1
Molekulová luminiscence:
Vybrané instrumentální techniky
Jan Preisler
312A14, UKB PřF MU
tel. 54949 6629
Přehled
2
• Detekce jediné molekuly/atomu
• Spojení separačních technik s luminiscenční detekcí
• Sekvenování DNA
• Fluorescenční mikroskop
3
Detekce jednotlivých atomů a molekul
Stanovení Na(g) laserovou rezonanční fluorimetrií
Fairbank, W. M. et al. J. Opt. Soc. Amer. 1975, 65, 199 - 204.
- Rezonanční fluoroscence - silná absorbce a fluorescence
- Výsledný detekční limit ~ desítky Na atomů/cm2
(v detekčním prostoru: < 1 atom)
4
Stanovení Na(g) laserovou rezonanční fluorimetrií
detektor (fotonásobič)
cela s Na(g)
paprsek
laseru
okno
čočky
222233
4
1
5
6
7
8
5
Zvýšení S/N
1. Modulace l barvivového laseru a detekce při modulační
frekvenci
2. Vstupní štěrbiny - omezení rozptýleného záření (+ laserový
paprsek)
3. Výstupní štěrbiny - omezení rozptýleného záření
4. Nakloněné výstupní okénko - odklonění světla (přirozený odraz)
5. Woodův roh - černé pozadí (neodráží zpět světlo)
6. Vymezení detekčního prostoru fokálním prostorem čočky
7. Čočka s dobrou kolekcí světla (velký prostorový úhel)
8. Citlivý detektor: fotonásobič, lavinová fotodioda - detekce v
režimu počítání fotonů (photon counting)
6
Fluorescenční detekce v kapiláře
Detekce jediné molekuly
- malé množství, ale objem též malý (c = n/V)
- prostorová filtrace: štěrbiny (excitace i emise)
- filtrace světla (l): fitry, hranoly, mřížky (excitace i emise)
- silný excitační zdroj s vhodnými směrovými vlastnostmi: laser
- kolekční optika s dobrou světelností
- citlivý detektor – fotonásobič, lavinová fotodioda
- silně fluoreskující molekula analytu – např. rhodamin G,
mnohanásobně derivatizovaná biomolekula analytu
- chemická amplifikace molekuly před detekcí
2
7
Příklad: schema sestavy CE LIF
detektorová
vialka
laser
mikroskopový objektiv
na posuvném držáku
štěrbina
zdroj
vysokého
napětí
injekční vialka
v karuselu
skříň
kapilára
fotonásobiččočka
filtry
stínítko
8
Konstrukce CE LIF
9
Výběr luminiscenčního barviva: spektrální vlastnosti
10
CE LIF: velmi nízké detekční limity
Analyt: Rhodamin B, c = 1x10-12 mol/l, excitace: 532 nm, 5 mW; emise: >
560 nm, kapilára: 50 mm i.d., 375 mm o.d., l = 30/37 cm, dávkování: U = 5
kV, ti = 10 s nebo Dh = 2cm, ti = 30s, separace: 0,02 mol/l fosfát v 10%
MeOH, pH 10; U = 10 kV
LOD ~ 2 x 10-13 mol/l ... ~102 molekul
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
t[s]
I[a.u.]
7
11
-0.00005
-0.00003
-0.00001
0.00001
0.00003
0.00005
0.00007
0.00009
300 350 400 450 500 550
t (s)
Absorbance,540nm
LOD: srovnání s absorbanční detekcí
Analyt: Rhodamin B, c = 1x10-5 mol/l (při obdobném dávkování)
12
Rhodamin B Rhodamin 6G
Rhodamin 123
Separace rhodaminových barviv
3
13
-32600
-32400
-32200
-32000
-31800
-31600
-31400
-31200
0 100 200 300 400 500 600 700 800
t (s)
Fluorescence(lib.jedn.)
1
2
3
4
Separace rhodaminových barviv
Píky: 1, 2 - Rh 123, 3 - Rh 6G, 4 - Rh B
14
Analýza obsahu jednotlivých buněk
Proč analyzovat jednu buňku?
Výsledkem klasické analýzy mililitrů krve (mnoho erytrocytů) je
průměrné složení. Analýza každé z buněk zvlášť může odhalit např. 1
pozměněný erytrocyt z 1000 (např. jiný poměr forem
laktátdehydrogenásy) … včasná detekce chorob (histogram).
Separaci + citlivá detekce
1. Vpravení buňky do kapiláry pod mikroskopem.
2. Uvolnění buněčného obsahu do pufru (destrukce buněčné membrány)
3. Separace (př: elektrolyt = laktosa + NAD + pH pufr). Separace
zastavena dříve než analyty opustí kapiláru.
4. Chemická amplifikace v přít. analytu: NAD+ + SubH « NADH+ + Sub
po delší dobu (~hodina).
5. Zapnutí elektr. pole, migrace produktů k detektoru.
6. Detekce NADH+
15
CCD a CID kamery
CTD
(Charge Transfer Device)
CCD CID
(Charge-Coupled Device) (Charge Injection Device)
CTD … polovodičový čip s 2-rozměrným polem fotocitlivých
elementů (pixelů)
16
Princip CTD
1. vznik náboje po absorbci fotonu
2. akumulace náboje (děr) v potenciálové jámě u negativně nabité
elektrody
3. přenos náboje (manipulací napětí na okolních elektrodách) k A/D
převodníku
-10 V -5 V
hn
+ -
++++
n-polovodič
izolant (SiO2)
elektrody (průhledný kovový film)
17
1. posun nábojů (celých řad) 2. posun náboje v řadě a jeho změření
• Velmi účinný přenos náboje mezi pixely (99,99999%)
• I pro stanovení náboje v jednom pixelu je nutno přečíst celé pole
• Destruktivní čtení (náboj neutralizován během čtení)
CCD
A/D převodník
18
CID
• Umožňuje náhodné adresování pixelů, lze číst pouze část pole
• Nedestruktivní čtení
• Pixel tvořen dvěma elektrodami s nezávislými přívody:
- akumulace náboje (+) pod 1. elektrodou pixelu
- převod náboje pod 2. elektrodu snížením jejího napětí
- změření změny napětí pod 1. elektrodou
- mnohanásobné opakování cyklu pro zlepšení S/N
- vypuzení náboje zvýšením napětí obou elektrod
4
19
Sdružování pixelů CCD (Binning)
Účel: dosažení vyššího S/N
• Definována podmnožina celého pole, např. 2 x 32 pixelů.
• Náboj naakumulovaný pod 64 sdruženými pixely přečten
najednou.
Zdroj a
zpracování
dat
1 pixel 64 pixelů
(měřených
zvlášť)
64 sdružených pixelů
(měřených najednou)
Zvýšení S/N 1 8 64
20
Typické parametry CTD
Počet pixelů: 1000 x 1000, (1 000 000, "megapixel")
Rozměry pole: 1 x 1 cm2, (tj. velikost pixelu: 10 x 10 mm)
Max. kvant. účinnost: 90% při určité vlnové délce
Rozsah vlnových délek: 200 - 1000 nm (kdy kvant. účinnost > 10 %)
Šum převodníku: 1 - 10 elektronů
Max. náboj: 106 elektronů
Zbytkový proud: < 10 elektronů/s (s chlazením)
+ velmi citlivý detektor (porovnatelný s fotonásobičem)
+ multikanálový detektor, náhrada fotografické desky
- obvykle relativně pomalý (množství dat)
21
Aplikace CTD
Spektroskopie
- absorpční, emisní
- plošný detektor za monochromátorem (pořadí pixelu = f(l))
Zobrazení (imaging)
- vzorku (mikroskop)
- paralelních vzorků (čip)
22
Sekvenování DNA
• Stanovení sekvence bazí v DNA
DNA  protein. DNA: dědičnost.
Lidská buňka: 46 chromozómů (22 párů + X/Y).
6 miliard bazí (haploid, poloviční sada - 3x109)
1953 Watson & Creek: model DNA.
1977 Sanger: enzymatická metoda
Maxam a Gilbert: chemická degradace
23
Amplifikace DNA
PCR (Polymerase Chain Reaction)
Sangerova metoda: Analyzovaná DNA = předloha pro syntézu
směsi fragmenů DNA se stejným počátkem ale různou délkou.
Separace fragmentů pomocí gelové elektroforézy. Detekce
radioaktivního záření nebo fluorescence.
předloha: 3'ATACGCATT5'
fragmenty: PT
PTA
PTAT
:
PTATGCGTAA
24
Analýza lidské DNA
1990 Human Genome Project (USA)
Cíl = kompletní analýza lidskeho genomu do roku 2003 (2005).
Znalost souvislosti mezi chorobou a geny  léčba a prevence
chorob.
Podpora nových technologií pro ultrarychlé a levné sekvenování.
3x109 bazí při rychlosti 1báze/s … 100 let
26. červen 2000 Craig Venter, Celera Genomics
- ukončení základní analýzy lidského genomu
- shotgun genomics
5
25
Základní techniky pro sekvenování DNA
1. Sangerovo sekvenování (PCR) - gelová elektroforéza (vrstva,
kapilára)
~ 1000 nukleotidů
2. Hybridizace - čip
3. Exonukleásová reakce
postupné odštěpování koncové báze
4. MS: fragmentace
pro krátké řetězce, < 50 nukleotidů
26
Elektroforéza v kapilárních polích pro
sevenování DNA
Analýza fragmentů DNA připravených Sangerovou metodou
Klasický postup
elektroforéza na vrstvě polyakrylamidového gelu
+ mnoho vzorků na jedné desce gelu (paralelní dráhy)
- časová náročnost (hodiny - den)
Kapilární elektroforéza
+ vyšší poměr povrchu substrátu k objemu gelu (kapilára versus deska) 
dokonalejší chlazení Þ vyšši elektrické pole Þ kratší doba analýzy
(hodina)
Gel: síťovaný polyakrylamidový gel
lineární nahraditelné gely (polyakrylamid, polyethylenoxid atd.)
- 1 kapilára = analýza pouze jednoho vzorku  kapilární pole
27
Uspořádání pro detekci fluorescence z
kapilárních polí
A. Skenovací
B. Zobrazovací (imaging)
A. Skenovací detekce
(R. A. Mathies et al. Electrophoresis 1994, 17, 1852 - 59)
Konfokální excitace a emise: zaostření pomocí mikroskopického objektivu.
Objektiv se pohybuje nad kapilárním polem napříč; frekvence ~ 2 Hz.
Uspořádání kapilár lineární nebo na obvodu válce.
+ účinná kolekce fluorescence
+ nízké nároky na výkon laseru (pouze jedna kapilára ozářena v čase)
- pouze zlomek času se stráví excitací a detekcí dané kapiláry (duty cycle)
- pohyblivé součásti
28
Schema konfokální fluorescenční detekce
paprsek
excitačního laseru
fluorescence
objektiv
kapilára (pole kapilár)
polopropustné
zrcadlo
29
Zobrazovací detekce (Imaging)
a) Excitace: laser zaostřen zvrchu na pole kapilár jako čára
Detekce: CCD kamera s filtry nad polem kapilár.
(E. S. Yeung et al. Anal. Chem. 1994, 66, 1424-31)
+ excitace a detekce současně pro všechny kapiláry
+ žádné pohyblivé součásti
- neúčinná kolekce fluorescence
- vysoké nároky na výkon laseru (výkon rozdělen mezi celé pole)
b) Excitace: optickými vlákny
Detekce: kolekce fluorescence optickými vlákny, monochromátor, CCD
(A. Zhang et al. Electrophoresis 1996, 17, 1841 - 51)
+ účinná excitace a kolekce fluorescence
+ žádné pohyblivé součásti
- vysoké nároky na výkon laseru (výkon rozdělen mezi celé pole)
- problémy pro mnnoho kapilár
30
Zobrazovací detekce (Imaging)
c) Excitace: laser zaostřen zboku (světelný vodič)
Detekce: CCD kamera s filtry nad polem kapilár.
(H. Kambara Anal. Chem. 1994, 66, 1021 – 26)
+ excitace a detekce současně pro všechny kapiláry
+ žádné pohyblivé součásti
+ nižší nároky na výkon laseru (paprsek se šíří skrz celé pole)
- neúčinná kolekce fluorescence
- ztráta zaostření a energie paprsku laseru při postupu polem
d) Excitace: laserem na konci kapilár
Detekce: CCD kamera oproti koncům kapilár
+ vhodné pro 2-rozměrná pole kapilár, vyšší počty kapilár
- problémy s nahrazováním gelu v kapilárách
6
31 32
Legenda k obrázkům
(a) On-column line-focusing detection (Ueno, K.; Yeung, E. S. Anal.
Chem. 1994, 66, 1424-31.3).
(b) Fiber-optic array imaging detection. (Quesada, M. A.; Zhang, S.
Electrophoresis 1996, 17, 1841-51).
(c) Multiple-sheath flow detection (Takahashi, S.; Murakami, K.;
Anazawa, T.; Kambara, H. Anal. Chem. 1994, 66, 1021-26.)
(d) Rotary confocal scanning detection (Scherer, J. R.; Kheterpal, I.;
Radhakrishnan, A.; Ja, W. W.; Mathies, R. A. Electrophoresis,
1999)
33
Sekvenování DNA na čipu
A. Čip jako náhrada kapilárového pole
B. Hybridizační pole na čipu
Čip (chip, microfluidic device, microfabricaed device)
Analogie s polovodičovými čipy ne zcela přesná.
• Miniaturní zařízení vyrobené podobnými technikami jako
polovodičové čipy (fotolitografie, laserová ablace) na vhodném
substrátu (sklo, Si, plast). Kontrastní fotorezisty pro submikronové
struktury.
substrát
hn hn
fotorezist
maska
nanesení
povlaku
expozice vyvíjení leptání a
odstranění
povlaku
Nové metody sekvenování DNA
• Next generation sequencing
• George M. Church, Harvard (později Life Technologies, nyní by
Thermo Scientific)
• 454 pyrosequencing (nyní Roche)
• Illumina (nyní Solexa)
• Ion Torrent semiconductor sequencing
• Heliscope single molecule sequencing (Helicos)
• atd. atd.
34
35
Fluorescenční mikroskopie
• obr. 34-46: výtah z Genova Lectures 2006
• http://www.fluorescence-foundation.org/2006_course.htm
36
In the compound microscope the Finite Corrected Objective Forms a Real Image At the
Ocular Front Focal Plane: The Primary or Intermediate Image Plane (IIP)
Conventional Optics
Objective with finite Focal Length
(Optical Tube Length, OTL, Typically 160 mm)
Mob = OTL/fob
Total Magnification = Mob x Moc = OTL/fob x 250mm/foc
7
37 38
Prisms Used to
Re-Direct Light
In Imaging Path
While Mirrors
Are Used in
Illumination
Path
E.D.Salmon
39
Camera
Camera Adapter
Binocular
Eyepiece
Beam Switch
Filter Cube
Changer
Slot for Analyzer
Slot for DIC Prism
Objective Nosepiece
Objective
Stage
Condenser:
Diaphragm&Turret
Centering
Focus
Field Diaphragm
Coarse/Fine
Specimen Focus
Filters
and Diffuser
Lamp: Focus, Centering
Mirror:
Focus and
Centering
Mirror:
Focus and
Centering
Focus, Centering
Trans-Lamp Housing
Epi-Lamp Housing
Epi-Field
Diaphragm
Epi-Condenser
Diaphragm
ShutterFilters& Centering
Slot for Polarizer
Upright Microscope
Stand
Body Tube
MICROSCOPE COMPONENTS
Magnification
Changer
Identify
Major
Components
And
Their
Locations
And Functions
Within
Modern
Research Light
Microscope
(See Salmon
And Canman,
2000, Current
Protocols in Cell
Biology, 4.1)
40
Key component: the objective
Achromats: corrected for chromatic aberration for red, blue
Fluorites: chromatically corrected for red, blue; spherically
corrected for 2 colors
Apochromats: chromatically corrected for red, green & blue;
spherically corrected for 2 colors
Plan-: further corrected to provide flat field
41
The 3 Classes of Objectives
Chromatic and Mono-Chromatic Corrections
E.D. Salmon
42
What is numerical aperture (NA)?
• Image Intensity: I ~ NAobj
2/Mtot
2
• Image Lateral Resolution for Corrected
Objective:
-Fluorescence: r = 0.61l/NAobj
-Trans-Illumination: r = l/(NAobj + NAcond)
8
43
Airy Disk Formation by Finite Objective
Aperture:
The radius of the Airy Disk at the first
minimum, r’, occurs because of destructive
interference; the diffraction angle, a, is
given by:
sin(a) = 1.22l/D, where D = diameter of
objective back aperture
E.D. Salmon 44
Why oil immersion lenses have greater resolution
D= 0.61 l cos a / n(NA)2
Low power, NA~ 0.25 D~ 8 m
Hi, dry, NA~0.5 D~ 2 m
Oil immersion, NA~ 1.3 D~0.4 m
45 46
Index of refraction
Brightfield Phase contrast
Normalized interference Darkfield
Brightfield
Darkfield
Fluorescence
47
Basic design of the epi fluorescence microscope
Objekt ozářen a snímán ze stejné strany
Filters