logo_cz Sekreční dráha a endocytóza (vesikulární transport) Prof. MUDr. Augustin Svoboda, CSc. Schekma2 Nobelova cena 2013 za fyziologii a medicinu Vesicular_tran Charakteristika pojmů: endocytóza pinocytóza - fagocytóza (podle velikosti přijímaných částic) exocytóza (sekrece) regulovaná - konstitutivní (např. sekrece inzulinu vs. trávicích šťáv) Spřažení exocytózy a endocytózy 14_2 Polarizované uložení organel u buněk resorpčního epitelu: Endosomy, sekreční váčky Lyzosomy Golgiho aparát Endoplasmatické retikulum 14_17 Integrace sekreční dráhy a endocytózy: tok membrán Proteiny syntetizované na ER jsou transportovány přes GA do sekrečních vesiklů, které splývají s PM nebo lyzosomy. Plocha PM se zvětšuje o povrch sekrečních vesiklů. exocytóza 14_17 Integrace sekreční dráhy a endocytózy: tok membrán Plasmatická membrána se vchlipuje do cytoplasmy, odštěpuje se endosom a splývá s lyzosomem. Vchlipováním měchýřků se plocha PM zmenšuje. endocytóza 14_17 Integrace sekreční dráhy a endocytózy: tok membrán Integrací sekrečních vesiklů se povrch PM zvětšuje, odštěpováním endosomů se plocha PM redukuje. Rozměr povrchu buňky se tedy nemění. Membránový materiál tak neustále prochází všemi kompartmenty – tok membrán endocytóza exocytóza Jak byla objevena sekreční dráha ER ® GA ® vesikly? - ve žlázových buňkách jsou tyto kompartmenty abundantní (hojně zastoupeny) - izotopové techniky prokázaly že po pulse-chase 3H-histidinu je radioaktivita (červené tečky) nejprve nad ER, pak GA a pak u povrchu buňky v zymogeních granulích autiradio 14_13 Začátek sekreční dráhy: syntéza proteinů na ribosomech, vázaných na povrch membrán endoplasmatického retikula. Syntéza sekrečního proteinu začíná na cytoplasmatických ribosomech. Po vytvoření ER signální sekvence se na ni naváže SRP částice, komplex se dostane na SRP receptor na povrchu ER, SRP se uvolní a ribosom se přesune na translokační kanál. Syntéza proteinu se obnoví, polypeptid je však nyní translokován do lumina ER. 14_14 Translokace proteinu do lumina ER Proteiny uvnitř ER jsou glykosylovány: Oligosacharid, obsahující 14 monomerů, se syntetizuje na dolicholu a pak se navazuje na aminoskupinu asparaginu Glykoproteiny, které jsou nyní v cisternách ER se, zabaleny v membránových měchýřcích) dostávají do GA, kde se, opět v měchýřcích, přesouvají z jedné cisterny do další a jejich molekuly jsou chemicky upravovány. Z GA pak putují, zabaleny v měchýřcích, do lyzosomů nebo do plasmatické membrány Golgi3 Golgi3 V cisternách Golgiho aparátu jsou sekreční proteiny dále upravovány a nakonec rozdělovány do měchýřků podle funkce a místa určení Jak je kontrolován postup sekrečního produktu po sekreční dráze? • • • • • U kvasinek S.cerevisiae byly detekovány geny, jejichž produkty jsou potřebné pro průběh sekrece. Mutací těchto genů je blokována sekreční dráha v místě, kde schází genový produkt Randy Schekman Photo Randy Schekman Jak se izolují sec mutanty? Jestliže syntéza bílkovin pokračuje, ale sekrece je zastavena, vzrůstá specifická hmotnost buněk a v hustotním gradientu jsou těžší. Z frakce těžších buněk se případně izolují teplotně senzitivní mutanty: v pokojové teplotě 250C probíhá sekrece proteinů normálně, avšak při zvýšení kultivační teploty na 370C je sekrece zastavena na tom místě, kde schází teplotně denaturovaný protein. Exo6 exo5 BbSc1 Sekreční mutanta S. cerevisiae sec 18, přenos z 25 0C do 37 0C 25 0C 37 0C ER exo5 Exo3 BbSc2 Sekreční mutanta S. cerevisiae sec 7 Transfer z 25 0C do 37 0C Sekreční mutanty kvasinek: sec 1 25 oC → 37 oC exo5 Exo3 Exo4 picbrenn2 Proteiny, potřebné k exocytóze sekrečního váčku (post-Golgi secretory vesicle), definované na základě genetické analýzy sekrečních mutant kvasinek 360px-Exocytosis-machinery exocytos Molekulární mechanizmy fuze membrány sekrečního váčku s plasmatickou membránou: interakce membránových proteinů startuje fuzi membrány. Plocha plasmatické membrány se zvětší o povrch měchýřku. 14_17 Endocytóza: tok makromolekul a částic obalených membránou do cytoplasmy. Encocytóza začíná vchlípením plasmatické membrány a odštěpením membránového váčku. Váčky se spojují navzájem a spojují se také se sekrečními měchýřky, které do endosomů přepravují hydrolytické enzymy. Tak jsou vytvářeny lyzosomy. Z lyzosomů jsou uvolňovány cukry a aminokyseliny do cytoplasmy. endocytóza Endocytosis3 Endocytóza: invaginace plasma-tické membrány, na jejíž receptory jsou navázány makro-molekuly z okolí buňky Tvorba a odštěpení váčku – endosomu Vyžaduje kooperaci s bílkovinami, které měchýřek obalují a odštěpují 14_19 Organizace molekul pláště receptorové jamky a endosomu: Receptory po navázání ligandy se shlukují v receptorové jamce. Z vnitřní strany se na receptory navazují adaptiny a clathrinové molekuly – ty se organizují do „klícky“ a ta se odtrhne od PM Schema2 Organizace molekul, které řídí místo tvorby receptorové jamky a odštěpení endosomu od plasmatické membrány: molekuly clathrinu vytváří kolem vchlipujícího se měchýřku „klícku“ , na jejím povrchu pak polymerizují vlákna aktinu, který spolu s myozinem pomáhá odštěpení endosomu a jeho pohybu do cytoplasmy Aktin myozin clathrin 14_18 Endocytóza: invaginace plasmatické membrány. Tvorba a odštěpení váčku - endosomu 14_18B ELM obrázek izolovaných endosomů, pokrytých klatrinovou „klecí“ Exo1 Sekreční dráha receptoru pro cholesterol a endocytóza cholesterolu (LDL částic) do buňky. U hypercholesterolemie se vyskytují 4 místa poruch v průběhu sekrece a endocytózy Hypercholesterolemie je příčinou vzniku arteriosklerózy Poznatky o sekreční dráze a endocytóze u kvasinek se dají aplikovat při studiu patogeneze řady lidských chorob