumulování dostatečného počtu spekter).
Nižší cena (oproti A/D).
Aplikace:
TOFMS s vysokou frekvencí extrakčních pulsů (>kHz)
ESI - oTOFMS
AP-MALDI – oTOFMS
TOFMS s nízkým počtem iontů
PD – TOFMS
317
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
T/D převodník (time/digital)
Vícekanálové T/D převodníky
... ke zvýšení dynamického rozsahu
... pomocí skupiny T/D převodníků se segmentovaným detektorem
Klasický TOF detektor
T/D 1 bit
MCP
318
313
314
315
316
317
318
54
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
T/D převodník (time/digital)
Segmentovaný TOF detektor
Ionty dopadají na čtyři segmenty se stejnou pravděpodobností
...celkový tok iontů může být vyšší
Seg. MCP
T/D 1 bit
T/D 1 bit
T/D 1 bit
T/D 1 bit
4 bity
319
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Informatika
Hardware: nejrozšířenější PC (IBM)
Software: Windows XP
Exponenciální růst výkonnosti: Mooreův zákon
Př.:
Vyhodnocení MS/MS spekter programem SEQUEST
SCX - LC - MS/MS digestu směsi proteinů (Y2H kvasnice)
320
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
SCX-LC
MS/MS
321
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: klastr pro vyhodnocení SCX-LC-MS/MS
1x master PC (2 procesory P4, 3 GHz)
8 x slave PC (2 procesory P4, 3 GHz)
vše propojeno 1-Gbitovou sítí
322
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Základy vakuové techniky
Evangelista Torricelli (1608-1647)
Jednotka tlaku: 1 Torr = 1 mm Hg
Tlak, p
p = síla/plocha [Pa, N/m2]
1 atm = 760 Torr = 101 325 Pa = 101.325 bar = 14.70 psi
1 Torr = 133 Pa
Vakuum
stav plynu s p < 101325 Pa
Střední volná dráha molekuly
Střední dráha, kterou urazí iont mezi 2 srážkami
l = (2ps2n )-1
l(cm) = 0.66/p(Pa) ... pouze hrubý odhad pro vzduch při 25°C
323
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Režimy toku plynu
1. Turbulentní tok. (p > 10 kPa)
velmi malá l
mnoho srážek mezi molekulami
2. Viskózní, kontinuální tok. (p = 1000 - 0.1 Pa, "hrubé" vakuum)
l = mm - cm:
stále mnohem menší než rozměry vakuových aparatur
více kolizí molekula - molekula než molekula - stěna
3. Molekulární tok. (p < 0.01 Pa, "vysoké" vakuum, HV, UHV)
l > m:
převládají kolize molekul se stěnami vakuové aparatury
obvyklá situace v hmotnostním spektrometru
pozn.: UHV = ultra high vacuum
324
319
320
321
322
323
324
55
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Průtok plynu
Průtok plynu, Q
[Q] = Pa m3/s, Pa L/s
C … konduktance trubice o průměru D a délce L
C = f(D, L, p, plyn, T), [C] = L/s
Při molekulárním toku C nezávisí na tlaku p:
C  D3/L (aproximace)
Při viskózním toku C závisí na tlaku p:
C  pD4/L (aproximace)
Návrh vakuových aparatur
• Krátké tlusté spoje  C  rychlejší dosažení požadovaného tlaku.
• Sériové spojení trubic - nejúzší místo omezuje celý systém:
1/Ctot = S1/Ci
325
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Rychlost pumpování
Rychlost pumpování, S
[S] = L/s
1/Skomora = 1/Spumpa + 1/Ctot
Správný návrh: Ctot > Spumpa
tj., nemá smysl koupit výkonnou pumpu a pak omezit celkovou rychlost
pumpování komory úzkými spojovacími trubicemi.
Pozn.:
• V režimu molekulového toku pumpa nenasává plyn. Pumpa funguje jako
past; molekuly, které dorazí k pumpě, se neodrazí zpět do komory.
• Rychlost pumpování je různá pro různé plyny (klesá s m plynu).
• Tlak v celém systému není stejný, záleží na umístění tlakového čidla.
• Outgassing. Dobu nutnou k dosažení vakua prodlužuje přítomnost
plynných a těkavých látek adsorbovaných (vzorek, otisky prstů) a
absorbovaných v systému (plyny v těsnění, plastových součástkách).
p
Q
S =
326
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vakuové pumpy
Mechanická pumpa
Difúzní pumpa
Turbomolekulární pumpa
Kryopast
327
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mechanická pumpa
• Jedno- a vícestupňové.
• Rotor v oleji
- min. tlak omezen vypařováním oleje
- nutná past na olejové páry
- nutné výměny oleje
• Tlak > 0.1 Pa … "hrubé" vakuum.
• Rychlost pumpování, S: typicky 1 – 500 L/s
• Běžná pumpa v komerčních systémech.
328
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Turbomolekulární pumpa
• Série velmi rychle rotujícich turbín (až 50 000 rpm). Molekuly plynu jsou
odráženy lopatkami turbín. Obvodová rychlost turbíny > rychlost molekul
plynu.
• Závislost vstupního a výstupního tlaku na molekulové hmotnosti plynu:
ln (pout/pin)  m
• UHV pumpa, tlak > 10-8 Pa
• Rychlosti pumpování do ~ 3000 L/s
• Běžná UHV pumpa v komerčních systémech.
329
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Difúzní pumpa
• Speciální netěkavý olej se zahřívá topnou spirálou v základně, páry oleje
stoupají trubicí uprostřed, tryskají šikmo dolů na chlazené stěny a stékají
na základnu. Speciální olej letící z trysek strhává molekuly okolního
plynu.
• Často přídávána chlazená past (vodou, kapalným N2) nad pumpu –
zachycení příp. úniku oleje.
• UHV (ultra-high vacuum) pumpa, tlak > 10-6 Pa.
• Spolehlivá pumpa, nevyžaduje údržbu.
• Pomalý ohřev i chladnutí.
Kryopast
• Sorbent (např. dřevěné uhlí) chlazený na 4 K (kapalným He).
• Nutnost regenerace.
330
325
326
327
328
329
330
56
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Ohřev UHV systémů
Molekuly plynu se adsorbují na vnitřní stěny hmotnostního spektrometru.
Pomalá desorpce molekul plynu zvyšuje tlak a prodlužuje dobu nutnou k
dosažení požadovaného vakua. Dosažení UHV je možné urychlit zahřátím
systému (např. odporově vyhřívanou vodivou páskou omotanou kolem
systému), což posune rovnováhu od adsorpci směrem k desorpci.
331
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Měření tlaku
Hydrostatický tlakoměr
• Stanovení tlaku z rozdílu hladin.
• Rozsah do 1 kPa, u speciálních konstrukcí až do 0.1 Pa.
Mechanické tlakoměry
• Stanovení tlaku podle výchylky pružné membrány.
• Snímání vychýlky - mechanické
- kapacitní (rozsah 105 – 10-2 Pa)
Termočlánek (Thermocouple gauge)
• Bimetalový termočlánek a odporově žhavené vlákno.
• Přenos tepla z vlákna na termočlánek závisí na tlaku a druhu plynu.
• Rozsah p: 100 Pa - 0.1 Pa, u speciální varianty (convectron) 100 kPa -
0.1 Pa.
332
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Měření tlaku
Iontová trubice (Ion gauge)
Bayard & Alpert: iontová trubice se žhavenou katodou.
• Tři elektrody ve skleněné baňce: spirála (+), drát (-) ve středu spirály a
žhavené vlákno (-) vně spirály (žhavná katoda).
• Stejná sestava jako u otevřeného iontového zdroje: elektrony ze žhavého
vlákna urychleny ke spirále, docházi k ionizaci plynu, záchytu iontů na
drátu a měření proudu. p = f(proud). Pozor, proud je funkcí složení
plynu!
• Rozsah p: 10-2 - 10-10 Pa (vysoké vakuum, UHV)
Penning: iontová trubice se studenou katodou.
• K tvorbě iontů je použit výboj.
• Rozsah p: 1 - 10-4 Pa
Pozn: v komerčních zařízeních se používají termočlánky a iontové trubice.
333
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spojení separace a hmotnostní spektrometrie
Proč separace?
... nutnost analýzy velmi složitých vzorků, směsí mnoha analytů, např.
v případě proteomiky vzorek obsahuje běžně >102 peptidů
Samotná MS a MS/MS není dostačující z několika důvodů:
• vysoká pravděpodobnost výskytu 2 nebo více analytů o stejné m/z
• překryv izotopických obálek analytů s blízkou m/z
• vzájemné rušení analytů
• omezený dynamický rozsah hmotnostního spektrometru
• rozlišení 1. stupně při MS/MS často nedostatečné (R1 ~ 500)
• odstranění nečistot
• zdroj dalších informací o analytech
334
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vzájemné rušení MALDI signálu ve směsi peptidů
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
AI
AIII
AG 1-14
AF 1-7
AF 3-8
AII
AII (off scale)
m/z
IonIntensity(V)
c(peptidů) = 1 mM
c(peptidů) = 1 mM
kromě c(AII) = 50 mM
335
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Typy interface
Plyn → vakuum
• tryskový separátor pro obohacení ABC v nosném plynu (particle beam)
• membránové interface
• kapilární kolona (klasická kolona + splitter)
Kapalina → vakuum
• API ionizační metody (ionizace přímo z kapaliny za atmosferického tlaku)
• Průtokové sondy (FAB)
• Nanesení vzorku na tuhý nosič (terčík)
- pohyblivý pás (naneseni při atmosferickém tlaku – přenos,
diferenciální pumpování - ionizace)
- Sběr frakcí
336
331
332
333
334
335
336
57
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Separace - ESI MS
Nejrozšířenější metody:
2D GE - MS
• 2-rozměrná gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu
• následné vyříznutí zóny a zpracování proteinu
• běžná planární technika pro separaci proteinů
RPHPLC – ESI MS
• kapalinová chromatografie na reverzní fázi – ESI MS
• běžná kolonová technika pro analýzu peptidů
Data dependent scan ... 1 MS sken následován několika MS/MS skeny
(podrobněji v části o aplikacích)
337
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Separace biomolekul: MALDI nebo ESI ?
ESI MS
+ Kompatibilní se separací
+ Komerčně dostupný, rutinní použití
+ Možnost MS-MS
+ Vysoká citlivost
+ Snadná automatizace
- Nelze archivovat vzorek
- Minoritní složky neanalyzovány v MS-MS modu
- Kvantifikace vs. MS-MS
- LC gradient často pomalý
MALDI MS
+ Jednodušší spektra
+ Oddělení separace od hmotnostní analýzy
+ Možnost archivování vzorku
338
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Interface pro MALDI
Obvyklý postup:
• Nanesení kapalného vzorku na terčík
• Vysušení vzorku
• Vložení terčíku do spektrometru a analýza
Režim
1. On-line
2. Off-line
3. In-line
Přídavek MALDI matrice
1. Smíchání s roztokem analytu (sheath flow, T, liquid junction)
2. Nanesení roztoku na terčík pokrytý vrstvičkou matrice
Sběr eluentu
1. Diskrétní frakce
2. Spojitá stopa
339
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Interface pro MALDI
Off-line
Terčíky s hydrofilními místy (anchorchip).
Mikrometody používající piezoelektrické pipetory a mikroterčíky.
Nanášení vzorku pomocí elektrospreje
On-line
Průtoková sonda s fritou
Průtoková sonda bez frity
Zmlžovač pro tvorbu aerosolu
In-line
Interface ROBIN
Nanášení vzorku na povrch ve vakuu, moving belt interface
Off-line vs. on-line
+ Oddělení separace od hmotnostní analýzy
+ Možnost archivování vzorku
340
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Archivování vzorku (MALDI)
Postup při separaci s MALDI MS a MS/MS detekcí
1. Nanesení eluentu na terčík
2. MALDI MS analýza (<10% vzorku spotřebováno)
3. Analýza MALDI MS dat
4. MALDI MS-MS vybraných píků (detailní analýza)
(Po 1. kroku může být postup kdykoli přerušen.)
341
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Průtoková sonda (on-line)
Whittal, R. M., Russon, L. M., Li, L. J. Chromatogr. A 1998, 794, 367-375.
342
337
338
339
340
341
342
58
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fei, X., Wei, G., Murray, K. K. Anal. Chem. 1996, 68, 1143-1147.
Zmlžovač pro tvorbu aerosolu (on-line)
343
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Moving belt interface (in-line)
Rozhraní pro kontinuální zavádění netěkavého vzorku v těkavějším solventu
do hmotnostního spektrometru
McFadden W. H., Schwartz H. L. and Evans S. J. Chromatogr. 122, 389,
1976.
k vakuovým pumpám
IR vyhřívání
horký N2 LC eluent
vyhřívací
element
štěrbiny
pohybující se polyimidový pás
iontový
zdroj
344
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Orsnes, H., Zenobi, R. Chem. Soc. Rev. 2001, 30, 104-112.
ROBIN (rotating ball inlet), in-line
345
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
source chamber (p ~ 10-6 Torr)
probe with
capillary
interface flange
source
coil
repeller
repeller center
(tape guide)
deposition
support
propelled
shaft
target
coil
rubber
wheel
2ND GENERATION VACUUM DEPOSITION INTERFACE
atmospheric
pressure
Mylar tape
Nanášení vzorku ve vakuu (in-line i off-line)
346
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Automatizovaný sběr frakcí (off-line)
Např.: Probot (zdroj: www.lcpackings.com)
347
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spojení čip – hmotnostní spektrometrie
(čip, mikročip, microfluidic device)
Proč mikro + makro? ... Možné výhody čipu:
• integrace více kroků, “lab on a chip“ (dávkování, příprava, separace ...)
• paralelní analýzy (opakující se motiv na jednom čipu)
• nízká cena – čip na jedno použití (při sériové výrobě)
• veškeré úpravy na čipu, MS detektor
Základní typy:
1.2D pole
• afinitní pole: nejprve zakoncentrování specifických látek, poté MALDI
MS přímo z čipu
• pole vialek se špičkami pro ESI: zvýšení reprodukovatelnosti analýzy
2. Fluidní systém (čipy s kanálky)
• systémy pro paralelní analýzu– pro ESI, MALDI ...
• systémy integrující několik kroků
348
343
344
345
346
347
348
59
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mikrometody
Laurell, T.; Nilsson, J.; Marko-Varga, G. Trends Anal. Chem. 2001, 20, 225-231.
349
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Příklad návrhu čipu pro paralelní analýzu
společný kapalinový spoj
separační kanálky
infúzní kapiláry do sondy
kapiláry pro dávkování
vzorků z mikrotitrační destičky
350
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Čip vs. konvenční zařízení
351
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Biologické aplikace MS: proteomika. Separační techniky
Enzymatické štěpení proteinů. Identifikace proteinů:
mapování peptidů, sequence tag, accurate mass tag
9
352
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
IV. Biologické aplikace MS
Genom, proteom, metabolom.
Malé organické molekuly - biomolekuly, léky, petrochemické produkty.
Biopolymery (DNA, proteiny, cukry).
Syntetické polymery.
Proteomika
Charakterizace peptidů a proteinů – proteinového komplementu genomu.
V současnosti hlavní a nejperspektivnější aplikace hmotnostní
spektrometrie.
Genom  proteom. Uroveň exprese gen → protein různá.
Genom je v podstatě statický, proteom dynamický: exprese závisí na druhu
a funkci proteinu, poloze v buňce, stavu a zdraví buňky. Funkce
organismu souvisí bezpprostředně s proteomem.
353
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Proteomika
Analýza proteomu složitější než analýza genomu
- více stavebních kamenů, aminokyselin
- variabilita - modifikace aminokyselin
- neexistuje metoda amplifikace proteinu obdobná PCR
- nízká množství mnoha proteinů (např. regulačních proteinů)
Diferenční proteomika
Stanovení rozdílné exprese proteinů (přítomnosti nebo absence)
v ovlivněném a zdravém organismu (orgán, tkáň, buňka).
Funkční proteomika
Stanovení všech interakcí (protein-protein, protein-DNA, atd.) v daném
organismu (orgán, tkáň, buňka).
354
349
350
351
352
353
354
60
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
IUPAC názvosloví aminokyselin
Alanine Ala A CH3-CH(NH2)-COOH
Arginine Arg R H2N-C(=NH)-NH-[CH2]3-CH(NH2)-COOH
Asparagine Asn
N
H2N-CO-CH2-CH(NH2)-COOH
Aspartic acid Asp
D
HOOC-CH2-CH(NH2)-COOH
Cysteine Cys C HS-CH2-CH(NH2)-COOH
Glutamine Gln Q H2N-CO-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Trivíální název Symboly Vzorec
Glutamic acid Glu
E
HOOC-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Glycine Gly G CH2(NH2)-COOH
Histidine His H
355
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
IUPAC názvosloví aminokyselin
Isoleucine Ile I C2H5-CH(CH3)-CH(NH2)-COOH
Leucine Leu L (CH3)2CH-CH2-CH(NH2)-COOH
Lysine Lys K H2N-[CH2]4-CH(NH2)-COOH
Methionine Met M CH3-S-[CH2]2-CH(NH2)-COOH
Phenylalanine Phe F C6H5-CH2-CH(NH2)-COOH
Proline Pro P
Serine Ser S HO-CH2-CH(NH2)-COOH
Trivíální název Symboly Vzorec
356
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
IUPAC názvosloví aminokyselin
Trivíální název Symboly Vzorec
Threonine Thr T CH3-CH(OH)-CH(NH2)-COOH
Tryptophan Trp W
Tyrosine Tyr Y
Valine Val V (CH3)2CH-CH(NH2)-COOH
357
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Historický přehled ionizačních metod
vhodných pro analýzu peptidů a proteinů
1969 FD Desorpce polem (Beckey)
1974 PD Plazmová desorpce (McFarlane)
1976 SIMS MS sekundárních iontů (Benninghoven)
1981 FAB Ionizace rychlými atomy (Barber)
1984 ESI Electrosprej (Fenn)
1987 MALDI Laserová desorpce za účasti matrice (Karas, Hillenkamp)
1994 nano-ESI Nanoelektrosprej (Wilm, Mann)
358
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Současné ionizační techniky v proteomice
FAB
max. m ~ 10 000
LD ~ 20 pmol (klasický FAB), < 1 pmol (CF-FAB)
ESI
max. m ~ 100 000 Da (z >> 1)
LD < 10 fmol (rutinní)
LD ~ amol nebo 10-9 M (vybrané aplikace)
MALDI
max. m ~ 106 (prakticky neomezen – TOF analyzátor)
relativně nejvíce odolná vůči rušení nečistotami
LD < 10 fmol (rutinní)
LD ~ amol nebo 10-9 M (vybrané aplikace)
359
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Hmotnostní spektrometry v proteomice
MALDI MS vysoký počet vzorků/čas
TOF
ESI MS-MS objasnění struktury
QqTOF, IT, FT ICR
Nová instrumentace MALDI TOF-TOF, MALDI LIFT TOF
MALDI QqTOF
• rychlá identifikace v MS modu
• možnost detailní analýzy v MS-MS modu později
360
355
356
357
358
359
360
61
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Separační metody v proteomice
GE
gelová elektroforéza na polyakrylamidovém gelu
HPLC
vysoceúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi
IEC
chromatografie na iontoměničích
AC
afinitní chromatografie
CE
kapilární elektroforéza
Centrifugace
běžná centrifugace, gradientová centrifugace
361
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Gelová elektroforéza (GE)
2D SDS PAGE
2D: 2-rozměrná elektroforéza
1. rozměr: dle pI (izoelektrická fokusace)
2. rozměr: dle velikosti SDS pro denaturaci (náboj/velikost = konst.)
PA: polyakrylamidový gel jako separační médium
• Vhodná pro separaci tisíců až desetitisíců proteinů, v případě velmi
jednoduchých směsí stačí i 1D GE
• Rychlá identifikace a charakterizace proteinů na 2D gelu je nejběžnější
analýzou současné proteomiky
• Zhruba 5% proteinů a 30% peptidů migruje anomálně
• PTM ovlivňují zdánlivou m proteinů (chyba až 50%)
• Problematický transport proteinů z gelové matrice (elektroblot na
membránu)
362
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: 2D GE lidské plazmy
Zdroj: Expasy 363
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
RP HPLC
• Kolona: klasická, kapilární (f 300 mm) nebo nano LC (f 75 mm)
• Náplň: C18, velikost nosiče: 3 – 10 mm (RP ... reverse phase)
• Gradientová eluce, např:
- start: 10% org fáze + 90% vodné fáze
- konec: 80% org fáze + 20% vodné fáze
- organická fáze: ACN (acetonitril) + 0.1% TFA (kyselina trifluoroctová)
- vodná fáze: 0.1% TFA
• Organický solvent přispívá k rozpustnosti peptidů, umožňuje detekci v
UV (230 – 240 nm) a rychle se vypařuje, což je výhodné pro sběr frakcí
např. pro MALDI MS.
• Standardní technika kolonové separace pro peptidy a proteiny
364
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: RP HPLC směsi peptidů (digest BSA)
Zdroj: ThermoFinnigan 2002 365
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Enzymatické štěpení proteinů
protein směs peptidů
Důvody přechodu z oblasti vysokých m/z do oblasti nízkých m/z:
1. Lepší parametry hmotnostních spektrometrů (vyšší rozlišení, přesnost a
správnost stanovení m/z, citlivost)
2. Úžší izotopová obálka (jednodušší spektra, vyšší citlivost)
Pozn.:
digestion = enzymatické štěpení, trávení
digest = směs tryptických fragmentů, produkt enzymatického štěpení
úpravy před štěpením:
• redukce -S-S- můstků: dithiothreitol (DTT)
• alkylace –SH: jodoacetamid (IAA)  m: + 57 Da
• důvod: „rozbalení proteinu“ ... lepší přístup enzymu
enzym
366
361
362
363
364
365
366
62
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Enzymatické štěpení proteinů
Nejčastěji trypsin (různě upravený, např. TPCK k potlačení
chymotrypsinové aktivity, methylací aj.).
Další enzymy: lysin, chymotrypsin, CNBr aj.
Produkty enzymatického štěpení
• specifické fragmenty analyzovaného proteinu
Např. trypsin štěpí na C-straně aminokyselin K or R, pokud není soused
P. (Skutečná pravidla ještě složitější):
N terminál-X-X-X-X-X-K (nebo R)-Z-Z-Z-Z-Z-Z-C terminál (ZP)
• nespecifické fragmenty analyzovaného proteinu
• artefakty (modifikace aminokyselin, např. oxidací, díky PA gelu atd.)
• fragmenty enzymu (autolýza)
• fragmenty keratinu ( )
Nterm...-XXX-XXX-Lys-YYY-XXX-XXX-... Cterm ^ /|\ | trypsin cleaves this peptidebond
367
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Enzymatické štěpení proteinů v 2D gelu
1. Wash the gel slices for at least 1 hr in 500 microliters of 100 mM ammonium bicarbonate. Discard the
wash.
2. Add 150 microliters of 100 mM ammonium bicarbonate and 10 microliters of 45 mM DTT. Incubate at 60
degrees centigrade for 30 min.
3. Cool to room temp and add 10 microliters of 100 mM iodoacetamide and incubate for 30 min in the dark
at room temperature.
4. Discard the solvent and wash the gel slice in 500 microliters of 50% acetonitrile/100 mM ammonium
bicarbonate with shaking for 1 hr. Discardthe wash. Cut the gel into 2-3 pieces and transfer to a 200
microliter eppendorf style PCR tube.
5. Add 50 microliters of acetonitrile to shrink the gel pieces. After 10-15 min remove the solvent and dry the
gel slices in a rotatory evaporator.
6. Re-swell the gel pieces with 10 microliters of 25 mM ammonium bicarbonate containing Promega
modified trypsin (sequencing grade) at a concentration such that a substrate to enzyme ratio of 10:1 has
been achieved. (If the amount of protein is not known, add 0.1-0.2 microgramsof modified trypsin in 10
microliters of 25 mM ammonium bicarbonate).After 10-15 minutes add 10-20 microliters of additional
buffer to cover the gel pieces. Gel pieces need to stay wet during the digest. Incubate 4 hrs to overnight
at 37 degrees Centigrade.Proceed to step 8 if further extraction of the gel is desired (recommended)otherwise
continue with step 7.
7. Approximately 0.5 microliters of the supernatant may be removed for MALDI analysis and/or the
supernatant acidified by adding 10% TFA to a final concentration of 1% TFA for injection onto a narrowor
microbore reverse phase column. (If necessary the sample's volume may be reduced~1/3 on a
rotatory evaporator.)
8. Extraction (Optional)- Save supernatant from step 7 in tube X, and extract peptides from gel twice with
50 microliters of 60%acetonitrile/0.1% TFA for 20 min. Combine all extracts in tube X (using the same
pipet tip to minimize losses), and speed vac to near dryness.Reconstitute in 20 microliters of appropriate
solvent. Proceed with chromatography or MALDI analysis.
Zdroj: http://www.abrf.org/ResearchGroups/ProteinIdentification/EPosters/pirgprotocol.html
368
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Strategie analýzy v proteomice
Základní typy analýzy
1. Identifikace (potvrzení přítomnosti známého proteinu ve vzorku)
2. Relativní kvantifikace v diferenciální proteomice
3. Sekvenace neznámého proteinu/peptidu (de novo sequencing)
Vzorek je obvykle směs mnoha proteinů/peptidů
     
Analýza založena na použití separací s MS a MS/MS detekcí
Identifikace
Sekvence mnoha proteinů již byla popsána a není nutné ji znovu
analyzovat.
369
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Strategie analýzy v proteomice
Top-down
• izolace proteinů
• zpracování proteinů, enzymatické štěpení
• analýza peptidů (MS, MS/MS)
Bottom-up
• enzymatické štěpení
• separace peptidů
• analýza peptidů (MS, MS/MS)
370
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Některé užitečné termíny
genotyp genetické vybavení organismu, dispozice
fenotyp skutečný obraz organismu, výsledek interakce s prostředím
in vivo v žijícím organismu
in vitro mimo žijící organismus, v umělém prostředí
http://www.meta-library.net/gengloss
371
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Identifikace proteinu
Známé informace:
- Původ vzorku (organismus)
- Izoelektrický bod (pI) z 2D PAGE)
- Molekulární hmotnost proteinu z 2D PAGE, příp. MALDI TOF MS
- N- a C- část sekvence (Edmanova degradace)
... Tyto informace nejsou dostatečné k identifikaci proteinu (nebo je jejich
získání nemožné, příp. zdlouhavé)
Metody identifikace
A. 2D GE + X + MS (peptidové mapování)
B. 2D GE + X + RPHPLC + MS a MS/MS (sequence tag, AMT)
C. X + 2D LC (např. IEC a RHPLC) + MS a MS/MS
D. X + AC (afinitní chromatografie) + MS a MS/MS (IMAC, ICAT)
E. Strategie využívající X a izotopové reagenty/standardy
X ... selektivní enzymatické štěpení
372
367
368
369
370
371
372
63
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Identifikace proteinu
• Získání specifických informací o proteinu pomocí MS
• Srovnání specifických vlastností analyzovaného proteinu s knihovnou
(obsahující specifické vlastnosti) známých proteinů.
Specificita:
1.Analýza více peptidů se vztahem k proteinu
peptidové mapování (PMF, peptide mapping), získání peptidového
fingerprintu, analýza m/z produktů enzymatického štěpění
2.Podrobná analýza jednoho peptidu z proteinu
a) sequence tag, MS-tag - analýza části sekvence (z fragmenatce
peptidu v plynné fázi
b) accurate mass tag, AMT – analýza složení části proteinu (z přesné
m produktu enzymatického štěpění,)
• Vyžaduje vysokou správnost MS analýzy + kvalitní databázi
• Identifikace používající MS jsou výrazně rychlejší a citlivější než chemické
metody (Edmanova degradace)
• Negativní výsledek hledání v databázi = nový protein !!!!!
373
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Mapování peptidů (peptide mapping, peptide
mass fingerprinting, PMF)
Určení proteinu analýzou produktů enzymatického štěpení
1. Separace a kvantifikace proteinů: 2D GE
2. Vyříznutí gelu, úprava, enzymatické štěpení
buňky,
tkáň
vyjmutí
skvrny
2D gelová
elektroforéza
proteinový
extrakt izolovaný protein
(zpravidla v gelu)
peptidové fragmenty
(digest proteinu)
chemické úpravy a
selektivní štěpení
(např. trypsin, CNBr)
374
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PMF
3. MS analýza a vyhodnocení výsledků
peptidové fragmenty
(digest proteinu)
MALDI MS
ESI MS
m/z
hledání v proteinové databázi
(identifikace známých proteinů)
separace - ESI MS
m/z
ESI MS-MS
vybraných peptidů
struktura
(nové peptidy a proteiny)
375
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Příklad hledání v databázích: MS Fit
Zadání:
376
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Příklad hledání v databázích: MS Fit
Výsledky:
MS Fit - Identifikace proteinu z hmotností peptidových fragmentů pomocí
programu na http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml3.2/msfit.htm
377
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Nedostatky PMF
• Vyžaduje izolaci čistého proteinu, max. 2-3 proteiny před enz. štěpením
• Vyžaduje správnost stanoveni m/z < 100 ppm, mnohem lépe <10 ppm
• Vyšší správnost stanovení m/z  jednoznačnější odpověď hledání v
databázi
• Nepřítomnost očekávaných peptidů v digestu obvykle menší problém než
přítomnost nadbytečných peptidů
• Zpravidla 4-5 peptidů dostačujících k získání spolehlivého výsledku
378
373
374
375
376
377
378
64
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PMF: teorie vs. praxe
Nadbytečné píky
• neselektivní štěpení (např. chymotryptická aktivitá trypsinu)
• nečistoty (např. keratiny)
• nedostatečná separace (další proteiny ve skvrně)
• autolýza enzymu
• post-translační modifikace (PTM), artefakty
Chybějící píky
• špatně rozpustné peptidy
• adsorpce peptidů
• vzájemné rušení peptidů
• neselektivní rozštěpení peptidu
• nedostatečné štěpení proteinu (sterické zábrany)
• PTM, artefakty
379
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Metoda Sequence-Tag (MS-Tag)
• Identifikace proteinu na základě přesné znalosti malé části jeho sekvence
(sequence-tag, MS-tag), zpravidla sekvence jednoho peptidu
• Přesné stanovení sekvence aminokyselin části proteinu (typicky jednoho
peptidového fragmentu z enz. štěpení) - obvykle pomocí ESI-MS/MS
nebo MALDI-PSD-MS přímo z tabulky píků nebo spektra
• Potřebná délka části sekvence cca. 8-10 aminokyselin
• Čím delší sekvence je známa, tím přesnější je identifikace proteinu
• Známá část sekvence je hledána v proteinových databázích
• Další informace o proteinu: druh organismu, m (2D GE), pI atd.
380
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Strategie MALDI MS a LC - ESI MS
Zdroj: ThermoFinnigan 2002
peptidové mapování
MS/MS: MS-tag
381
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Schema 2D LC/MS/MS
Zdroj: ThermoFinnigan 2002 382
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Experimentální sestava 2D LC/MS/MS
1D: Chromatografie na ionexu
2D: RHPLC (2 HPLC kolony ... vyšší
produktivita)
Zdroj: ThermoFinnigan 2002
383
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Experimentální sestava 2D LC/MS/MS
Zdroj: ThermoFinnigan 2002 384
379
380
381
382
383
384
65
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Řízení 2D LC/MS/MS experimentu
Zdroj: ThermoFinnigan 2002 385
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Výsledky 2D LC/MS/MS experimentu
Zdroj: ThermoFinnigan 2002 386
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
LC-ESI MS a MS/MS:
Dynamická analýza LC-ESI MS/MS (data-dependent analysis):
• Jeden MS sken následovaný několika MS/MS skeny hlavních prekursorů
• V případě složitějších spekter i následující MS3 skeny (např. pro detekci
fosforylací)
387
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Accurate mass tag (AMT)
• Identifikace proteinu na základě znalosti správné hmotnosti jednoho
fragmentu po enzymatickém štepení
• Správné stanovení hmotnosti proteinu (typicky jednoho peptidového
fragmentu z enz. štěpení) – stanovení m pomocí FT ICR MS
• Typický počet aminokyselin v řetězci peptidu ~ 10. Přesná hmotnost
aminokyselin – např. mmono(G)=57.02146, mmono(A)=71.03711 atd.
• Při správnosti stanovení m/z < 1 ppm je vysoká pravděpodobnost, že
dané hmotnosti peptidu odpovídá jediné složení aminokyselin – viz.
následující obr.
atom 1H 12C 14N 16O 32S
m [Da] 1.007825 12.000000 14.003074 15.994915 31.972071
388
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
AMT
MS směsi všech možných 10-merů peptidů při různých hodnotách R (a
správnosti stanovení m/z): 103 (1000 ppm) (A), 104 (100 ppm) (B), 105
(10 ppm) (C), and 107 (0.1 ppm) (D).
Zdroj: T. P. Conrads, G. A. Anderson, T. D. Veenstra, L. Paša-Tolić and
R. D. Smith Anal Chem. 2000, 72, 3349-3354
početpeptidů
m/z m/z
389
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
AMT
Zdroj: T. P. Conrads, G. A. Anderson, T. D. Veenstra, L. Paša-Tolić and R. D.
Smith Anal Chem. 2000, 72, 3349-3354
390
385
386
387
388
389
390
66
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Aplikace: proteiny a peptidy. Izotopové značení. Metody ICAT a
iTRAQ. Stanovení sekvence. Post-translační modifikace
10
391
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další strategie pro analýzu proteomu
• Nejsou pokusem o kompletní analýzu proteomu
• Spoléhají na kolonové separační techniky (místo 2D GE)
• Zahrnují zjednodušení výchozí směsi – výběr proteinů/peptidů, které
obsahují např. cystein (ICAT), fosforylovanou aminokyselinu (IMAC) aj.
• Případné ztráty dané nekompletností analýzy nejsou dramatické a jsou
vyváženy relativním zjednodušením směsi a kratší dobou analýzy
• Další přídavné prvky, např. použití izotopových značek, umožnují získat
informaci o kvantitě analytu
392
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Využití izotopů v hmotnostní spektrometrii
Značení nestabilním izotopem
• použití v radiochemii
Značení stabilním izotopem
• běžně v hmotnostní spektrometrii
• Základní přístupy
- použití izotopově značených vnitřních standardů
- zabudování izotopově značených látek do organismů
(vhodné pro dif. proteomiku nižších organismů)
- derivatizace analytu izotopově značeným reagentem
393
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Některé zkratky v proteomice
GIST Global Internal Standard Technology (2H, 13C, 15N)
ICAT Isotope-Coded Affinity Tags (cystein)
PhIAT Phosphoprotein Istope-coded Afinity Tag (fosforylované peptidy)
IMAC Ion Metal Afinity Chromatography
(afinitní záchyt fosfopeptidů)
AQUA Absolute QUAntification
(pomocí uměle syntetizovaných izotopicky značených peptidů
jako interních standardů)
SILAC Stable Isotope Labeling with Amino acids in Cell culture
(růst kultrury v normálním a obohaceném médiu)
MUDPIT Multidimensional Protein Identification Technology
(SCX – RHPLC – MS/MS)
394
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analýza ICAT (isotope-coded affinity tags)
ICAT ... isotope-coded affinity tags (R. Aerbersold)
rozdíly v expresi proteinů stanovením relativních intenzit peptidů
1. Frakcionace proteinu
2. Enzymatické štěpení celého vzorku
3. Izotopové značení (ICAT)
4. Smíchání a MS analýza
395
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analýza ICAT
396
391
392
393
394
395
396
67
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analýza ICAT
Pozn.
• Proteiny lze označit před enzymatickým štěpením (záměna kroku 2 a 3)
Nedostatky ICAT první generace
• Rozdíl m izotopových značek roven 8  občas interference v MS/MS
spektrech
• Nepatrně odlišná retence analytu označkovaných lehkou a těžkou formou
značky. Důsledek: poměr lehké a těžké formy nelze zjistit z poměru
iontových intenzit během HPLC MS/MS; je třeba integrovat celý LC pík
ICAT druhé generace
• Použití 9 atomů 13C ve spojovacím řetězci (místo 8 atomů D)
• Stejný eluční čas lehké i těžké formy v HPLC
397
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Charakteristika ICAT
Výhody
+ Vhodná pro různé vzorky proteinů (tělesné tekutiny, buňky, tkáně,
kultury)
+ Značné zjednodušení směsi
+ Kompatibilita s dalšími metodami vhodnými pro analýzu minoritních
proteinů
Nevýhody
- Relativně velká značka (~500 Da)
- Nevhodnost pro proteiny bez cysteinu (např. 8% u kvasinek)
398
iTRAQ
- další technika diferenciální
proteomiky
- vzrůst m/z derivatizovaných
peptidů stejná (stejný prekurzor,
velmi podobná separace)
- rozdílná m/z produktového iontu
- celkem 4 různá činidla pro
derivatizaci peptidů
- celková hmotnost stejná,
hmotnost „reporterů“ 114, 115,
116 a 117
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
http://www.broadinstitute.org/scientific-
community/science/platforms/proteomics/itraq
399
iTRAQ
Příklad dvou derivatizačních činidel
s reportéry 114 a 116:
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
http://www.proteome.soton.ac.uk/iTRAQ.htm
400
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Stanovení sekvence proteinu/peptidu
Klasická analýza
- Edmanovo odbourávání
- Určení koncových skupin (N, C)
Nedostatky: doba analýzy, relativně nízká citlivost
Současná strategie: kombinace více metod
- preparativní separace
- enzymatické štěpení
- MS
- MS/MS, ISF, PSD
- MSn
401
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Stanovení sekvence peptidu MS
Kombinace chemického štěpení a MS
1. Tvorba směsi peptidových fragmentů lišících se o jednu
aminokyselinu chemickou cestou:
a) fenyl izothiokyanát + A1A2A3.. → fenylizothiohydantoinA2A3.. + A1
fenyl izothiokyanát + A2A3.. → fenylizothiohydantoinA3.. + A2
atd.
fenylizokyanát v malém množství jako terminační činidlo tvoří malou
frakci fenylkarbamátu od každého peptidu
b) alternativní strategie je založena na použití karboxypeptidázy po
různě dlouhou dobu nebo v různých množstvích  vznik několika
směsí peptidů
2. MALDI MS směsi fragmentů peptidů.
• aminokyselina je určena ze vzdálenosti sousedních píků, sekvence
aminokyselin z pořadí píků
402
397
398
399
400
401
402
68
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Patterson, D. H., Tarr, G. E., Regnier, F. E. and Martin, S. A., Anal. Chem.1995, 67, 3971.
403
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Stanovení sekvence peptidu MS/MS
CID
• nízkoenergetická CID je v souč. nejrozšířenější metoda fragmentace
• IT, TQ, QTOF
ISD
• vyžaduje izolaci čisté látky
• MALDI TOF
PSD
• horší kvalita spekter než z CID, často nutno spojovat spektrum z více částí
• MALDI TOF
Pozn.
• vysokoenergetická CID, SID, fotodisociace, disociace po nárazu elektronu
nejsou používány rutinně
• Leu/Ile … izomery, Gln/Lys ... izobary
404
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fragmentace peptidů
Fragmentace 1 nebo 2 vazeb peptidového řetězce
- fragmenty obsahující N terminál (a, b, c)
- fragmenty obsahující C terminál (x, y, z)
- tyto ionty mohou vzniknout i fragmentací 2 vazeb řetězce
- ztráta NH3, H2O, CO2
Fragmentace bočního řetězce (zbytku aminokyseliny)
- obvykle ztráta části bočního řetězce aminokyseliny
- fragmetny typu d, w, v
Vnitřní fragmenty
- neobsahují N ani C terminál ... menší analytický význam
Immoniové ionty
- užitečná informace o aminokyselinách; m(IM)= m(AKres) - 27
405
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Schéma fragmentace peptidu a značení fragmentů.
immoniové ionty aminokyselin:
H
2
N - CH - C -
OR
1
NH - CH - C -
OR
2
NH - CH - C -
OR
3
NH - CH - COOH
R
4
x
3
a
1
y
3
b
1
z
3
c
1
x
2
a
2
y
2
b
2
z
2
c
2
x
1
a
3
y
1
b
3
z
1
c
3
H+
Roepstorff & Fohlman, Biomed. MS 1984, 11, 601.
406
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fragmenty peptidů
407
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Schéma fragmentace peptidu a značení fragmentů.
408
403
404
405
406
407
408
69
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další fragmenty peptidů
409
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
aminokyselina m (mono) m (immonium) m (doprovodné ionty)
A 71.03712 44
R 156.10112 129 59,70,73,87,100,112
N 114.04293 87 70
D 115.02695 88 70
C 103.00919 76
E 129.04260 102
Q 128.05858 101 56,84,129
G 57.02147 30
H 137.05891 110 82,121,123,138,166
I 113.08407 86 44,72
L 113.08407 86 44,72
K 128.09497 101 70,84,112,129
M 131.04049 104 61
F 147.06842 120 91
P 97.05277 70
S 87.03203 60
T 101.04768 74
W 186.07932 159 77,117,130,132,170,171
Y 163.06333 136 91,107
V 99.06842 72 41,55,69
m ... reziduum
410
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Výpočet molekulové hmotnosti peptidu/proteinu
Suma hmotností reziduí aminokyselin
+
Hmotnost koncových skupin:
obvykle 1 Da (H) pro N konec (-NH2)
a 17 Da (OH) pro C konec (-COOH)
+
Hmotnost protonu 1 Da – iont většinou ve formě [M+H]+
(ale i 23 Da pro adukt [M+Na]+ atd.)
411
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
CID fragmentace
Typy iontů v CID
1. série píků iontů b a y
2. doprovodné píky
–17, ztráta NH3 z Gln, Lys, Arg
–18, ztráta H2O ze Ser, Thr, Asp, Glu
a (tj. b – 28), satelitní série fragmentů typu b (ztráta CO)
3. immoniové ionty aminokyselin.
4. interní fragmenty – zejm. od Pro ve směru C konce
Výběr prekurzoru v CID MS/MS:
z = 2: [M+2H]2+
Iont s dvěma náboji poskytuje CID spektra vyšší kvality než při z = 1 a 3
412
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ISD fragmenty
Pravidla fragmentace … dle relativní pevnosti vazeb.
Typické produkty fragmentace peptidů:
c, y, z
H2N - CH - C -
OR
1
NH - CH - C -
OR
2
NH - CH - C -
OR
3
NH - CH - COOH
R
4
x3
a
1
y3
b
1
z3
c
1
x2
a
2
y2
b
2
z2
c
2
x1
a
3
y1
b
3
z1
c
3
H+
413
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ISD. Analyt: 20 pmol KGF analogu. Matrice: kyselina sinapová. Laser: N2.
(V. Katta, D. T. Chow, M. F. Rohde Anal. Chem., 70, 4410 -4416, 1998.)
414
409
410
411
412
413
414
70
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
ISD
Analyt: oxidovaný B řetězec hovězího inzulinu
Matrice: thiomočovina
Laser: Er:YAG (l = 2936 nm)
(http://medweb.uni-muenster.de/institute/impb/research/hillenkamp/publicat/abs-cm99.html)
415
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PSD fragmenty
Typické produkty fragmentace peptidů: a, b, y, z, d.
Doprovodné píky –17 (ztráta NH3) a –18 (ztráta H2O).
Immoniové ionty aminokyselin.
Interní ionty – zejm. od Pro ve směru C konce
(B. Spengler J. Mass Spectrom. 32, 1019-1036, 1997)
416
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
immoniové ionty aminokyselin:
417
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PSD, zdroj: B. Spengler J. Mass Spectrom. 32, 1019-1036, 1997
418
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
PSD bombesinu, zdroj: Bruker Daltonics, GmbH 2000
419
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další typy disociace
Electron capture dissociation, ECD
Zubarev, R. A.; Kelleher, N. L.; McLafferty, F. W. Electron Capture
Dissociation of Multiply Charged Protein Cations - a Nonergodic Process
J. Am. Chem. Soc. 1998, 120, 3265-3266.
McLafferty, F. W.; Turecek, F. Interpretation of Mass Spectra; Fourth ed.;
University Science Books: Mill Valley, CA, 1993.
Poskytuje odlišné, často komplementární fragmenty ve srovnání s CID a
PSD
420
415
416
417
418
419
420
71
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vyhodnocení MS/MS spekter peptidů
Manuální a semiautomatická dedukce sekvence
• lokalizace iontových sérií typu b a y (doprovodná série a)
• identifikace immoniových iontů
• identifikace vnitřních fragmentů
• interpretace komplikována výskytem dalších fragmentů
• ne každý peptid po štěpení trypsinem ma má R a K na C-konci (nespecif.)
... stanovení sekvence neznámého peptidu z CID je často nemožné
Automatické stanovení sekvence
• MS/MS spektrum neznámého peptidu porovnáno s databází počítačem
vygenerovaných spekter všech možných peptidů, které mají hmotnost
prekurzoru
• algoritmus Sequest (J. R. Yates III et. al., 1994)
... mnohem úspěšnější než deduktivní přístup
421
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Sekvenování proteinu
Postup
1. Enzymatické štepení
tvorba více druhů digestů, aby vznikly různé, překrývající se štěpy
- různě dlouhá doba štěpení
- různé enzymy (trypsin, V8)
- nahodilé štěpení, “shotgun sequencing”
2. Zjištění (alespoň částečné) sekvence štěpů
RPHPLC ESI MS/MS
3. Dedukce sekvence pomocí počítače
celková sekvence stanovena z kombinace sekvencí peptidu
422
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Pomocné metody při sekvenování
Hydrolýza proteinu v H2
18O
zjištění terminálu: C-terminál nebude označen
Hydrolýza proteinu ve směsi H2
18O a H2
16O (1:1)
1. MS: dublety tryptických štěpů (vyjma fragmentů s C-koncem proteinu)
2. MS/MS: oba dubletové píky peptidu vybrány jako prekurzor pro MS/MS;
pouze štěpy obsahující C konec peptidu budou ve formě dubletu ...
přehlednější spektra
Esterifikace (methylace) karboxylových skupin peptidu
m = +14 / karboxylovou skupinu (-COOH → -COOCH3)
porovnání spekter původního a methylovaného peptidu
obdobná technika založena na derivatizaci aminoskupin peptidu
Pozn. 1: výměnná reakce však může probíhat i na C terminálu
Pozn. 2: vznikají složitější izotopové paterny s hmotnostmi M (2x16O), M+2
(1x16O,1x 2x18O) a M+4 (2x18O).
423
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Sekvenování proteinu
Př.: využití různě dlouhé doby
štěpení se značením terminálu.
Zjištění terminálu:
hydrolýza v H2
18O
(C-terminál nebude označen)
Pozn.: výměnná reakce však
může probíhat i na C terminálu
HK
čas:
424
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Detekce mutací
Detekce záměny nebo absence aminokyselin(y) v řetězci proteinu
Postup:
1. Enzymatické štěpení
2. Analýza spekter
- chybějící peptidy
- nadbytečné peptidy
3. MS/MS analýza neznámých (nadbytečných) peptidů a jejich srovnání s
normálními proteiny/peptidy, analýza posunu píků
425
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Post-translační modifikace (PTM)
• modifikace po přenosu RNA → protein uskutečněném na ribozomu
• nedají se objasnit na základě znalosti genomu
• souvisejí významně s funkcí proteinu
• popsáno více než 200 typů PTM (databáze Delta Mass)
• často pouze malá část proteinu modifikována  citlivost
• vyžaduje selektivní izolaci peptidů s modifikovanou aminokyselinou
• vazba mezi peptidem a mod. skupinou často slabá
426
421
422
423
424
425
426
72
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Post-translační modifikace (PTM)
Běžné PTM:
• fosforylace
• glykosylace
• acylace (acyly mastných kyselin, acetyl)
• připojení glykosylfosfatidyl inositolu
• produkty proteolýzy
• karboxylace (kyseliny glutamové)
• deamidace asparaginu a glutaminu
Některé modifikace mohou být značně složité, např. oligosacharidové
modifikace glykoproteinů (mnoho druhů cukrů a mnoho míst proteinu, na
která se cukry mohou navazovat – O, N). K objasnění slouží kombinované
metody používající MSn a enzymatické štěpení (N-glykosidáza, Oglykanáza
atd.).
427
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fosforylace
• reversibliní PTM související s regulačními mechanismy v buňce
• monoesterická vazba skupiny kyseliny fosforečné k hydroxylu v bočním
řetězci
1. serinu (167 Da)
2. threoninu (181 Da)
3. tyrosinu (243 Da)
MS/MS identifikace fosforylace
1. Ztráta H3PO4 (neutral loss scan: 98 Da)
obvykle poskytuje též iont [M+H-98]+
2. Detekce iontu PO3
- (79 Da) v negativním modu
skenování výchozích látek pro m/z (produkt) = 79
Další neg. ionty: H2PO4
- (97 Da), PO2
- (63 Da)
3.Posuny píků fragmentů v MS/MS spektrech
⎯ NH ⎯ CH ⎯ C ⎯
O
R
HO ⎯ P ⎯ OH
O
O
428
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fosforylace
Postup při identifikaci:
1. Příprava proteolytické směsi peptidů (obsahující fosfopeptidy)
2. Oddělení fosfopeptidů např. HPLC, CE, afinitní chromatografií, např.
Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC), viz. Porath, J. Protein
Expression Purif. 1992, 3, 263.
3. MS/MS analýza fosfopeptidů
Relativně stabilní monoesterická vazba
 posun píků v MS/MS spektrech (m = + 80 Da)
aminokyselina M (zbytek) M (monoester H3PO4)
serin 87 167
threonin 107 187
tyrosin 163 243
429
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: ESI MS/MS oligopeptidu s monofosforylovaným serinem
Phe Gln Pse Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys
y15 y14 y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b2 b3 b4 b5 b6
Phe Gln Pse Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys
y15 y14 y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b2 b3 b4 b5 b6
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000
m/z0
100
%
x2.5
y15
y14
y13
y12
y11
y10
y9
y8
y7
y6
y5
y4y3
y1
MH2
2+ H3PO4
MH2
2+
pSer
b2
y2
b3 b5
b6b4
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 1900 2000
m/z0
100
%
x2.5
y15
y14
y13
y12
y11
y10
y9
y8
y7
y6
y5
y4y3
y1
MH2
2+ H3PO4
MH2
2+
pSer
b2
y2
b3 b5
b6b4
-
430
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př.: ESI MS/MS oligopeptidu s monofosforylovaným serinem
Zdroje informací:
1. Molekulární píky MH2
2+ a (M - H3PO4)H2
2+, rozdíl m = 98 (m/z = 49)
2. b-ionty: m/z (b3-b2)= 167
3. y-ionty: m/z (y14-y13)= 167
(kredit: K. R. Jennings)
Phe Gln Pse Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys
y15 y14 y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b2 b3 b4 b5 b6
Phe Gln Pse Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asp Glu Leu Gln Asp Lys
y15 y14 y13 y12 y11 y10 y9 y8 y7 y6 y5 y4 y3 y2 y1
b2 b3 b4 b5 b6
431
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Aplikace: Analýza S-S můstků. Proteiny. MS databáze.
DNA, sacharidy, syntetické polymery.
Spektrometrie iontové mobility (IMS). Zobrazovací
hmotnostní spektrometrie (MSI).
MS izotopových poměrů, preparativní MS
11
432
427
428
429
430
431
432
73
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analýza disulfidových můstků
cystein (-SH) → cystin (-S-S-), intra- a inter- molekulární můstky
Počet cysteinů – pomocí alkylace cysteinu
• např. alkylace jednoho cysteinu vinylpyridinem zvýší hmotnost proteinu o
105 Da  počet cysteinů = m/105
Lokalizace cysteinů v proteinovém řetězci
Enzymatické štěpení a rozdělení digestu na 2 alikvoty:
1. alikvot ... MS analýza
2. alikvot ... redukce -S-S- (např. dithioerythritolem) a následná MS analýza
Porovnání 2. spektra s 1. spektrem:
1. m = 2 Da  peptid s intramolekulární -S-S- vazbou
2. první pík zmizí, dva další s nižší m/z se objeví  intermolekulární
můstek mezi 2 peptidy
Znalost sekvence aminokyselin (MS-MS) umožní přesnou lokalizaci -S-Smůstků
v proteinovém řetězci.
433
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vliv S-S můstků při ESI-MS
Struktury lysozymu (b−sheet a a−helix)
stabilizovány 4 S-S můstky
Redukce 1,4-dithiothreitolem (DTT)
odstraní S-S můstky

„Unfolded“ protein s více obnaženými
bazickými rezidui aminokyselin

Vyšší počet nábojů iontu
HK 434
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Obnažení bazických
reziduí aminokyselin a
„unfolding“
apomyoglobinu
HK 435
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
CA=carbonicanhydrase,Cy=cytochrome
Valaskovic,G.A.;Kelleher,N.L.;McLafferty,
F.W.Science1996,273,1199.
Příklady: nanosprej MS
436
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Nekovalentní interakce
• Interakce s nízkomolekulárními ligandy (+ionty kovů), jinými proteiny,
oligomery atd.
• Není vždy jasný vztah mezi výskytem komplexu v (g) a (l)
• Komplexy disociují během ionizace a MS analýzy
Př.
1.Komplexy hovězího hemoglobinu se stabilizují ve formě tetrameru
vazbami (cross-linking) s glutaraldehydem (přemostění mezi lysylovými
rezidui). Poté MALDI MS (viz obr. dále)
2.ESI pro komplexy proteinu s ligandy (např. metaloproteiny s léky) díky
šetrné ionizaci, která sotva stačí k odstranění vody. Obtížnější je výzkum
interakce mezi 2 proteiny – použití měkkých extrakčních podmínek,
příhodných podmínek pro tvorbu komplexů v roztoku
437
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Tetramer
známý z roztoku
HK438
433
434
435
436
437
438
74
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vědecké databáze na internetu
Uvedené databáze jsou pouze příklady, ne plný výčet.
NCBI (National Center for Biotechnology Information)
database Medline: www.ncbi.nlm.nih.gov
Scirus: www.scirus.com
ScienceDirect: www.sciencedirect.com
Databáze pro organickou chemii
NIST Chemistry WebBook (NIST)
Spectra Online (ThermoGalactic)
Spectral Data Base System, SDBS (NI AIST)
439
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vědecké databáze na internetu
Internetové zdroje pro identifikaci proteinů pomocí MS metod
• Eidgenossische Technische Hochschule (MassSearch)
www.cbrg.inf.ethz.ch
• European Molecular Biology Laboratory (PeptideSearch)
www.mann.emblheidelberg.de
• Swiss Institute of Bioinformatics (ExPASy) www.expasy.ch/tools
• Matrix Science (Mascot) www.matrixscience.com
• Rockefeller University (PepFrag, ProFound) prowl.rockefeller.edu
• Human Genome Research Center (MOWSE) www.seqnet.dl.ac.uk
• University of California (MS-Tag, MS-Fit, MS-Seq) prospector.ucsf.edu
• Institute for Systems Biology (COMET) www.systemsbiology.org
• University of Washington (SEQUEST)
thompson.mbt.washington.edu/sequest
440
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Vědecké databáze na internetu
Další odkazy:
UMIST (pepMAPPER) wolf.bms.umist.ac.uk/mapper
European Molecular Biology Laboratory, Heidelberg (PeptideSearch)
www.narrador.embl-heidelberg.de
Scripps, ThermoFinnigan (Sequest) fields.scripps.edu/sequest/
Proteometrics (MS/MS Sonar) www.proteometrics.com
Proteinové (peptidové) databáze
Genpept – NCBI GenBank
NBRF - National Biomedical Research Foundation
Swissprot - Swiss Institute of Bioinformatics
Owl - Leeds Molecular Biology Database Group
Delta Mass - databáze posttranslačních modifikací proteinů
441
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další pomůcky na internetu
Pomůcky
MS-Comp – návrh možných kombinací aminokyselin, tabulka hmot
dipeptidů
MS BLAST 2 – krátké sekvence (6 aminokyselin)
BLAST a FASTA – proteinové homology
GlycoSuite DB, GlycoSciences - analýza sacharidů
Další programy
Kalkulátory hmotností (GPMaw, SHERPA, PAWS, MW Calculator)
aj.
442
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MS nukleových kyselin a oligonukleotidů
• Ionizace: obvykle vyšší výtěžek negativních iontů. Analýza typicky
v negativním módu.
• Ionizační technika: MALDI (obvykle IR MALDI)
• Méně úspěšná než v případě proteinů a peptidů
• Vyšší stupeň fragmentace a více aduktů
• Důkladné odsolení … prevence tvorby četných aduktů se sodíkem, větší
problém než u peptidů.
• MALDI těžkých DNA (>100 kDa): lineární přístroj, IR laser, pulsní extrakce
443
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MALDI MS nuklevých kyselin a oligonukleotidů
Typické matrice
3-hydroxypikolinová kyselina
2’,4’,6’-trihydroxyacetofenon
pikolinová kyselina
Typické aplikace
• charakterizace syntetických a biologických oligonukleotidů (stanovení m)
• analýza produktů PCR, analýza mutací (záměna bazí)
• DNA sekvenování
- Sangerovo sekvenování (klasická metoda)
- Sekvenování pomocí exonukleázy
- Fragmentace (v plynné fázi)
444
439
440
441
442
443
444
75
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MS nukleových kyselin a oligonukleotidů
• MALDI MS spektra velmi těžkých NA (>2 tisíce nukleotidů)
• správnost určení m < 1% ... nejlepší ze současných metod
• výborná citlivost metody: < 1 fmol
Berkenkamp, S; Kirpekar, F; Hillenkamp, F Science 1998, 281, 260-262.
445
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
IR MALDI MS ribonukleové kyseliny
HK
446
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Sekvenování NA pomocí exonukleázy a MALDI MS
Zdroj: Juhasz, P.; Roskey, M. T.; Smirnov, I. P.; Haff, L. A.; Vestal, M. L.;
Martin, S. A.; Anal. Chem. ; 1996; 68(6); 941-946
447
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Fragmentace oligonukleotidů v plynné fázi
Schéma fragmentace oligonukleotidů v plynné fázi a značení fragmentů
O ⎯⎯ P ⎯⎯ O
O
OH
B2B1
HO O ⎯⎯ P ⎯⎯ O
O
OH
O ⎯⎯ P ⎯⎯ O
O
OH
B3 B4
OH
w3
a1
x3
b1
y3
c1
w2
a2
w2
b2
x2
c2
w1
a3
x1
b3
y1
c3
z1
d3
z3
d1
y2
d2
448
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analýza sacharidů
• Měkké ionizační metody: MALDI, ESI. MSn pro stanovení sekvence a
struktury
• Přídavek soli – tvorba iontů kationizací, tvorba aduktů [M+Na]+
• Použití enzymů k částečnému štěpení sacharidů před MS analýzou
• Běžné monosacharidy: glukóza, manóza, galaktóza, fukóza, Nacetylglukosamin,
N-acetylgalaktosamin a N-acetylneuraminová kyselina
(sialic acid).
• Stanovení úplné struktury oligosacharidů je obtížnější než u proteinů a
nukleových kyselin
- důsledek izomerické povahy stavebních kamenů a jejich možného
větvení.
- k objasnění struktury nestačí jen znalost stavebních jednotek a jejich
pořadí, ale též způsob větvení, poloha větve a optická konfigurace
každé glykosidické vazby
449
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Nomenklatura MS/MS oligosacharidů
• Nomenklatura MS fragmenty s nábojem na neredukující straně: A, B a C;
fragmenty s nábojem na redukující straně X, Y a Z podle toho zda štěpí
hruh nebo glykosidickou vazbu.
• Spodní index u fragmentů B, C, Y a Z iontů udává počet rozštěpených
glycosidických vazeb, horní levý index u fragmentů A a X udává vazby,
které byly rozštěpeny. Spodní indexy a, b atd. udávají štěpenou větev u
větvených sacharidů.
• Fragmenty B, C, Y a Z spolu s rozdílem hmotností lze použít k určení
sekvence a větvení.
• MS umožňuje určení optické izomerie glykosidické vazby. Metoda je
založena na selektivní oxidaci CrO3 b-anomeru derivatizovaných hexóz
za vziku ketoesteru.
450
445
446
447
448
449
450
76
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MSn oligosacharidů
Ion fragments produced upon (a) MS 2 , (b) MS 3 and (c) MS 4 of
permethylated maltoheptaose.
Zdroj: Weiskopf, A. S.; Vouros, P. and Harvey, D. J. Rapid.
Commun. Mass Spectrom. 1997, 11, 1493–1504.
451
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MSn oligosacharidů
452
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 453
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MSn oligosacharidů
454
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MSn oligosacharidů
455
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
MSn oligosacharidů
MSncharacterizationoftheHexNAc5Hex5–Iisomer
fromchickenovalbumin.(a)MS3–m/z1169.5→
937.7→,(b)MS4—m/z1169.5→937.7→1333.7→
456
451
452
453
454
455
456
77
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Lipidy
Mastné kyseliny, acylglyceroly, deriváty cholesterolu, fosfolipidy a
glykolipidy
FAB, DCI (desorpční chemická ionizace) MALDI
Negativní mód ([M-H]- ionty)
Fragmentace
fosfolipidový anion
fragmenty sacharidů
457
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Analýza syntetických polymerů
MALDI TOFMS
vysoká Mmax, jednoduchá spektra, počet nábojů z = 1
alternativa GPC
Analýza
Stavební jednotka (monomer)
Koncové skupiny
Absolutní molekulová hmotnost
Polydisperzita (střední m, rozptyl m)
Komplikace
Tvorba aduktů s Na+, K+
Hmotnostní diskriminace … ionizační i detekční účinnosti = f(m)
Správná transformace z časové do hmotnostní domény
Příklad: Carman Jr, H.; Kilgore, D.; Eastman Chemical Company, USA,
ASMS 1998
458
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Zdroj:Esser,E.etal.Polymer2000,41,4039–4046
459
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Spektrometrie iontové mobility
Ion mobility spectrometry (IMS)
1970 Cohen, Karasek
Charakteristika
• Technika na pomezí hmotnostní spektrometrie a elektroforézy
• Separace v důsledku tření iontů s okolním prostředím
• Ionty neseparovány podle m/z, ale podle své mobility
• Dokáže rozlišit i izomerii nebo počet nábojů (odlišná migrace M+ a M2
2+)
• Ve srovnání s MS je rozlišení IMS nízké
• V praxi často použita jako jedna z technik multidimenzionální analýzy,
např. ve spojení s běžnou MS; lze použít jako náhradu separace;
časově vhodně odstupňované: separace: >s, mobilita: >ms, MS: <ms
Aplikace
• bezpečnost (výbušniny), vojenské aplikace (jednoduchá přenosná
zařízení)
• studium konformace látek (malé molekuly, proteiny...) v plynném stavu
460
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Př. 1: IMS – Q
Driftová trubice: rovnováha elektrické a třecí síly
prstence s klesajícím napětím podobně jako v reflektoru
zvýšený tlak
p ~ 10 Torr (He, Ar, N2), E ~ 10-50 V/cm, l ~ 10 - 100 cm
Clemmer D. E., Jarrold M. F. J. Mass Spectrom 1997, 32, 577-592.
461
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
IM spektra lysozymu v
závislosti na jeho konformaci
Clemmer D. E., Jarrold J. F.
Mass Spectrom 1997, 32, 577-
592.
462
457
458
459
460
461
462
78
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Myung S. et al. Anal. Chem. 2003, 75, 5137-5145.
Př.: ESI - IT - IM - TOFMS digestu koňského albuminu
463
Př. 2: IMS – TOF
Odlišné řešení driftové trubice: průběh potenciálu na prstencích
připomíná pohyb mořských vln
Menší ionty (s vyšší mobilitou) „surfují“ ochotněji na „vlnách“ potenciálu a
dorazí na konec driftové zóny dříve
Kredit: waters.com
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 464
IMS - TOF
Triwave: ciprofloxacin, m/z = 332,141 Kredit: waters.com
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 465
Př. 3: DMS, FAIMS
Differential (ion) mobility spectrometry
Field assymetric waveform ion mobility spectrometry
- zařazení jednoduché cely před vstup do hmotnostního spektrometru
- různá konstrukční řešení cely
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 466
Využití IMS
• Separace izomerů, dle konformace
• Odstranění matrice vzorku
• Dostupné v kombinaci s vysoce rozlišujícím MS i MS/MS
• Multidimenzionální analýza
• Jednoznačnější identifikace
• Separace intramolekulárních protonovaných specií
• Studium místa protonace
• Rozdílné typy fragmenatce
• Výpočet kolizního průřezu
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 467
Zobrazovací hmotnostní spektrometrie, MSI
MSI ... mass spectrometry imaging
- přímá vizualizace bez derivatizace
- možnost MS/MS
- analyzátory: TOF (rychlost), FT-ICR a O (rozlišení)
- rozlišení: laterální, hloubkové a hmotnostní
- 3D MSI
Ionizační techniky (a limit laterálního rozlišení):
SIMS: nm
MALDI: mm
DESI: 100 mm
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 468
463
464
465
466
467
468
79
Laterální rozlišení v MSI
1873 Ernst Abbe:
difrakční limit
n sinθ numerická apertura (NA), ~ 1.4 - 1.6 v moderních mikroskopech
Abbeho limit d ~ λ/2 ~ stovky nm
Louis de Broglie (1929 Nobelova cena)
dualita částic a vlnění
Vis foton ... 400 - 800 nm ... 2 - 3 eV ... optická mikroskopie, LDI, MALDI
e-, Xe+ ... 5 keV ... 1 nm ... elektronová mikroskopie, SIMS
Pozn.: DESI MSI není limitována zaostřením částic ve vakuu
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 469
MSI
Stoeckli, M.; Staab, D.; Staufenbiel, M.; Wiederhold, K.H. Anal. Biochem., 2002, 311, 33-39
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 470
Hmotnostní spektrometrie izotopových poměrů
Isotope-ratio mass spektrometry, IRMS
• přesné měření poměrů „stabilních“ izotopů
• ideálně pomocí multikolektoru, tj. magnetického sektoru se současnou
detekcí více m/z
• ionizace: EI, TI, SIMS, ICP
• biovzorky: obvykle plynné analyty, spaliny vzorku aj. (H2, N2, CO2, SO2)
• standard pro C: Pee Dee Belemnite (PDB), vápencový fosilní belemnit,
13C:12C = 0.0112372
Příklady
1. radiokarbonová metoda datování, např. 14C
(b čítač, AMS – urychlovací MS)
2. určení původu biologického vzorku z izotopového poměru C (d13C)
metabolismus rostlin: C3 (85% rostlin: rýže, pšenice, brambory, řepa), C4
(kukuřice, třtina), CAM (pouštní rostliny)Hmotnostní spektrometrie biomolekul 471
Stanovení izotopových poměrů 13C:12C
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 472
Př.: Preparativní hmotnostní spektrometrie
A. L. Yergey, A. K Yergey: Preparative Scale Mass Spectrometry: A Brief
History of the Calutron J. Amer. Soc. Mass Spectrom. 8, 1997, 943–953.
Trocha historie:
1931 Ernest Lawrence: cyklotron – urychlovač protonů na 1 MeV
1938 Otto Hahn a Fritz Strassman: štěpení atomových jader
1939 anexe Rakouska a přepadení Československa, odliv mozků do USA
(Leo Szilard, Enrico Fermi, Edward Teller, Eugene Wigner)
2. 8. 1939 dopis Alberta Einsteina Franklinu D. Rooseveltovi
1. 9. 1939 začátek 2. světové války a emigrace
11. 10. 1939 dopis doručen prezidentovi
12. 10. 1939 E. Fermi - grant $3 000 na průzkum interakcí pomalých n0 s U
Alfred O. Nier připravil v MS vzorky 235U a 238U
John Dunning prokázal, že 235U je zodpovědný za štěpení
... položen teoretický základ jaderné bomby
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 473
Preparativní hmotnostní spektrometrie
1941 Projekt Manhattan - výroba atomové bomby, Oak Ridge, TN
1942 E. Lawrence: možnost použití modifikovaného cyklotronu pro separaci
izotopů
Calutron – California University at Berkeley + tron (instrument)
Homogenní magnetický sektor 180º
Až 208 g >85% 235U/den ve dvou stupních (přírodní zastoupení 0.72%)
Celkem 43 kg/bombu během 18 měsíců z > 5 tun přírodního uranu
Po r. 1945 na přípravu izotopů pro výzkumné účely
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 474
469
470
471
472
473
474
80
Schéma 2. stupněHmotnostní spektrometrie biomolekul 475
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 476
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 477
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 478
MS s ultravysokým rozlišením
konvence R hmotnostní analyzátor
standardní 1 000 – 10 000 Q, IT, LIT
vysoké 10 000 – 100 000 EB, TOF
ultravysoké 100 000 - … FT MS (ICR, O)
Pozn:
rozlišení, rozlišovací schopnost: viz stránky Terminologie MS
http://terminologie-ms.sci.muni.cz/
rozlišovací schopnost je funkcí m/z
rozlišovací schopnost vs. rychlost skenu (zvlášť pro FT-MS)
S/N roste s akumuací skenů (všechny MS)
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 479
Rozlišovací schopnost vs. m/z
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 480
R
0 1000 2000 3000 m/z
Důležitý je trend závislosti, nejen absolutní hodnota R
TOF
O: ~
1
𝑚/𝑧
FT-ICR: ~
1
𝑚/𝑧
475
476
477
478
479
480
81
Příklad specifikace komerčního FT-MS
Přístroj: Q-O-LIT (Q-Exactive)
Zdroj: ThermoFisher Scientific
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 481
Spektrum s ultravysokou R
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 482Zdroj: ThermoFisher Scientific
Ultravysoká R … nová dimenze v MS
Hmotnostní spektrometrie biomolekul 483
• Formula ID
• Isotope label
Zdroj: ThermoFisher Scientific
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Další témata
Fragmentace – chemie reakcí v plynném skupenství
Preparativní MS, soft landing
Izotopové zředění/obohacení, kvantifikace v MS
Ambientní ionizační techniky
484
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Otázky & konzultace
12
485
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Jan Preisler
312A14, Ústav chemie, UKB, Kamenice 5
tel.: 54949 6629, preisler@chemi.muni.cz
Aktualizovaný studijní materiál ke stažení ve formátu pdf:
IS nebo http://bart.chemi.muni.cz/courses/
Další konzultace v mé kanceláři.
Termíny zkoušek
Prosinec?
Leden.
Únor?
V. Otázky & konzultace
486
481
482
483
484
485
486
82
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Otázky
1. Srovnejte MALDI a ESI (výhody vs. nevýhody).
2. Co můžete říci o 2 různých spektrech téhož peptidu? (Počátek osy m/z
nezačíná v nule, měřítka os jsou různá.)
3. Pro 2 sousední píky téže látky v ESI-hmotnostním spektru byly změřeny
tyto hodnoty: (m/z)1= 1000.3 a (m/z)2 = 1500.1. Určete nominální m
analytu.
4. Doba letu iontu C2H8O2N+ v TOFMS je 14.8 ms. Jaká je hmotnost iontu,
který dorazil k detektoru za 8.94 ms? O jaký iont může jít?
5. Jaké veličiny mají vliv na rozlišení v TOF MS? Pozitivní nebo negativní
vliv?
6. Porovnejte citlivost IT a Q a) při záznamu spektra pro m/z = 0 - 1 000, b)
v režimu single ion monitoring, c) při produktovém skenu
m/z m/z
S S
487
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Otázky
7. Proč je výhodné použít při měření izotopového poměru daného prvku
přístroj, který stanovuje oba izotopy zároveň?
8. Lze použít kvadrupólový filtr ke stanovení proteinu o hmotnosti 30 000
Da?
9. Jakou ionizační metodu a jaký hmotnostní spektrometr navrhujete
použít k:
a)detekci výbušnin na letišti
b)sekvenování malých peptidů
c)semikvantitativnímu rychlému stanovení ~70 prvků v geologickém
vzorku
d)identifikaci elementárních nečistot v tenké povrchové vrstvičce vzorku
10. Jaký je původ lorentzovského profilu píků v FT-ICR-MS?
11. Jaká je vzájemná orientace ekvipotenciální hladiny U a vektoru intenzity
elektrického pole E?
12. Jaký bude rozdíl rychlosti dvou iontů o m = 100 a.m.u., z = 2, počáteční
rychlosti v01 = 100 m/s a v02 = 200 m/s po urychlení potenciálem 1 kV a
10 kV?
488
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Otázky
13. Existuje praktický limit maximální m/z TOF MS?
14. Srovnejte možná uskalí stanovení peptidů a oligomerů DNA pomocí
MS.
15. Váš úkole je analyzovat peptidy v polévce. Co nebudete přídávat do
polévky před MS analýzou? Jak polévku upravíte a jakou ionizační
techniku použijete?
16. Který z detektorů je vhodnější pro iontovou past: MCP, channeltron,
elektronový násobič, fotografická deska nebo Faradayův pohár?
17. Jaký je vliv časové disperze (tvorby iontů během delší doby) na
rozlišovací schopnost qTOFu?
18. Jaká je m aminokyseliny A, jejího rezidua (v peptidovém řetězci) a
jejího immoniového iontu?
19. MSI vs. IMS?
20. Popište krok po kroku postup identifikace izolovaného proteinu, máte-li
k dispozici a) MALDI TOF MS, b) ESI Q, c) ESI QqQ
489
Hmotnostní spektrometrie biomolekul
Otázky
19. Na grafu počtu peptidů vs. správnost měření m/z (metoda AMT, obr.
301) vysvětlete přítomnost plata mezi 200 a 700 ppm.
20. Srovnejte výhody a nevýhody 2DGE a kolonových separačních technik
v proetomice.
21. Které parametry hmotnostního spektra se mohou zlepšit, budeme-li
zaznamenávat signál z a) FT ICR MS, b) TOF MS, c) IT déle?
22. Proč je v hmotnostním spektrometru vakuum?
23. Co je nejvýznamnějším omezením rozlišení v MALDI TOF MS?
Vysvětlete princip technik vedoucích k vyššímu rozlišení MALDI TOF
MS.
24. Jaký je rozdíl mezi jednotkami u, Da a Th?
25. Jaký je rozdíl mezi energetickou a rychlostní disperzí iontů?
26. Ve které části TOFMS se tvoří analyticky významné fragmenty během
a) MALDI ISD, b) MALDI PSD?
490
487
488
489
490