Patogenní kvasinky Prof. MUDr. Augustin Svoboda, CSc. Biologický ústav LF MU Kvasinkové patogeny Ø Candida Hansenula Cryptococcus Torulopsis Ø Malassezia Geotrichum Ø Trichosporon Saccharomyces Ø Rhodotorula Ø Ø onemocnění kvasinkami a plísněmi – mykózy Ø Ø70 – 90 % onemocnění kvasinkami jsou kandidózy Øpočet druhů působících jako etiologické agens a účastnících se patologických procesů u člověka, se zvyšuje Ø ØForma a závažnost infekce závisí na: Ø -infekčním agens (druh, množství) Ø - způsobu a bráně infekce Ø - stavu imunitního systému hostitele Ø ØKvasinky jsou komenzálové člověka ØVyvolají endogenní infekci (autoinfekci) při porušení homeostázy, zvýšení infekcionity a změny rezistence na léky Ø Øpovrchové mykózy – nakažlivé Ø ØPovrchové mykózy : Ø Ø- postihují kůži, nehty, sliznici úst a pochvy Ø- původ: většinou endogenní, přenos i pohlavním stykem ØPříklady: Ø Candida (albicans) – komenzál Ø Malassezia furfur (kožní infekce pityriasis versicolor) Systémové mykózy (mykózy postihující vnitřní orgány a orgánové systémy) ØPůvodci: Cryptococcus, Candida Øimunodeficientní pacienti Øpacienti po transplantaci Ø ØVlastnosti patogenů: Mannan (stěnový polysacharid) u kandid a mukopolysacharid pouzdra u Cryptococcus neoformans – potlačují buněčnou imunitu Ø Ø Diagnostika: Ø Økombinace klinického pozorování a laboratorního vyšetření Ø ØLaboratorní vyšetření: lmikroskopický průkaz lkultivační průkaz lsérologické metody Ø Ø Ø Ø Ø Mikroskopický průkaz Ø povrchové mykózy - šupinky kůže, části nehtů, seškrab kštice s vlasovými kořínky a kožními šupinami Ø kandidóza – stěry sliznic Ø systémové infekce – vzorky tkání z více míst Ø Øpřímá mikroskopie: Ø- ve vlhkých preparátech po natrávení tkáně 10-20% hydroxidem draselným Ø- infekce sliznic – Gramovo barvení Ø- morfologie buněk Øhistologické vyšetření Kultivace Ø- většina kvasinek snadno kultivovatelná -Sabouraudův agar Ø (glukóza, sladinový agar, hydrolyzát kaseinu + chloramfenikol nebo amikacin + vankomycin) -Czapek – Doksův agar Ø Ø- současně při 25 – 30°C a 37°C Ø- doba kultivace 1 – 5 dnů ØDalší diagnostické přístupy: Ø- kvašení cukrů a další biochemické testy Ø (identifikační soupravy) Ø Ø auxanogram – test na asimilaci cukrů a dusíkatých látek Ø zymogram – test na zkvašování cukrů Sérologie ØPrůkaz specifických protilátek: Øprotilátková odpověď obecně slabá Ø Ø- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay), technika stanovení koncentrace antigenů nebo protilátek. Principem této metody je imunoenzymatické reakce bezbarvého (chromogenního) substrátu, který je hydrolyzován v barevný produkt a lze měřit spektrofotometricky Ø Ø Antimykotika: Ø kvasinky - eukaryontní buňky – běžná antibakteriální antibiotika jsou tedy neúčinná Toxický účinek na hostitele) – kvasinky a plísně jsou eukaryotické buňky , strukturou a metabolizmem jsou podobné buňkám lidským Ø lTerčové struktury antimykotik: Ø buněčná stěna Ø plasmatická membrána Ø cytoskelet Ø RNA Ø Ø lTerčové struktury antimykotik: Ø buněčná stěna – glukan, mannoproteiny, chitin Ø plasmatická membrána Ø místo cholesterolu obsahuje ergosterol Ø cytoskelet - kvasinky neobsahují intermediální Ø filamenta Ø RNA narušení syntézy bílkovin ØPřehled antimykotik: Ø ØImidazolová antimykotika Ø Ovlivňují cytochrom P-450, netvoří se tak ergosterol Ø Zástupci: Ø Ketokonazol − široké antimykotické spektrum (dermatofyty, kandidy, dimorfní houby, indikace:systémové mykózy a vaginální mykózy Ø Klotrimazol Ø Triazolová antimykotika Ø Flukonazol Ø ØPolyenová antimykotika Ø váží na ergosterol plasmatické membrány a způsobují její perforace. Působí hlavně na kvasinky a plísně Ø Zástupci: Ø Amfotericin B − hlavně na kvasinky, plísně a prvoky, Ø Nystatin − antimykotikum k lokálnímu užití. Ø ØOstatní systémová antimykotika Ø Griseofulvin − váže se na mikrotubuly a blokuje mitózu Ø Flucytosin - inhibuje syntézu RNA a DNA a biosyntézu a sekundárně Ø syntézu proteinů Ø Mechanizmy účinku flucytosinu •Flucytosin se intrafungálně převádí na cytostatický fluorouracil , který prochází dalšími kroky aktivace a nakonec interaguje jako 5-fluoruridinetrifosfát s biosyntézou RNA, čímž narušuje tvorbu určitých esenciálních proteinů. • •Flucytosin také podléhá přeměně na 5-fluorodeoxyuridinmonofosfát, který inhibuje syntézu fungální DNA. Ø Ø Økyselina benzoová Ø (Whitfieldova mast) – povrchové mykózy Ø Ø Ø Ødalší látky toxické vůči kvasinkám: Ø jodid draselný, kyselina boritá, bazická barviva Ø kyselina benzoová Ø (Whitfieldova mast) – povrchové mykózy Ø Ø Økombinace antimykotik: Povrchové mykózy ØPovrchová kandidóza: Ø Ø- postižení kůže, nehtů, sliznic úst a pochvy (infekce sliznic – „moučnivka“) Ø- 80 – 90% Candida albicans, zbývající případy další druhy (C. tropicalis, C. krusei, C. parapsilosis, C. glabrata…) -20% lidské populace – C. albicans součást komensální flóry pokožky a sliznic -výskyt závisí na stavu organismu – bakteriální či virová infekce, těhotenství, aj Candida albicans Candida albicans rostoucí na sladinovém agaru Candida albicans fig75_4 c-albicans-on-cnaofw4 Ø ØIdentifikace: Ø- Sabouraudův glukózový agar – kvasinková fáze (oválné buňky, 3-8 μm), kolonie za 1-2 dny při 25–37°C Ø- in vivo – směs kvasinkových buněk, pseudomycelia a pravého mycelia Ø- po obarvení dle Grama: grampozitivní oválné pučící buňky Ø Ø- Candida albicans – tvorba charakteristických klíčků (po 90–120 minutách inkubace v séru při 37°C) -další identifikace: soupravy, testy fermentace a utilizace cukrů a zdrojů dusíku Ø ØLéčení: Ø- lokální terapie nystatinem, amfotericinem B, mikonazolem Ø- vaginální kandidóza – azolové deriváty, azolové poševní čípky u recidivujících případů Ø Øinfekce sliznic: Ø- nejčastější povrchové kandidózy -na sliznici ohraničené bílé skvrny, mohou splývat a vytvářet pseudomembrány (tvarohový vzhled) -infekce dutiny ústní: Ø - bukální sliznice (moučnivka), tvrdé patro, okolí bílých skvrn zarudlé Ø - kojenci, staré osoby, osoby se sníženou imunitou (AIDS) Ø - umělý chrup – infekce pod protézou Ø Øinfekce kůže a nehtů: Ø Ø- v tříslech, mezi prsty, v podpažní jamce, pod prsy (v místech vlhké zapářky) Ø Ø- postižení nehtu a nehtového lůžka – při častém máčení rukou (ošetřovatelky, myčky nádobí) Ø Ø ANd9GcSDMUJDxROB_vAtMflU_55YYWqITML-QbrrVOkpxfAdkswU6hOrpuqV-1kUJg img0059 candidosis_intertriginosa Candida albicans studium vlivu antibiotika nystatinu na morfologii plasmatické membrány Cand1 Cand6 Cand3 Pityriasis versicolor Ø- chronická infekce způsobená lipofilní Malassezia furfur Ø- odbarvené skvrny na kůži ØM. furfur Ø - běžný komenzál na kůži, většina infekcí je endogenní Ø - vyžaduje k růstu lipidy; monopolárně pučící (jediný rod) Ø - oválné lahvovité buňky, velikost 2-3 x 4-6 μm, při pityriasis versicolor kvasinkovité buňky s krátkými hyfami Ø - kultivace – speciální půdy s Tweenem nebo lipidy (37°C) Ø - podílí se na tvorbě lupů a seboroické dermatitidě Ø sldr51 pitver3s Systémové mykózy ØKryptokokóza: Ø- způsobuje Cryptococcus neoformans vytvářející hladké lesklé kolonie, kolem buněk silné pouzdro Ø- onemocnění CNS a plic Ø- sporadicky po celém světě, nejčastější u pacientů s AIDS (u 10%) Ø- prostředí – alkalické substráty bohaté na dusík Ø Cryptococcus, cutaneous on the hand capsule_crypto 0705Samplings_Cryptococcus Basidiospores Cryptococcus Pouzdro Kožní infekce Fázový kontrast Cryptococcosis-dk1 Ø Průkaz: Ø mikroskopicky: v mozkomíšním moku a dalším klinickém materiálu - kulovité buňky 2–10 μm Ø s mukopolysacharidovým pouzdrem (až 60 % izolátů) – po smíšení mozkomíšního moku s tuší se pouzdro jeví jako jasný dvorec kolem buněk Ø kultivace: - na Sabouradově agaru při 25–30°C a 37°C za 2-3 dny Ø - smetanově bílé až žlutohnědé mukózní kolonie (neopouzdřené kmeny – suché) Ø - netvoří pseudomycelium ani mycelium Ø - nefermentuje cukry, silná produkce ureázy, asimilace inozitolu ØBlastoschizomyces capitatus Ø (dříve Trichosporon capitatum) Ø-diseminované infekce Ø - oslabení neutropeničtí pacienti se zhoubnými lymfomy Ø- asimilace pouze glukózy a galaktózy Ø ØGeotrichum candidum Ø - infekce u diabetiků, imunosuprimovaných osob Ø ØSaccharomyces cerevisiae Ø - sepse a plicní infekce Ø - izolace z 8,5 % vaginálních mykóz Ø BBSC_Ph_1fáze1 rho1_L Rhodotorula_sp Rhodotorula - barevné kolonie (oranžové, červené) - neasimiluje inositol Dimorfní houby Øvláknitá fáze Ø - většinou saprofytická (průnik přes kůži a sliznice) Økvasinková fáze Ø - infekční (hluboké infekce tkání a orgánů) Ø- kvasinkový růst podporují bohatější půdy (krevní agar) a teplota 35–37°C Ø- tvorba hyf – teplota 25–30°C Ø ØPříklady lidských onemocnění vyvolaných dimorfními kvasinkami a plísněmi Ø Øsporotrichosis Øblastomycosis Øhistoplasmosis Øcoccidioidomycosis Øparacoccidioidomycosis Øpenicillosis Ø Dimorfní patogenní kvasinky fig75_3 Blastomykóza, kokcidiomykźa, sporotrichóza etc. Sporothrix schenckii buňky ve fázovém kontrastu – hyfy a konídie Sporo05 Sporo04 Sporothrix schenckii studie buněk freeze fracture technikou BSporoFE1 BSporoFE3 BSporoFE2 Sporothrix schenckii studie buněk freeze-fracture technikou BSporoFE4 Blastomyces dermatitis Ø init_images%5C167MIKE