Biosensory s nukleovými kyselinami ndetekce výskytu známé cílové sekvence ve vzorku [USEMAP] Oxidace a redukce DNA N N N H H C 1 ' O H H N N C 1 ' H C H 3 O H O N N N N H N H H C 1 ' H N N N N O H N H H C 1 ' H Oxidační místo Redukční místo párování bazí A G C T [USEMAP] Cyklická voltametrie DNA -1.3 E (V) -0.5 ssDNA dsDNA 1 2 redukce C, A redukce G oxidace G [USEMAP] Diferenční pulzní polarografie DNA -1.6 -1.4 E (V) -1.2 ssDNA dsDNA III poškozená dsDNA II [USEMAP] AC polarografie DNA -1.6 -1.2 -0.8 E (V) -0.4 ssDNA pozadí dsDNA 1 1 3 2 0 (pzc) [USEMAP] Chronopotenciometrie Princip: kontrolovaný konstantní proud je aplikován mezi pracovní a pomocnou elektrodu a měří se časová závislost napětí mezi pracovní a referentní elektrodou Odezva je vyvolána koncentračními změnami elektroaktivních látek v průběhu elektrolýzy. Instrumentace: potentiostat v galvanostatickém modu time I 0 E E dt/dE Transformace signálu: [USEMAP] Potenciometrická „stripovací“ analýza 0.6 0.8 1 E (V) 1.2 dt/dE (s/V) ssDNA dsDNA Electrochemická oxidace guaninu klesá po hybridizaci Procedura: 1. Imobilizace próby adsorpcí 2. Promytí, přenos do čistého pufru 3. Inkubace se vzorkem - hybridizace („stripování“) 4. Chronopotenciometrické měření [USEMAP] Struktura „peptidových“ nukleových kyselin (PNA) PNA DNA Výhody PNA: • nenabitá kostra • duplex PNA-DNA je stabilnější • zlepšená citlivost • zlepšená specificita • rychlejší hybridizace • širší hybridizační rozmezí N H O N N H B O N B O N H O O N O B N H O B O O P O - O O P O O - O O B O P O O - O B O [USEMAP] Indikátory hybridizace Vazba do malého žlábku Co[(2,2’-bipyridyl)3]3+, netropsin Elektrostatické interakce s fosfátovou / cukernou kostrou Interkalátory ethidium, propidium, proflavin, chloroquin, doxorubicin Kombinovaná interakce Co[(phen)3]3+, DAPI (4’,6-diamidinofenyl indol) [USEMAP] Indikátory hybridizace N N H 2 H 2 N H N C l N H C H 3 N H C 2 H 5 C 2 H 5 C H 2 C H 3 N C H 3 C 2 H 5 C 2 H 5 N H 2 N N H 2 R N ( C H 3 ) 2 N N ( C H 3 ) 2 H akridinová oranž proflavin ethidium R = ethyl propidium R = chloroquin [USEMAP] Biosensory pro DNA -0.2 0 E (V) 0.5 CV SVV 0 0.2 E (V) 0.4 i (dE/dt)-1 (s/V) PSA před po hybridizaci • imobilizace próby - 1 min +0.5 V • hybridizace - 5 min +0.5 V • interkalace - 1 min, +0.5 V, 50 µM Co[(phen)3]3+ • měření [USEMAP] Imobilizace nukleových kyselin a oligonukleotidů § adsorce na celulosu § ultrafialové světlo (kovalentní vazba na celulosu) § zachycení uvnitř celulosy, agaru, polyakrylamidu § aktivace : CNBr karbodiimidu diazotací kyanurchlorid epoxy oxidace jodistanem (pro RNA) § reversibilní komplexace imobilizovanou kys. boritou [USEMAP] + + oligonukleotid s 5’ fosfoskupinou EDC imidazol isomočovina aktivní ester - intermediát 5’-aminoskupina Aktivace DNA Fosforamidová metoda N N H H 3 C N C N N + C H 3 H C H 3 H 3 C N H N H O N + C H 3 C H 3 H H 2 N N H 2 N N H O P O H O O - HO N N O P O H O O HO O P O H O O N H H 3 C N N + C H 3 C H 3 H HO O P O H O O N H N H 2 HO [USEMAP] Značení / imobilizace DNA N N N N N H 2 N H N H 2 O O H O P P P O P P P S N H H N O N N N N H N N H N H O O O O H biotin-14-dATP (podobně biotin-11-dUTP, spojení v C-5 pozici) DNA polymerasa a terminální transferasa 8-aminohexyl-dATP terminální transferasa [USEMAP] Genová analýza s biosensory Cílová DNA § přidání vhodných primerů § amplifikace pomocí PCR § fluorescenční značení § inkubace s próbami § hybridizace § naskenování fluorescence § konverse údajů o fluorescenci na informaci o sekvenci Kit s reaktanty Průtočná stanice Skener Software [USEMAP] PCR - polymerasová řetězová reakce Denaturace dsDNA 93oC Vazba primerů 37 - 55oC Prodloužení primerů 70oC Taq polymerasa Denaturace dsDNA 93oC Opakování cyklu [USEMAP] Úvod do DNA čipů DNA Arrays are composed of probes where each probe is a sequence of 25 nucleotides Optical scanning Laser activation Tagged fragments flushed over array [USEMAP] DNA arrays or as they are sometimes called GeneChips are used in a wide range of genomic analyses. This picture shows one actual DNA array. The DNA array is composed of a number of probes and each probe is composed of a sequence of nucleotides. In practice, we tag the test sample and flush the sample over the DNA array. Each probe binds to its target sequence if this target is present in the sample. Afterwards, a laser beam makes all target sequences that got hybridized glow. Using optical scanning and image processing we can identify which probes got hybridizes and from the probe locations we can detect any present and active genes. I. cDNA (500~5000 bází) je imobilizována na pevný povrch (sklo) a exponována souboru cílových sekvencí buď separátně nebo ve směsi Vyvinuto Stanford University, „DNA microarray“ II: používá se soubor oligonukleotidů (20~80-merů) nebo peptidových NA (PNA) prób precizní technologie, srovnatelnost výsledků krátké próby – menší specifita a citlivost; vysoká cena Vyvinula firma Affymetrix, „GeneChip“ • Dva přístupy [USEMAP] GeneChip oligonukleotidové próby soubor o známých sekvencích navázaný na skleněný čip zapouzdření do plastu (snadná manipulace) kombinatorická syntéza souboru přímo na čipu výrobce: Affymetrix [USEMAP] Rozměry elementů nplátek křemíku (wafer, 5x5 inch, tj. 12.5x12.5 cm) nz něho 49 až 400 jednotlivých sensorů (chips, 1.28x1.28 cm) nna každém čipu až 1.4 milionu pozic (features, 11x11 µm) nv každé pozici několik milionů kopií stejné oligonukleotidové próby s danou známou sekvencí [USEMAP] Výroba sensoru nkombinace chemické reakce a UV ozařování nfotolitografie, fotosenzitivní imobilizační procedura n [USEMAP] Fotolitografická maska nukázka masky pro celý wafer (vlevo) nvpravo pak výsek pro 20x20 elementů [USEMAP] Probe Synthesis array probes A 3 X 3 array CG AC G AC ACG AG CG AG C A à Mask 1 A A A A A [USEMAP] Now I will show how the DNA arrays are manufactured. Here we have a 3x3 array with some hypothetical probes to be placed. Left to right order of letters indicate their manufacturing step. We will first deposite the A nucleotides. So we put the A mask exposing the sites where A is going to be deposited and then wash the chip’s surface with the A solution. Probe Synthesis array probes CG AC G AC ACG AG CG AG C A A A A A A 3 X 3 array C à Mask 2 [USEMAP] Now the As are placed, it is time to manufacture the Cs, so we place the C mask, exposing some sites and deposit the Cs. Probe Synthesis array probes CG AC G AC ACG AG CG AG C A A A A A A Nucleotide Deposition Sequence defines the order of nucleotide deposition A Probe Embedding specifies the steps it uses in the sequence to get placed A 3 X 3 array G à Mask 3 [USEMAP] Now it is time for the Gs, so we place the G mask, exposing some sites and depositing the Gs. We refer to this order of deposition by the Nucleotide Depositions Sequence, so far it has been ACG. A Probe Embedding specifies the steps it uses in the sequence to get synthesized Výroba DNA čipu nsilanizovaný povrch sensoru, každý atom Si je zárodkem proby nnavázání spojovací části „linkeru“, ten zakončený fotocitlivou blokovací skupinou nozáření přes masku – odstranění blokujících skupin (deprotekce) nnavázání prvního nukleotidu (A) [USEMAP] Výroba (2) nozáření přes masku č. 2 nozáření přes masku č. 3 nnavázání dalšího nukleotidu (C) ndalší nukleotid (G) [USEMAP] Výroba (3) nmaska č. 4 ndalší (T), ale výskyt chyby! nzabránění dalšího růstu chybné sekvence – ukončovací báze („capping agent“) po každém kroku … [USEMAP] Hotovo! nkonečný stav po odstranění „capping agents“ a postranních protektivních skupin, následuje zabalení („packaging“) do výměnné „cartridge“ npro 25-mer potřeba obvykle méně než 100 masek (teor. maximum) nproblém: přesahy na hranicích mezi jednotlivými zónami (odrazy, rozptyl, vnitřní ozáření, …) [USEMAP] Ink-jet printing nalternativní metoda přípravy DNA čipů – „tisk“ reagencií na podklad – obdoba inkoustových tiskáren nzákladem je struktura rezervoáru vytvořená v křemíku (micromachining), překrytá velmi tenkou skleněnou membránou, na kterou přiléhá piezoelektrický element (aktuátor) nrezervoár se naplní reagentem, poté nad ústí pumpy posune žádaná pozice čipu, a na piezoelektrický aktuátor se přivede puls napětí npiezoelement se mechanicky deformuje, zatlačí na membránu, čímž dojde k vystříknutí mikrokapky reagentu nrychlost „tisku“ je 1 až 6 kHz [USEMAP] Ink-jet printing nrozptýlení kapky na povrchu brání předcházející modifikace čipu nhydrofilní místa pro imobilizaci prób navzájem oddělené hydrofobními úseky (surface tension wells) nnanášené kapky reagentů se nerozpíjí, povrchové napětí je drží uvnitř dané pozice nreakční kroky probíhají naráz na všech pozicích čipu npromývání a pomocné reakce se provádí pro celý čip společně npro 100000 pozic trvá prodloužení o jednu bázi asi 5 minut nsyntéza souboru o délce 25 bází zabere 2 hodiny. [USEMAP] Primitivní postupy n„pin printing“ – hrot se namočí v roztoku hotové proby a mikrokapka se přenese do žádané pozice na čipu n500~5,000 bází dlouhé PCR produkty se generují specifickými primery z cDNA knihoven nvelikost spotů je 100-300 µm, až 10 tisíc prob na čipu nhorší reprodukovatelnost, pomalost nnízká cena, laboratorní příprava [USEMAP] Průběh analýzy npříprava vzorku z buněk (2 dny), nanášení vzorků nhybridizace (až 16 hod) npromývání a fluorescenční značení – Fluidics Station 4-kanálová - různé pracovní protokoly (1.5 hod) automatizované přidávání reagentů, míchání, inkubace, promývání- zvýšená spolehlivost a reprodukovatelnost n [USEMAP] GeneArray Scanner nzasunutí cartridge nlaserové skenování nzaznamenání fluorescenčního 2D-obrazu n nVýrobce: např. HP (Agilent) nrozlišení: lepší než 10 µm npřes 106 pozic [USEMAP] Složky GeneArray systému nSkener PC průtočná stanice [USEMAP] Výsledek [USEMAP] Zpracování signálu nnastavení skeneru – různé úrovně odpovídající stavu PM („perfect match“) a MM („mismatch“) nzměny poměru PM/MM v důsledku nastavení přístrojů mohou vést ke změně interpretace o přítomnosti genu ntechnické komplikace – prachové částice, gradienty excitace, správné nastavení mřížky vymezující jednotlivé zóny nstatistické normalizování a vážení signálu, manipulace s rozhodovacími úrovněmi: Statistical Difference Threshold (SDT) = jak signifikantní je rozdíl mezi PM a MM při uvážení dané úrovně šumu? Statistical ratio threshold (SRT) = jak větší musí být PM než MM pro pozitivní výsledek? Zvýšené nastavení SRT dělá analýzu více stringentní (vliv uživatelského nastavení vyhodnocovacího programu) nvýsledek pro daný gen: Present / Marginal / Absent plus numerická hodnota odpovídající úrovni exprese PM MM [USEMAP] Způsoby použití DNA čipů [USEMAP] Analýza genové exprese nHuman Genom Project – 99.9% DNA u jednotlivých osob je identické sekvence ni minimální sekvenční diference však mohou vést k ohromným rozdílům v úrovni exprese genů nrůzné druhy buněk daného organismu obsahují shodnou DNA, ale ne každý gen je exprimován v každém typu buňky nstudium genové exprese se provádí měřením hladiny odpovídající přepisované RNA nna čipu je každý z asi 30 tisíc genů reprezentován unikátní sekvencí o délce 25 bází – próba (vybere se z několika tisíc bází celého genu tak, aby se nepřekrývalo s jinými geny) nprovede se extrakce RNA z buněk (krev, sliny, tumor, …) npřepíše se na cDNA, zmnoží pomocí PCR, přitom se biotinylují konce jednotlivých kopií [USEMAP] oligoArrays (Affymetrix) n nabsolutní data ncca 20 prob reprezentuje každý gen, výsledné „rozhodnutí“ je statistickým zhodnocením dané kombinace [USEMAP] Genová exprese nhybridizace na čipu, promytí, fluorescenční označení biotinylovaných konců PCR fragmentů n„zviditelnění“ přepisovaných genů – intenzita fluorescence v dané pozici je úměrná úrovni exprese genu reprezentovaného v dané pozici nkorelace genové exprese s fyziologickými projevy umožňuje v konečné fázi identifikaci genů nvyužití pro identifikaci genů spojených s nemocemi npomoc při kombinatorickém hledání vhodných léčiv pro „vypínání“ nebo naopak „zapínání“ genů n [USEMAP] cDNA arrays (Stanford) nvzorek barvený Cy5R (red) nKontrola barvená Cy3G (green) n n npřekryvový signál (oba kanály) nproblémy sekundární struktury dlouhých cDNA prob nnení absolutní signál [USEMAP] cDNA arrays nnehomogennost natištěné cDNA – lze porovnat pouze relativní úrovně exprese – poměrový signál npoměr závisí na volbě referentního materiálu – vysoká úroveň tedy nemusí znamenat vysoký poměr nnemusí dojít k identifikaci každého genu nzměna úrovně exprese mezi kontrolou a vzorkem nemusí znamenat závěr o přítomnosti genu n n n n nukázka části oblasti proby po hybridizaci (AFM, šířka obrázku je 2 µm) n [USEMAP] Analýza genotypu nstudium polymorfismu genomu (SNP, „single nucleotide polymorphism“) – výskyt bodových mutací nporovnávání genových podobností mezi nositeli daného onemocnění nvýhoda DNA čipů – současné sledování desítek tisíc různých SNP nanalyzuje se DNA, po zmnožení PCR se fragmentuje ndetekce hetero / homozygotů [USEMAP] Hybridizační sekvenace nklasická metoda sekvenování DNA - značení a postupné prodlužování řetězce nvzorek se rozdělí do čtyř zkumavek, v každé z nich je jeden z nukleotidů značený (radioaktivně či fluorescenčně) npři prodloužení řetězce se vždy na konec umístí značená báze a další prodlužování se tím zastaví nzíská se směs označených fragmentů, jejichž délka odpovídá pozici dané báze npo rozdělení (elfo na gelu, HPLC, CE) se ze čtyř drah A,G, C, T (nebo čtyř barev) sestaví výchozí sekvence n kapacita této metody je malá, navíc zdlouhavé [USEMAP] Hybridizační sekvenace nvyužívá kombinatorické postupy nanalyzovaná sekvence se nechá hybridizovat se souborem krátkých prób (6 až 20 bází), který obsahuje všechny možné kombinace dané délky sestavitelné ze 4 bází npodle toho, se kterými próbami analyzovaná DNA hybridizuje, se usuzuje na přítomnost známé krátké sekvence v jejím řetězci npomocí překrů se dá zrekonstruovat celá analyzovaná sekvence núplný soubor sekvencí: n6 bází … 65000 oligonukleotidů n10 bází … přes 1 milion n křemíkový čip se souborem oligonukleotidových prób analyzovaná sekvence próby, se kterými probíhá hybridizace [USEMAP] Sekvenace 2 nfluorescenční obraz úplného souboru hexamerových prób hybridizovaného se sekvenovaným fragmentem DNA (51-mer) nšipky spojují pozice v souboru odpovídající perfektně komplemtárním duplexům ndole je pak výsledná sekvence a jí odpovídající sekvence 46 komplementárních hexamerů s vyznačeným překrýváním [USEMAP] (Re)sekvenace na čipu npomocí čipu se určí sekvence DNA ve vzorku a porovná se se známými sekvencemi v databázi (resekvenace) nna čipu je úplný soubor všech kombinatoricky možných sekvencí npróby se vždy vyskytují ve čtveřicích, např. proba W: W1 – ATCGGGTAAACTAAAGGCTACTGCCT W2 – ATCGGGTAAACTCAAGGCTACTGCCT W3 – ATCGGGTAAACTGAAGGCTACTGCCT W4 – ATCGGGTAAACTTAAGGCTACTGCCT ndalší soubor prób (X) pak je posunut o jednu bázi: X1 – TCGGGTAAACTGAAGGCTACTGCCTC X2 – TCGGGTAAACTGCAGGCTACTGCCTC X3 – TCGGGTAAACTGGAGGCTACTGCCTC X4 – TCGGGTAAACTGTAGGCTACTGCCTC ntakto se pokračuje pro celou sekvenci DNA =================1 2 3 4=========================== W ___1____ X ___2____ Y ___3____ Z ___4____ [USEMAP] Čtení sekvence nperfektně komplementární hybridizující pozice vymezují hledanou sekvenci [USEMAP] Oblasti diagnostiky DNA Testy rodičovství / kriminalistika HLA komplex, oblast D-smyčky (mitochondriální DNA), délkový polymorfismus (VNTR místa) Onkogeny / supresorové geny c-myb, c-myc, c-abl, c-sis, c-ras, G-protein, jun, p53, retinoblastoma geny Dědičné choroby cystická fibrosa, hypercholesterolemie, srpkovitá anemie, Huntingtonova choroba, Duchenneova svalová dystrofie, b-Thalasemie, polycystická ledvinová choroba dospělých, hemochromatosie, hemophilie A / Von Willebrandova choroba [USEMAP] Viry cytomegalovirus, papilloma viry, rotaviry (RNA), virus lidské imunodeficience (HIV), virus leukemických t-lymfocytů Bakterie Mycobacterium tuberculosis, Gonorrhea (RNA nebo DNA), Mycoplasma pneumoniae (RNA), Chlamydia, Escherichia coli (RNA), Bacillus subtilis (RNA), Bacillus burgdorferi Aplikace diagnostiky DNA [USEMAP] •ArrayExpress - A public repository for microarray based gene expression data maintained by European Bioinformatics Institute. •ChipDB - A searchable database of gene expression •Gene Expression Atlas - A database for gene expression profile from 91 normal human and mouse samples across a diverse array of tissues, organs, and cell lines. •Gene Expression Database (GXD) - A database of Mouse Genome Informatics at the Jackson laboratory. •Gene Expression Omnibus - A database in NCBI for supporting the public use and disseminating of gene expression data. •MUSC DNA Microarray Database - MUSC DNA Microarray Database is a web-accessible archive of DNA microarray data. •NASCArrays - a repository for Affymetrix data generated by NASC's transcriptomics service. •Public Expression Profiling Resource (PEPR) - A web oracle data warehouse of quality control and standard operating procedure (QC/SOP) Affymetrix data. Reference. Databáze informací [USEMAP] •Affymetrix oligo arrays •Qiagen oligo arrays •Amersham Biosciences oligo arrays •MWG Biotech oligo arrays •Rosetta (Merck) oligo arrays •Agilent cDNA a oligo arrays •Clontech, BD Biosci. cDNA arrays •UHN MAC (Ontario) cDNA arrays •Incyte Gene Album cDNA arrays •Genomictree cDNA arrays Komerční systémy [USEMAP] §problémem je analýza dat, nikoliv jejich získávání §k dispozici je řada microarray databází, software pro analýzu je veřejně přístupný §z důvodu výskytu chyb a šumu je typicky ze stovek rozdílně exprimovaných genů pouze několik úspěšně validováno §existuje velmi dobrá reprodukovatelnost měření na dané platformě, pokud jsou experimenty prováděny v téže laboratoři §interlaboratorní srovnání v rámci platformy jsou horší §srovnání dat mezi měřícími platformami obvykle schází nebo si výsledky příliš neodpovídají Současný stav [USEMAP]