Osnova přednášky • Základní charakteristiky kvasinek - Taxonomie, evoluce - Podmínky růstu, růstové formy, sporulace ... • Morfologie buněk, kolonií... -Amoniak -Aglutininy, flokulace -Adhesiny, invasiny - Killer toxiny Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do domény (nadříše) Eukarvota, říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy) Bakterie Kvasinka Četnost v lidském mikrobiomu 99% <1% Velikost buňky 1um 10um Buněčná stěna peptidoglykan, LPS, LTA chitin, mannan (PPM, PLM), glukan pH 6,5-7,5 4,5-6,5 Teplota 10-80 20-30 Rezistence na antibiotika Ne Ano Přenos genetického materiálu Jádro Ano Ne Ne Ano LPS - lipopolysacharid, LTA- lipoteichoová kyselina PPM - fosfopeptidomannan, PLM - fosfolipomannan Taxonomie kvasinek - Kvasinky se řadí do domény (nadříše) Eukarvota, říše hub (ačkoliv jsou to mikroskopické jednobuněčné organizmy) - netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu (nemožné je jednotně definovat) - roztroušeny ve dvou odděleních hub: houby vřeckovytrusné nebo stopkovytrusné (asko-, basidio- a deuteromycetes + kvasinkové mikroorganismy) - 1500 identifikovaných (odhad o několik řádů vyssi) Saccharomyces cerevisiae: nadříše > Eukarvota říše > Funai (houby) ■?ukcn>-0Lc multicellular photosynitasíze norwnotile sexual eukoryoilc multicellular ingest rr-.Ď! In - sexual - trukAryůlic m-uHucallulor íibSůrli noci motile oddělení > Ascomycota (vřeckovýtrusé) pododdélení > Ascomycotina třída řád čeleď rod druh („laboratorní kmen") > (hemi) Ascomycetes > Saccharomycetales (kvasinkotvar > Saccharomycetaceae > Saccharomyces > Saccharomyces cerevisiae I wikipedie Hedges, Nat Rev Genet, 2002 Kvasinky netvoří žádnou přirozenou taxonomickou skupinu - jsou roztroušeny ve dvou odděleních hub, buď jako houby vřeckovytrusné nebo stopkovytrusné pododdělení/třída: oddělení: i—Pezizomycotina (47,000 spp.) _p—Saccharomycotina (300 spp.) '— Taphrinomycotina (120 spp.) _ i—Urediniomycetes (8,000 spp.) |_r-Ustilaginomycetes (1,500 spp.) Hymenomycetes (20,000 spp.)_ -Gbmales (160 spp.) -Zygomycetes/Mucorales (700 spp.) -Chítňdiomycota (900 spp.) říše hub: Ascomycota (47.420 spp.) Basidtomycota (29.500 spp) .670 ± 70 1,090: 80 Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes 1.140 ± ' 30 1.2101 110 „ ... ., . Eurotiomycetes SpSgSfs) (plectomycetes) PentcMtum clrysogenum [penicillin fungus) Coccktiokies imm'ftis (coccidioidomycosis Tung us) Fusarium gramtnearum Sordariomycetes (head scab fungus) Neurospora crassa (orange bread mould) Magnaporthe grisea (rice blast fungus) Yarrovm lipolytica (yarrowia yeast) (pyrenomycetes} Saccharomycotina (Hemiascomycetes) i—I Saccharomyces cerewsiae _a^± (baker's yeast) 60 r .970 ± 90 l_ Taptirinomycotina (Archiascomycetes} 03 C O o E o N N (D Q. Hedges, Nat Rev Genet, 2002 1—I Aqaricus bisporus Cryptococcus neoformans Tremellomycetes, Candida albicans (pathogenic yeast) Scbizosaccbaromyces pombe (fission yeast) Pneumocystis carina (pneumonia fungus) Mcrobotryum violaceum Urediniomycetes — (anther smut fungus) Ustiiago maydis Ustilaginomycetes (com smut fungus) Pnanerochaene Hymenomycetes chfysospofium (white rot fungus) o o CG O O >, E o 'td en co -Q Taxonomie kvasinek Většina využívaných kvasinek je z třídy (hemi)ascomycetes mezidruhová vzdálenost Dujon, TiG, 2006 % E H V. i 03 -*—> O Ü E o o (/) < Euascomycetes Arch iascomycetes Basidiomycota Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces paradoxus Saccharomyces mikatae Saccharomyces kudnavzevii Saccharomyces bayanus Saccharomyces exiguus Saccharomyces servazzii Saccharomyces castellii Candida giabrata Zygosaccr-aromyces ron\:i A Kkiyveromyces thermototerans -M Kluweromvc.es waitii 1 Saccharomyces kluyven 4Kluweromvces lactis Kluyveronryces marxianus —-4 Ashbya gossypii Pichia angusta Debaryomyces hansenii Pichia sorbitophjla Candida guiliiermondii Candida lusitaniae Candida tropicalis Candida paiapsilosis Candida albicans Candida dubliniensis Yarrowia lipolytica Pivo, víno Chleba Lidský Patogen Xerotolerant Využívá laktózu Rostlinný Patogen Halotolerant Lidský Patogen Využívá alkany rody: Saccharomyces Kazachstania Naumovia Nakaseomyces Zygosaccharomyces Lachancea Kl uyveromyces Eremothecium Clade 2 Clade 1 (Neurospora, Magnaporthe, Aspergillus. Podospora, etc) Schizosaccharomyces pombe Cryptococcus neoformans Pivo Lidský patogen Srovnání průměrné % shody sekvence proteinů v taxonech Hemiascomycotina a Chordata Vychází převážně z analýzy rDNA; nověji srovnáním rozdílů sekvencí aminokyselin v ortologních proteinech. Přes velkou morfologickou podobnost vykazují kvasinky velké rozdíly v genomech Genomy (sekvence) kvasinek ze vzdálenějších větví fylogenetického stromu se id srovnávají těžko Yarrowia lipolytics Debaryomyces hansenii Kluyveromyces lactis ■ m 50- IJ 60 Candida glabrata ■ 70 Saccharomyces uvarum-** 80 90 - Saccharomyces paradoxus —»-- Saccharomyces cerevisiae—100L Ciona intestinalis Takifugu rubripes Tetraodon negroviridis Gallus gallus Mus musculus Homo sapiens Dujon, TiG, 2006 % odlišnost sekvence proteinů: - S. cerevisiae a C. glabrata ~ člověk a ryba - mezi druhy S. sensu stricto ~ mezi řády savců - proteiny člověka a hlodavců jsou si více podobné (lze rekonstruovat změny, jimiž genomy během evoluce od společného předka prošly) než proteiny druhů ze skupiny sensu stricto, mezi nimiž mohou vznikat životaschopné hybridy! rozdn mezj s c a s je cca 300MYA Potřebují vodné prostředí, kyslík a živiny volná voda (nikoli chemicky vázaná) - Vodní aktivita = volně přístupná voda/fyziologicky využitelná voda = available water (aw) aw = poměr tlaku vodních par nad substrátem a tlaku par destilované vody 0,95: Pseudomonas, Escherichia,....většina bakterií 0,85: kvasinky (Candida, Torulopsis, Hansenula) 0,75: většina halofilních mikroorganismů 0,65: xerofilní plísně (Aspergillus) 0,4: potlačení růstu veškeré mikroflóry Q 0 Debaryomyces hensenii Bakterie vyžadují vyšší hodnoty a^víc dostupné vody) než kvasinky a plísně (z toho důvodu např. chléb napadají plísně, nikoliv bakterie) Aktivitu vody lze snížit proslazováním nebo solením (marmelády, nasolování masa ... lze takto potlačovat i růst bakterií v kvasinkových izolátech) Xerotolerantní kvasinky rostou i za zvýšeného osmotického tlaku - (a^=0.65), rod Zygosaccharomyces (rouxii, bailii, bisporus) - rostou prednostne v potravinách s vysokým obsahem cukru či solí; ostatní (S. pombe, Debaryomyces hensenii, Hansenula anomala) vyšší osmotický tlak tolerují, ale lépe rostou za standardních podmínek (více polyolů, ATPázové pumpy), Lipomyces mají pouzdro - při zvýšené koncentraci solí upravují jeho složení Test: schopnost růstu na 50-70% glukose (většina pouze do 40 %) nebo na 10% NaCI Podmínky růstu - kyslík - Většina kvasinek je obligatórne aerobní (vyžadují aspoň stopová množství kyslíku nezbytné pro syntézu některých esenciálních metabolitů - ergosterol, nenasycené mastné kyseliny) - fermentativní typy (Saccharomces c, S. p.) - pro fermentaci jsou vhodnější anaerobní podmínky, ale S.c. i v aerobních podmínkách fermentují - respirativní typy - převládá energeticky výhodnější respirace nad fermentací - nefermentativní typy (nemají alkoholdehydrogenásu -neprodukují ethanol) - rody Lipomyces, Cryptococcus, Saccharomycopsis - teploty, při nichž mohou kvasinky růst: - mezofilní (0 - 48 °C) - většina druhů - psychrofilní (-2 - 20 °C) - voda, půda v Antarktidě (některé Leucosporidium, Cryptococcus) - termofilní (ne méně než 20 °C) - potenciální patogeny (Candida, Cyniclomyces) Maximální teploty, které (některé) kvasinky přežívají, se pohybují kolem 57-59 °C Laboratorní podmínky 25-30 °C (S.c. i S.p. - rostou i při 15°C a přežívají krátkodobě 50°C), teplotně senzitivní mutanty (ts, 37°C), chladově sensitivní mutanty (cs, 20°C), živiny • Nejčastějším zdrojem uhlíku a energie jsou mono-, di- a oligosacharidy (některé jsou schopny hydrolyzovat i polysacharidy jako škrob, xylany či celulózu ... nebo methanol (Pichia pastoris), alkany (Y lipolytica) apod. • Nejpreferovanějším cukrem S.c. je glukóza (represe ostatních) • Zdrojem dusíku jsou amonné ionty a aminokyseliny Laboratorní podmínky: YPD/YES - bohaté médium = 10g/I yeast extract, 20g/l pepton, 20g/l dextrose (2%glukosa)/u S.pombe supplements: A, U, H, L, K Sabouraudův agar (1892) = 10g/I pepton, 40g/l dextrose (4%glukosa), 20g/l agar, pH 5.6 Syntetické SD médium = 6.7g/l yeast nitrogen base w/o amino acids (aminokyseliny se přidávají dle potřeby), 20g/l dextrose (2% glukosa) - např. SD-L,T pro Y2H systém Minimální agarová půda = 5g/l (NH4)2S04, 1 g/l KH?S04, 0,5g/l MgS04 x7H20, 10g/I glukosa, 1 ml/l WicKerhamův roztok, 20g/l agar Wickerhamův roztok: 0.2mg biotin, 200mg inositol, 20mg riboflavin, 40mg thiamin, 40mg pyridoxin, 20mg kyselina p-aminobenzoová, 40mg kyselina nikotinová, 0,2mg kyselina listová (na 100ml vody) Forsburg and Rhind, Yeast, 2006 - Živiny určují morfologii/buněčnou formu - kvasinková nebo houbová (pseudohyfy) nebo sporulace ... - limitování klíčových živin spouští různé vývojové odpovědi - zdroje uhlíku a dusíku jsou monitorovány signálními dráhami o o CL Carbon Rich Poor Pseudohypha Grq,y$p Sporulation B Sporulace/meiosa Mutant Phenotype Gain of CCM Loss of CCM r Glucose Elongator MAP Kinase Hoglp Ste20p Ste11p Ste7p ^^^^^^^^ Dig1/2p Ste12p Ted p Clnlp Flo11p Nitrogen Nitrogen Discrimination Complex Colony Morphology Rim15p CCM - complex colony morphology Granek and Magwene, PLoS Genet (2010) Kvasinková forma - morfologie - za běžných podmínek (bohaté C i N zdroje) převládá kvasinková f. - rotační elipsoid, kulaté, protáhlé - rod Dipodascus až 130 mikrometrů - 3-15 mikrometrů (bakterie30% buněk v populaci) LP = low penetrance (<30% buněk v populaci) co o C\l O GQ c CD Q. O co >> CO X cytokinese & transkripce (RNA pol, mediator, SAGA) Kvasinková forma - morfologie visualní analýza kvasinek deleční knihovny -3500 kmenů (1. genome-wide) - např. delece genů regulujících buněčnou polaritu S. pombe způsobovaly oválný tvar buněk rounded buněčná stěna (a) —- o miss E miss V miss weak V long HP long LP long Br rounded stubby curved small skittle stubby Í * ft > buněčná stěna a aktin krátké/tlusté curvecl ■V' \ ff ^■* w «J mikrotubuly co o 8íí. n • * •> Iv* 1 w\* • • • / Ca_mfg1&i # \ v ••: ■*).-■ ».t. B Pseudohyp [*]• hal Grow • th • Bio g film 0 • • • • n □ □ • • s nn O O Q Phenotypic Score -7 0 0 Phenotypic Score ■■■ -26 0 26 - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (invasivní růst, pseudohyfy, biofilm, flokulace) - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - Flo8, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Flo11, FI08, Mfg1 faktory jsou konzervovány . a podílí se na invasivních vlastnostech (virulenci) patogenních kvasinek C. albicans Ryan et al, Science (2012) FLOH RIMW1 RPD3 FLO8 SIN3 TEC1 RXT2 MSS11 MIT1 MFG1 SPE1 SPE2 "* SPE3 SPE4 Biofilm Pseudohyphal F • • • • • • • • F sfllA t □ • • • • dig /A • • * • • • • sok2b HE • • • • Score adhesin - FI08, Mfg1 jsou TF aktivující transkripci Flo11 - Dig1 je represor transkripce Flo11 - FL011 = adhesin (glykoprotein - faktor důležitý pro uchycení - buněčná adhese je důležitá pro všechny specifické morfologie (... biofilm, flokulace) Ryan et al, Science (2012) 10 -7 Relative FLGíípr-GFP expression 0 0.3 o.B o.-g 1.2 1.5 1.Ů 1 m/sin i E i H ■ ca* . 1 -> Flokulace reverzibilní schopnost kvasinek shlukovat se, tvořit větší celky (vločky, floky); odpověď na stres flokulace je významná vlastnost využívaná např. při produkci piva (snižuje náklady na filtraci Diva) flol- FL01+ -ovlivněno složením média, genetickou výbavou kmene (skupina FLO genů), teplotou, stavbou a morfologií buňky ... - Flolp váže manany na povrchu buněk stejného druhu (S.c.) => agregace - NewFlo váže manosu i glukosu => glukosa v mediu inhibuje agregaci -teprve po přeměně cukrů na etanol se važe na buněčnou stěnu ostatních buněk a dochází k vločkování Smukalla a kol., 2008, Cell Verstrepen, 2006, Mol. Microbiol aglutinin Yeast surface display - His-His-His-His-His-His (chelatuje Ni, Cu, Co kovy) -GTS1 transkripční faktor spouštějící aglutinaci pod CUP1 promotorem (další přednášky) - biosorbce & sedimentace GPMH6/pMCGl (I0OU.M CuS04) - hybrid Aga2 (aglutininy nebo Flo1 ...) s testovaným proteinem - exprese eukaryotních proteinů v kvasince (podobné mechanismy ... posttranslační modifikace) - knihovny lidských cDNA (i protilátek z pacientů) - využití i pro biotechnologie - vychytávání těžkých kovů (dekontaminace) Kuroda et al, Appl Microbiol Biotechnol (2002) Pepper et al, CCHTS (2008) YSD - testy antigen/protilátka - v kvasince je exprimována knihovna (např. IgG klonů) - na kuličkách je navázán antigén - opakováním vychytávání dojde k nabohacení (i slabších interakcí) Boder et al, Arch Bioch Biphys (2012) Pseudohyfy, adhesiny ... a candidalysin Kvasinky C. albicans jsou schopny se přichytit k epiteliálním buňkám hostitele (pomocí adhesinů - Hwp1) - invasiny (Als3 a Ssa3 mohou interagovat s receptory) se podílí na vnoření pseudohyfy do buněčné membrány hostitele - Ece1 je rozštěpen Kex2/Kex1 proteasami na peptidy (Golgi), které jsou sekretovány a vytváří (peptid III) póry v cytoplasmatické membráně (jako bakteriální toxiny) Mitchell, Nature, 2016; Moyes et al., Nature, 2016; Los et al, MMBR, 2013 Killer toxiny Některé kmeny S.cerevisiae produkují tzv. killer toxiny (proteiny a glykoproteiny sekretované do prostředí), které jsou letální pro citlivé kvasinky i bakterie; ekologická výhoda (výhoda pro vinaře - nepřerostou je cizorodé kmeny) Poprvé analyzováno v roce 1963 (Makower a Bevan) kvasinky zabíjí podkladový kmen (K1=laboratorní, K2 a K3=vinařské kvasinky) Kvasinky ze stejné skupiny se navzájem nezabíjí (preprotoxin ...) Geny jsou kódovány na dsRNA obalené ve „virus-like particles" (VLP, připomínají savčí dsRNA viry) - kódují obalové, replikační proteiny (ale potřebují buňku k replikaci ...), transkripční sekvence a toxin Samotné VLP nejsou infekční (nejsou uvolňovány z buněk - lze je přenést konjugací buněk nebo fůzí protoplastů) ani toxické (preprotoxin v původní buňce interaguje/inaktivuje maturovane/sekretované toxiny) Toxin je sekretován a váže se na buněčné stěny (p-1,6-glukany) -způsobuje perforace/póry v cytoplasmatické membráně - ztráta iontů, potenciálu ... buňka hyne - Kluyveromyces lactis, Pichia membranifaciens - lineární dsDNA (v cytoplasmě, pGK11), bez kapsidy, toxin se váže na chitin (chitinásová aktivita) - Hansenuia mrakii... - geny na chromosomech, toxin inhibuje syntézu p-1,3-glukanu (v místě růstu pupenu) Table 2. Killer activity of P. membranifaciens CYC 1086 and CYC 1106 against yeasts and fungi of biotechnological interest Sensithc Mraiii Killer activity Sensitive strain Killer activity Sensitive strain Killer act ivity 1086 1106 1086 1106 1086 1106 S. cerevisiae SGV — — B. bruxellensis 1D007 3 + — Pichia anomala 1114T — — S. cerevisuie CEC - - B. bruxellensis DO 13 1 + - Vidua tnetnbranifaciens CYC 1070 2 + - S". cerevisuie VRB — 3 + B. britxellensis DO 14 1 + - Aspergillus spp. 27 - - 5. cerevisiae NEM - - B. bruxellensis DO 15 1 + - A. carbonarius B MUM - - S. cerevisiae 2056 - 2 + B. bruxellensis DO 17 2 + - A. orchraceus - - S. cerevisuie BM45 — 3 + B. bruxellensis DO 18 1 + - A. oryzae - - 5. cerevisiae 2323 - - B. bruxellensis DO 19 1 + - A. lubingensis - - .S", c er e visiac ALB — 3 + B. bruxelletisis D027 1 + - Fusarium cuhnorum - - S. cerevisiae SLO — 4 + B. bruxellensis D028 1 + - F. grtiminearum NRRL 28525 - - S. cere\isiae VN - - B. bruxellensis D029 2 + - F. graminearum NRRL 29020 - - 5. Cťrťví'síííc 71B - 4 + B. bruxellensis D031 1 + - F. pone - - 5. cerevisuie CS2 - 1 + B. bruxellensis D032 1 + - F. proliferation MM 1-2 2 + - 5. cerevisiae CM - - B. bruxellensis D033 1 + - F. proliferatum MM 3-1 2 + - S. cerevisiae HAY - - B. bruxellensis D035 2 + - F. proliferatum MM 6-2 - - S. cerevisiae F S - 3 + B. bruxellensis D036 1 + - F. reticulloides MM 6-3 - - S. cercvfsioe 16 — - B. bruxellensis D038 1 + - F. reticulloides MM 7-3 - - S. cerevisiae 17 - 3 + Debaryomyces hansenii 1021 - - F. sporotrichoides ITEM 550 - - 5. cerevisuie 18 - 3 + D. hansenii 1244 - - Botrytis cinerea 20003 - 3 + S. cerevisiae 19 - - D. hansenii 10388 - - B. cinerea 20004 - 1 + S. cerevisiae SCI — 4 + D. hansenii 10386 — - ß. cinerea 20005 - 2 + ■ F 1 1 1 ú 1 i i f ff ■ O v i w é - Kontaminace vinných kultur kmenem Brettanomyces bruxellensis může být potlačena Pichií membranifaciens - Význam při ochraně průmyslových kmenů (proti kontaminaci - odolné vůči toxinu a zabijí kontaminanty) - v léčbě (některé S.c. killer kmeny zabíjí kmeny Ca., C. podzolicuszab\\\ C.n.) ' Santos et al., 2009, Microbiology