• Regulace transkripce
– Přepínání párovacího typu
– Regulace transkripce specifických genů
– Gal4 transkripční faktor
• Hybridní systémy
– transkripční hybridní systémy
– alternativní kvasinkové hybridní systémy
Osnova
Párování/mating kvasinkových buněk
G1-A
G1-B
G1
- haploidní buňky v přítomnosti partnera zastavují v G1 fázi a konjugují
- párování doprovázeno zásadními změnami v morfologii (dynamické)
- haploidní vs diploidní buňky (stav buněk)
Signální dráha – α faktor
Park at al, MMBR, 2007
Wang et al., Nature, 2004
STE = sterile
GPCR –> G-proteiny
Ren et al., Science, 2000
ChIP on CHIP - Ste12p transkripční faktor
Chromosom III obsahuje:
- MAT lokus
- MAT a (HMR) kazeta
- MAT α (HML) kazeta
HML a HMR jsou „tiché“
alely (heterochromatin)
Co a1, a2 + α1, α2
kódují? (transkripční
faktory)
HO endonukleasa –
výměna kazet v MAT
lokusu (rozeznává
specifické sekvence)
Heterothalické – stabilní
Homothalické – přepínají
párovací typ
Chromosom III
Specifita párovacího typu je kódována MAT lokusem
Regulace transkripce v haploidních buňkách
a1, a2 + α1, α2 - transkripční faktory, které ovlivňují transkripci 3 skupin genů
a-spec.= MFA1,2 (a-feromon), STE2 (α-receptor), STE6, 14 (úprava a sekrece feromonu)
α-spec.= MFα1,2 (α-feromon), STE3 (a-receptor), STE13, KEX2 (proteasy)
haploid spec.= STE4,18 (podjednotky G-proteinu), RME1 (inhibitor meiosy), HO, NEJ1, LIF1
aSG ON
αSG OFF
haploid SG ON
MAT lokus Typ buňky Geny kontrolované MAT lokusem
a haploida1, a2
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
diploidα1, α2
a1, a2
aSG OFF
αSG OFF
haploid SG OFF
α2
α1
α2a1
Lee a Haber, Microbiol Spect, 2015
α haploidα1, α2 aSG OFF
αSG ON
haploid SG ON
α2
α1
Struktura promotorů
Kvasinkové promotory se liší od bakteriálních a vyšších eukaryot (kvasinky
netranskribují z takových promotorů – kvasinkové plasmidy …)
- většina míst pro iniciaci transkripce obsahuje TC(G/A)A a PuPuPyPuPu motivy
(specifické pro kvasinky)
- TATA box (TATAT/AAT/A) je 60-120bp od iniciačního místa (podobné Pribnowovu
boxu u bakterii)
- UAS (upstream activating sequences) a URS (upstream repressing sequences)
- DAS (downstream activating sequences – přímo v sekvenci genu)
Represor
na URS
Aktivátor
na UAS
konstitutivní
Johnston et al., MCB, 1994
- glukosa reguluje transkripci GAL genů na různých úrovních:
- blokuje Gal3 (induktor) a Gal2 (permeasu), GAL4
- reprimuje transaktivaci Gal4 transkripčním aktivátorem a ovlivňuje Mig1
represor (URS) v promotoru GAL1 genu
- Gal80 blokuje Gal4 aktivační doménu (galaktosa zablokuje pouze Gal80)
aktivátor
inhibitor Gal4p
induktor
Regulace transkripce GAL genů
Chr. II Mig1
represor
Gal4
GAL4 gen kóduje transkripční faktor
(aktivátor), který se váže na UAS GAL1,
GAL7, GAL10 …
Regulace metabolické dráhy galaktózy
Hittingeretal.,PNAS,2004
Johnston,MMBR,1987
dál pokračuje
metabolismus glukózy
Ren et al., Science, 2000
ChIP Gal4p
microarray po galaktose
FUR4 zvyšuje množství uracilu pro UDP-Gal
MTH1 potlačuje transport glukosy (zlepšuje příjem gal)
PCL10 potlačuje glycogenezi (maximalizuje zisk z gal)
/GAL5
Rozdíly v utilizaci galaktózy
Hittingeretal.,PNAS,2004
- různé kvasinky využívají různé cukry (viz přednáška o určování kvasinek)
- S. cerevisiae, S. paradoxus, S. mikatae, S. bayanus, S. castellii, S. kluyveri, a
K. lactis využívají galaktosu – mají všechny GAL geny
- S. kudriavzevii, C. glabrata, K. waltii, a E. gossypii nemohou využívat galaktosu
(GAL geny jim chybí – úplná ztráta – nebo je mají nefunkční = Pseudogeny)
název GAL
podle screenu
- mutanty
neschopné
utilizace
galaktosy
(vyřazení
jednoho genu
znemožní
kvasince GAL
metabolismus)
GAL4 -
transkripce
evolucepříště
Transkripční aktivátor Gal4p
UAS
Luban a Goff, CO Biotech, 1995
Ptashne a Gann, Science, 1997
Vznik 1-hybridních systémů
- Takto funguje např. i FASAY (Functional Analysis of Separated Alleles in Yeast)
pro testování mutantních p53 (transkripční faktor)
Různé transkripční faktory mají podobné domény a lze je kombinovat …
Lze hledat DNA-vazebné proteiny pro danou UAS sekvenci (AD-hybridní knihovny)
Grochová et al., Oncology Reports, 2008
mut p53 (duplikace 30bp)
kvasinka opravila
Ade2 reporter genUAS
transkripcep53
wt
Ade2 reporter genUAS
p53
mut
- stanovení aberací p53 v klinickém materiálu - imunoanalýza, FISH, sekv. p53
- určení funkčního statutu - stanovení transaktivačích schopností p53 metodou
FASAY (functional analysis of separated alleles in yeast) - stanovení
transaktivačních vlastností p53 prostřednictvím speciálně upraveného
kvasinkového kmene Saccharomyces cerevisiae yIG397
Analýza funkčních vlastností p53
luciferáza
D-luciferin + O2 oxyluciferin + světlo
Toxikologické aplikace
RECETOX/CETOCEON
(Dr. Čupr/prof. Holoubek)
Bartos et al, Env Tox, 2006
V tomto systému byly
testovány různé polutanty –
efekt na „estrogenní“ dráhu
Transkripční aktivátor Gal4p
UAS
Luban a Goff, CO Biotech, 1995
Ptashne a Gann, Science, 1997
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
BD a AD domény lze zaměnit
plasmid
(TRP1)
plasmid
(LEU2)
velmi citlivý (3AT)
velmi stringetní
semikvanitativní (β-gal)
Gal4 systém
různé promotory
Klasický Y2H systém
Nejčastěji používaný kmen PJ69-4a
MATa trp1-901 leu2-3,112 ura3-52 his3-200
gal4∆ gal80∆
LYS2::GAL1-HIS3 GAL2-ADE2 met2::GAL7-lacZ
kvantitativní
auxotrofie
(media bez …)
FACSorting
rezistence
(media s aureob)
Reportérové geny
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
Nature (2000) p. 623
Y
X
DBD
AD
Mat a buňky
8x12 jamek
(96 na misku)
Všechny ORF
Mat α buňky
Y
X
Reporter genGAL1 UAS
transkripceDBD
AD
Kvasinkový „INTERACTOME“
Místo transformací dvou plasmidů do
jedné buňky byly BD plasmidy v α
buňkách a AD v a buňkách –
párováním byly vytvořeny jejich
kombinace
Reversní systém (Y2H)
- při použití URA3 reportéru lze použít toxickou 5-fluoro-orotátovou
kyselinu (5-FOA) k negativní selekci tj. interakce povede k záhubě
kvasinek, zatímco mutanty neschopné interakce na FOA plotnách
porostou (mutanty nebo syntetické látky) TIBTECH (1999) p. 374
Huang a Schreiber, PNAS, 1997
FK506 inhibuje vazbu proteinu FKBP12 na TGFβ-receptor
(životaschopnost na FOA plotnách)
Inhibitory proteinových
interakcí
A
B
A-B
A
B
A-B
Split-hybrid systém
Shih et al, PNAS, 1996
represor
bez represoru
Klasický dvoj-hybridní systém
Troj-komponentní (dvoj-H) systém
– heterotrimerní proteinové komplexy
- posttranslační modifikace
Dvoj-hybridní systém
- proteinový inhibitor interakce
Troj-hybridní systém
– RNA interakce
- ligand/receptor
Hybridní RNA molekula
Analýza vazby protein-RNA (Y3H)
SenGupta et al, PNAS, 1996
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a RNA-vazebný protein (MS2 virový coat protein)
2. RNA molekula složená z TAR (HIV trans-activation response element) a MS2
sekvence
3. AD-Gal4 a trans-activation protein Tat (váže TAR)
Vazba ligand-receptor (Y3H)
FK506
Licitra et al, PNAS, 1996
dexamethasone
Tři hybridní/fůzní konstrukty:
1. DB-Gal4 a glukokortikoid receptor
(váže dexamethason)
2. Organická sloučeniná obsahující
dexamethason a FK506 (v médiu)
3. AD-Gal4 a FKBP12 (váže FK506)
CytoTrap 2-hybridní systém
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje
RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti
- jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý
(interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě)
Broder et al, Cur Biol, 1998
alternativní Ras hybridní systémy
Stynen et al, Microbiol Mol Biol Rev, 2012
Kvasinkový cdc25-2 ts mutant – lidský hSOS (guanine exchange factor) aktivuje
RAS pokud je ukotven na membránu v jeho blízkosti (A)
- jeden partner je myristylován (signální sekvence) a ukotven na membránu a druhý
(interakční) partner je fuzován k hSOS – spustí Ras dráhu (roste i na vyšší teplotě)
(B) – savčí konstitutivně aktivní Ras protein (bez signální sekvence pro ukotvení) je
fůzován s proteinem, který interaguje s partnerem ukotveným v membráně (spustí
se Ras dráha a cdc25-2 kvasinky rostou i na vyšší teplotě)
alternativní G-protein hybridní systémy
Kvasinkový ste18∆ mutant nereaguje na αferomon
– Ste18p fůzovaný s jedním
partnerem a druhý je ukotvený na
membráně - silná interakce nedovolí
asociaci Ste18 a Ste4 a nespustí se signální
dráha (buňky rostou za přítomnosti α-
feromonu)
Ste18
Ste4
Ste18 Ste4
vhodný pro analýzu disrupce
Johnsson et al, PNAS, 1994
Stynen et al, MMBR, 2012
Komplementace proteinů
Interakcí dvou partnerů dochází ke komplementaci
eGFP na povrchu kvasinkové buňky (ukotveno
pomocí fůze s Aga2 aglutininem) – buňky mohou být
vytříděny pomocí FACS
Interakcí dvou partnerů dochází
ke komplementaci ubikvitinu –
původní verze založena na
Western blot detekci –
adaptováno pro kvasinky se
selekcí na klasickém principu
(reportérového genu)
Bruckner et al, IJMS, 2009
Přehled kvasinkových PPI biotechnologií