Souhrn 4. přednášky • Genetické metody – Plasmidy (kvasinkové elementy) – Integrace (plasmidy, PCR, kazety) – Analýza funkce ne-esenciálních genů – Tetrádová analýza Pomocí těchto genetických metod byly analyzovány metabolické dráhy, proteinové komplexy, evoluce biologických systémů … připravovány nové kmeny pro biotechnologie … řešeny otázky týkající se zdraví člověka Osnova 5. přednášky • Genetické metody – analýza esenciálních genů (ts mutanty) – mutageneze (“screen“) – genetické interakce • Buněčný cyklus – průběh a regulace BC – synchronizace buněk – mechanismy regulace párování – homothalické kmeny Esenciální geny - ne-esenciální gen – lze přímo deletovat/odstranit v genomu haploidní buňky (předchozí přednáška) - esenciální gen - Tetrádová analýza – ověření - plasmid shuffling - buňky potřebují funkční gen aspoň za určitých podmínek (kondicionální exprese) - hypomorfní mutanty - buňky potřebují aspoň „částečně“ funkční gen - ts mutanty - kondicionální mutanty URA3 x haploid haploid diploid kontrola bez uracilu + - +/- Plasmid shuffling Pokud je YFG1 esenciální musí být v deleční mutantě přítomna extra divoká kopie genu např. na URA3 plasmidu, který lze odstranit (pomocí FOA) – analýza terminálního fenotypu Na dalším plasmidu může být vnesena mutovaná verze yfg1 – její efekt se projeví až po odstranění plasmidu s divokou kopií genu (pomocí FOA) Lze připravit hypomorfní mutanty (včetně ts) Podobně lze použít ade2, ade3 systém s YFG1 wt genem na plasmidu s ADE3 (kolonie jsou červené díky ade2 mutaci) – po ztrátě plasmidu jsou sektory kolonii bílé (bez Ade3p enzymu je metabolická dráha blokována dříve než vzniká červený metabolit) Haruki et al, Mol Cell, 2008 Rychlé vyřazení proteinu z funkce protein je cíleně relokalizován tj. vyřazen z funkce (např. transkripční faktor je pomocí rapamycinového systému „vytažen“ z jádra – transkripce nebude spouštěna) ts mutanty - ts mutanty jsou výhodné pro studium funkce esenciálních genů – mutanty jsou funkční na permisivní (25°C) teplotě, ale nemohou dokončit buněčný proces vyžadující aktivní protein za restriktivní teploty (37°C) - ts mutanty = většinou nestabilní proteiny, které se při zvýšené teplotě denaturují/ztrácí aktivitu a jsou degradovány Dohmen et al.: Science, 1994 - ubikvitinace „označkuje“ proteiny pro proteasom (degradaci) ts alela DHFR je degradována (nestabilní protein – strukturní mutace) - fůze DHFR (ts alely) s heterologním proteinem => celý protein je na 37°C degradován - je možno využít pro přípravu ts mutantních kvasinek (fůze s CDC28 – kvasinky arestují v G1 fázi – sleduje se terminální fenotyp) Křížení – ověření - jedna mutace, meioticky defekt - rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.) Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách Ověření pravosti (mutant+delece) X supresor na plasmidu Izolace mutant Počet mutací nyní NGS ura, ts, rad … PCR genom sekvenace 1. 2. 3. Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách Izolace mutant dnes - NGS ura, ts, rad … 2. aB Ab AB ab ab Ab aB AB Ab aB ab AB + Ab aB AB Ab aB ab kombinace těchto mutací je synteticky letální - jedna mutace (segregace fenotypu) - rozdělení do komplementačních skupin - genetické vztahy mezi mutantami Segregace (počet) mutací (tetrádová analýza) Komplementační skupiny (diploid) Genetické interakce (genetické vztahy) (terádová analýza) WT Dvojité mutanty – funkční příbuznost stejný fenotyp – epistatický (funkčně příbuzné geny) aditivní až letální fenotyp - paralelní dráha, redundance suprese fenotypu - mutace může napravit původní defect A b C D e F A b c D E F Epistatický Letální Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách aB Ab AB ab ab Ab aB AB Ab aB ab AB + Ab aB AB Ab aB ab kombinace těchto mutací je synteticky letální A b C D E F suprese Příklad signálních drah (suprese – aktivací) Syntetická letalita v léčbě rakoviny Křížení – ověření - jedna mutace, meioticky defekt - rozdělení do komplementačních skupin (allelická kompl.) Kontrola závislosti na plasmidu na FOA plotnách Ověření pravosti (mutant+delece) X supresor na plasmidu Izolace mutant Počet mutací nyní NGS ura, ts, rad … PCR genom sekvenace 1. 2. 3. • Studium metabolických drah (URA, GAL …) • … flokulace, aglutinace (FLO, AGA …) • … sekrece, endocytózy, morfogeneze (SEC, END … ORB) • … mechanismu párování (STE …) • … vlivu záření na buňky … rad mutanty (např. RAD21, RAD50, RAD51) • … buněčného cyklu (CDC …) ředící řada WT Mut1 Mut2 rad51 mut γ-záření (budova A3) sec mutanty Verde, Mata, Nurse, JCB, 1995 - mutagenese S. pombe – hledání ts mutant (55 000 kolonii) s defektní morfologií – našli 64 kmenů (3 druhy defektu: 51 kulatých=orb, 8 tip elongation aberrant=tea, 5 banana=ban) - z 51 orb mutant křížených s WT segregovalo 43 v poměru 2:2 tj. jeden gen (8 sterilních), „linkage analysis“ mezi mutantami ukázala 12 orb genů (skupin – Tab.I) ... aktinový cytoskelet (polarizovaný růstu) Leland Hartwell začal studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae. - izoloval mutantní kvasinky s mutovaným genem - >100 genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28) - také sledoval citlivost kvasinek na poškození DNA radiací - zjistil, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal čas na opravu DNA Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe - v 70. letech objevil gen Cdc2 (homolog CDC28) - zodpovědný za regulaci většiny fází BC - v roce 1987 izoloval homologní lidský gen a nazval jej CDK1 (cyclin dependent kinase). Tim Hunt na začátku 80. let objevil první cyklin – cykliny jsou proteiny, které jsou syntetizovány a odbourávány (ubikvitinace) během určité části buněčného cyklu. Cykliny se váží na CDK a regulují jejich aktivitu. Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 Nobelova cena za výzkum buněčného cyklu v roce 2001 Leland Hartwell začal studovat buněčný cyklus v 60.letech na S. cerevisiae. - izoloval mutantní kvasinky s mutovaným genem - >100 genů kontrolujících buněčný cyklus (např. CDC28) - také sledoval citlivost kvasinek na poškození DNA radiací - zjistil, že BC je při poškození DNA zastaven – aby získal čas na opravu D Paul Nurse studoval buněčný cyklus na S. pombe - v 70. letech objevil gen Cdc2 (homolog CDC28) - zodpovědný za regulaci většiny fází BC … Nurse et al, MGG, 1976 Buněčný cyklus S. pombe - nestálé diploidní buňky vstupují do meiosy hned po konjugaci (ade6-M210xade6-M216) - pro konjugaci je kritická G1 fáze jako u S. cerevisiae S.pombe má rovnocenné dělení - vznikají buňky stejné velikosti – hned vstupují do S fáze (jsou dostatečně velké) – pro vstup do mitozy musí být dvojnásobná velikost (kontrola v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze) cdc2 Cortes et al, JCB, 2012 Hoffmann a spol, Genetics, 2015 http://www.genetics.org/content/suppl/2015/ 10/02/201.2.403.DC1 sekrece … aktinový cytoskelet jsou důležité pro procesy polarizace … v průběhu buněčného cyklu … mating/fusion … - Více prof. Svoboda S. pombe S. cerevisiae pučení … párování (shmoo) Buněčný cyklus S. cerevisiae - zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze - rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze - jádro se protahuje – začátek M fáze (mitózy) - mikrotubuly - oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1 - oddělená dceřiná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení– pro další dělení musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze Curr Opin Gen Dev 5 (1995) • Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) • Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Mikrotubuly (nocodazol) Synchronizace S. cerevisiae buněk - v úseku A jsou buňky „nedorostlé“ – elutriace (centrifugace dle velikosti buněk) – tzv. G0 synchronizace - v úseku B se rozhoduje o konjugaci - za přítomnosti alfa-faktoru (krátký syntetický peptid) dochází k zastavení buněčného cyklu – G1 synchronizace - HU inhibuje syntézu nukleotidů potřebných pro replikaci – synchronizace v S fázi - nocodazol blokuje polymeraci tubulinu – schází mikrotubuly pro mitózu – G2 synchronizace - ts mutanty různých CDC genů – různé fáze buněčného cyklu • Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“ mutanty) • Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických pro určitou fázi buněčného cyklu Mikrotubuly (nocodazol) Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - pro další dělení musí buňka v G1 fázi dosáhnout určité velikosti - při nedostatku živin arestuje v G1 nebo posléze přechází do stacionární fáze (vyčerpání živin) - nedostatek dusíku – růst pseudohyf - při nedostatku N a C (diploidní buňky) zastavují v G1 a zahajují meiosu/sporulaci - haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují Shlukování - párování - morfologie kolonii Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) Klíčovým mezníkem BC u S. cerevisiae je START, kdy se rozhoduje o přechodu z G1 do S fáze: - STARTovní interval lze rozdělit na úsek A a B - v úseku A se rozhoduje o přechodu do stacionární fáze (mutanty zastavené v této fázi nemohou konjugovat) - v úseku A hrají roli CDC25 a CDC35 (komponenty RAS dráhy - živiny) - v úseku B se rozhoduje o konjugaci či sporulaci (zastavení pomocí alfa-faktoru, nemůže být zvolena alternativa přechodu do stacionární fáze) - pro úsek B (a další „checkpoints“) je klíčový CDC28 (tj. CDK1) a příslušné cykliny A B G1 fáze - S. cerevisiae CDC28 a cykliny u S. cerevisiae Interakcí fosforylované Cdc28p s cyklinem vzniká aktivní komplex: - v G1 fázi Cln1p a Cln2p (CLN3 mRNA je konstantní) - pro vstup do S fáze jsou nutné Clb5p a Clb6p (transkripce stimulovaná CLN) - zahájení mitózy se účastní Clb3p a Clb4p - mitózu ukončují Clb1p a Clb2p a jejich degradace Nasmyth, Trends in Gen, 1998 Buněčný cyklus S. cerevisiae - detail - další CDC - fosforylace - ubiquitylace Checkpoints slouží buňce ke kontrole úplnosti či správnosti průběhu určité části buněčného cyklu či procesu – např. buňka nemůže nechat neopravené dvouřetězcové zlomy DNA nebo jiná poškození DNA (podle fáze buněčného cyklu opravuje různými mechanismy) Kolodner et al, Science (2002) Párování/mating kvasinkových buněk G1-A G1-B G1 - haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují … meiotické dělení - S. cerevisiae = a/alfa, S. pombe = h+/h- vytváří diploidní buňky (S. cerevisiae = stabilní, S. pombe = okamžitě sporulují) - párování doprovázeno zásadními změnami v morfologii meiosa mitosa Merlinietal,OpenBiol,2013 STE = sterile lokalizovanátranslace tvorba shmoo – polarizace aktinového cytoskeletu akumulace faktorů Merlinietal,OpenBiol,2013 fůze buněčných stěn – vytvoří se pór v cytoplasmatické membráně Signální dráha – α faktor Park at al, MMBR, 2007 Wang et al., Nature, 2004 STE = sterile transkripce ... příště Hay-Oak Park, MMBR, 2007 buňka využívá podobné „nástroje“ pro jiné programy (vláknitý růst) Chromosom III obsahuje: - MAT lokus - MAT a (HMR) kazeta - MAT α (HML) kazeta HML a HMR jsou tiché alely (heterochromatin) Co a1, a2 + α1, α2 kódují? (transkripční faktory) HO endonukleasa – výměna kazet v MAT lokusu (rozeznává specifické sekvence) Heterothalické – stabilní Homothalické – přepínají párovací typ Chromosom III Lee a Haber, Microbiol Spect, 2015 Přepínaní párovacího typu HO endonukleasa Přepínaní párovacího typu HMLα HMRa MAT CEN Chromosom III umlčená kopie umlčená kopie HO endonukleasa štěpí specifické sekvence v MAT lokusu - homologní rekombinace - záměna kopií Používá se pro vygenerování DSB a studium mechanismů opravy poškozené DNA LeeaHaber,MicrobiolSpect,2015 Přepínání párovacího typu Homotalické - HO endonukleasa je exprimována pouze v mateřské buňce v G1 fázi (dceřinná si uchová původní typ) Heterotalické – nemají funkční HO endonukleasu Chant,CurrentOpinioninCellBiol,1996 homotalické Asymetrická lokalizace Ash1p Current Opinion in Cell Biol 8 (1996) -Ash1p represor je asymetricky lokalizován do dceřiné buňky, kde blokuje transkripci HO- endonukleasy - Není do ní sekretován, ale dochází k expresi (translaci) asymetricky lokalizované mRNA - (translace RNA na specializovaných ribozomech asociovaných s cytoskeletem Příprava aneuploidních buněk KAR1 gen potřebný pro karyogamii tj. pro fuzi jader a::HIS3 + a::kanMX => a::specifické promotory rezistence pouze v (a) haploidních buňkách Studium vlivu aneuploidie na buňku (u člověka se podílí na kancerogenezi, aneuploidie v 90% lidských nádorů) Torres et al, Science, 2007 Aneuploidie způsobuje genomovou nestabilitu - rakovina Shelzer et al, Science (2011) - aneuploidie ve >90% rakovinných buněk - je genomová nestabilita důsledkem aneuplodie nebo je aneuploidie důsledkem genomové nestability?