Biointerakce v reálném čase? §klasické metody studia vzniku afinitních komplexů využívají značení jednoho z partnerů -radioaktivita, fluorescence, enzymy, … §po smíšení interagujících biomolekul se nechá ustavit rovnováha a stanoví se množství volné a vázané značky -celý pokus tedy poskytne na konci pouze jeden údaj §lze tak určit kinetické rovnovážné konstanty § §použití biosensorů vychází z toho, že jeden z partnerů je imobilizován v citlivé oblasti a měřený signál odpovídá množství vzniklého afinitního komplexu - není třeba značení §měření probíhá průběžně v reálném čase §lze určit kinetické rychlostní konstanty §převodníkem jsou nejčastěji nelineární optické systémy [USEMAP] Historie SPR biosensorů §konec 60. let: Kretchman a Otto ukázali optickou excitaci povrchových plazmonů prostřednictvím zeslabeného totálního odrazu světla ATR, attenuated total reflection -druhou možností excitace plazmonů je použití difrakční mřížky §1983: Nylander a Liedberg ukázali využití SPR pro konstrukci biosensorů §1984: založena společnost Pharmacia Biosensor AB - cílem vývoj a komercionalizace funkčního SPR systému §1990: prodán první Biacore systém* §1994: uvedena na trh zjednodušená verze BIAlite §následovaly Biacore X, 2000, 3000, a Q §2005: Biacore A100 s dynamickou adresací toku reagencií §www.sprpages.nl §* Liedberg, B. et al. Biosensing with surface plasmon resonance - how it all started. Biosens.Bioelectron. 10: i-ix (1995) [USEMAP] Světlovody šíření paprsku ve světlovodu jádro (core) - index lomu n1 plášť (cladding) - n2, n2 n2/n1) - totální vnitřní odraz světla (TIR, total internal reflection) nv opticky řidším prostředí vzniká superpozicí dopadajího a odráženého světla elektromagnetická vlna npro biosensory se uplatňují dva systémy - planární světlovod a rozhraní kov / dielektrikum ninterakce exponenciální vlny s blízkým okolím sensoru mění podmínky pro šíření světla v optickém systému -kvantifikuje se dle změn intenzity nebo fázového posunu světla nIOS planární vodiče světla (integrated optical sensor) nSPR rezonance elmg. vlny šířené povrchovou vrstvou kovu (surface plasmon resonance, interakce s volnými elektrony v kovu) [USEMAP] Exponenciální vlna §základem biosensorů je interakce exponenciální vlny s okolím §energie vlny se vprostředí velmi rychle utlumí (zhášivá vlna) [USEMAP] IOS SPR IOS SPR §efektivní index lomu N pro šíření vedené vlny uvnitř opt. systému -šíří se jeden definovaný mod, který má u IOS magnetickou TM0 a elektrickou TE0 složku, u SPR existuje pouze TM0 §změny v poli exp. vlny jsou vyvolané navázáním biomolekul na citlivý povrch (změny indexu lomu nC v oblasti vzorku C) §penetrační hloubka exp. vlny v prostoru vzorku je dP -další součásti systému jsou S podkladový substrát (obvykle sklo, nS =1.46), F je planární světlovod (nF, tloušťka d; nF » 2.0, d = 80 - 120 nm, materiály SiO2/TiO2 nebo Si3N4) §u SPR je M tenká vrstvička kovu (Au, Ag, tl. 20 - 60 nm) -pro vznik SPR je nutné, aby u komplexní dielektrické permitivity kovu eM (eM = eM¢ + jeM") byla reálná složka eM¢ záporná a –eM¢ > nC2 C F d S x z d P C M d S d P exponenciální vlna [USEMAP] IOS / SPR §pro efektivní indexy lomu N vedených vln a penetrační hloubky platí: §IOS: N = kxl/(2p) dP = l/(2p)[N 2 – nC2] –1/2 §SPR: N = [nC–2 + 1/eM] –1/2 dP = [l/(2pnCN)](–eM¢)1/2 §v důsledku absorpce světla v kovu je navíc SPR jev velmi úzce vymezen ve směru osy x na oblast efektivní délky La (propagační): La = l(eM¢)2 / (2pN 3eM") §IOS a SPR jsou do značné míry analogické systémy, oba využívají vedení definovaného modu vlnění (buď totálním vnitřním odrazem ve světlovodu nebo podél rozhraní kov / dielektrikum) a generování exponenciální vlny v oblasti vzorku. §u IOS jsou vedeny jak TE0 (s-polarizace), tak TM0 (p-polarizace) §u SPR existuje pouze TM složka (menší množství informace !) §vedení světla u IOS je možné až na vzdálenost několika cm, u SPR jen na La, přitom citlivost je úměrná právě délce dráhy interakce se vzorkem. [USEMAP] Fyzikální charakteristiky IOS / SPR [USEMAP] Měřený signál §homogenní změna indexu lomu celého prostředí C DnC (pro pufry je nC = 1.33) - jako refraktometr -z hlediska sensoru nežádoucí §tvorba adsorbované vrstvy F¢, je homogenní, index lomu nF¢ tloušťka dF¢ (pro bílkoviny je nF¢ 1.45 – 1.55 a dF bývá 4 – 10 nm) §pokud se oba jevy uplatní současně, lze celkovou změnu vyjádřit jako: DN = (dN/dnC)DnC+(dN/ddF¢ )DdF¢ přitom citlivost na změnu tloušťky adsorbované vrstvy je nepřímo úměrná penetrační hloubce: (dN/ddF¢ ) » (1/dP) (dN/dnC) [USEMAP] OWLS 120 2005 IOS §v současnosti vyrábí MicroVacuum v Maďarsku (OWLS) periodicita: 2400 linií/mm hloubka: 10-20 nm světlovodná vrstva tloušťka 200 nm index lomu 1.8 materiál: SixTi1-xO2 x=0.25± 0.05 skleněný substrát tloušťka 0.55 mm index lomu 1.53 OW 2400 optical grating coupler waveguide sensor L=48 mm » 2 mm mřížka [USEMAP] OWLS sampleholder otočný stolek pro nalezení optimálního pracovního úhlu [USEMAP] SPR §pro zavedení světla se používá vstupní hranol, povrchová vlna se excituje na rozhraní mezi kovem M a dielektrickou vrstvou C (vzorek) §místo hranolu lze principiálně použít i vstupní mřížku, vzhledem k rychlému utlumení SPR jevu nelze užít výstupní uspořádání §změna rezonance se zaznamená jako posun minima intensity pomocí detektoru diodové pole („diode array“) C vzorek M kov S podklad hranol LED, laser DAD α [USEMAP] SPR signál úhel odrazu α Intensita odraž. paprsku vazebná reakce => změna rezonančních podmínek nresonanční úhel odpovídající minimu intensity odraženého paprsku je kontinuálně vyhodnocován, njeho poloha je úměrná změnám povrchové hmotnosti vyvolaným adsorpcí biomolekul [USEMAP] SPR §schéma záznamu signálu odražená intenzita úhel q SPR úhel čas promytí pufrem roztok antigenu imobilizovaná protilátka antigen [USEMAP] SPR biosensor výměnný biosensor - „čip“ systému BIACORE modifikace povrchu: CM5 karboxymethyl-dextran, HPA hydrofobní, SA streptavidinový, NTA komplexace kovů, … Rozměry 9 x 2.5 x 0.1 cm [USEMAP] BIAcore § 3000 § § § § §2000 počátkem 90. let minulého století uvedla na trh švédská firma Pharmacia (později Biacore, …, nyní součást GE Healthcare) [USEMAP] pozlacené sklíčko průtočná cela rotující stolek detektor hranol SPR-4 systém z Kijeva [USEMAP] Spreeta §koncem 90. let min. století Texas Instruments §integrace optické měřící a elektronické vyhodnocovací části do jediné součástky cm [USEMAP] Spreeta §schéma uspořádání (původní verse) zlatý povrch sensoru polarizer LED a štěrbina světloprostupný plast zrcátko [USEMAP] Spreeta §měřící uspořádání box s elektronikou pumpa vstup/výstup optická izolace [USEMAP] Spreeta „black box“ pumpa odpad buffer elektronika [USEMAP] SensiQ: Discovery §manuální 2-kan. systém, rel. vysoký šum < 1 RU §www.discoversensiq.com (dodává Nomadics) [USEMAP] SensiQ §2-kan. mikrofluidní cela §šum 0.25 RU sensor Spreeta 2000 [USEMAP] SensiQ [USEMAP] SensiQ Pioneer §automatizovaná verze §3-kan. cela §možnost gradientového a duálního nástřiku §šum 0.1 RU [USEMAP] Reichert: SR7000 a SR700DC §ruční jednokanálový a automatizovaný 2-kanálový SPR §modulární design, průtočná a statická cela -možnost recirkulace vzorku - nastříkne se do cely a pak se rel. velkou rychlostí (500 ul/min) pohybuje -čipy - smíšené PEG/PEG-COOH SAM s nízkou nespec. vazbou §www.reichertspr.com [USEMAP] Reichert: SR700DC [USEMAP] Sierra Sensors: SPR2 §sensorem je přímo zlatem potažený hranol §prostor cely lze sledova minikamerou (bubliny…) §www.sierrasensors.com [USEMAP] Sensia: betaSPR § [USEMAP] BioRad: ProteOn XPR 36 §36 interakčních zón -6 ligandů x 6 vzorků, 42 referenčních zón -překlopitelná průtočná cela, CCD kamera §marketingová strategie - proteomika §www.bio-rad.com [USEMAP] Horiba: SPRi (imaging) §SPRi-Lab+ a SPRi-Plex §64 (500 µm) až 400 (200µm) měr. bodů (spots) na 1 cm2 plochy čipu - hranol s pozlaceným povrchem, aktivovaný § nižší citlivost doporučené koncentrace vzorků 150 ng/ml (100-1000 kDa) až 5 μg/ml (4-20 kDa) § §výhoda: vysoce paralelní měření §nutnost zvládnout cílenou imobilizaci bioligandů [USEMAP] FujiFilm: AP-3000 §unikátní sensor ve formě tyčinky (SPR stick) §„nejrychlejší“, screening až 3840 vzorků za den §měření při zastaveném toku §lokalizované SPR §mikroporézní struktura reference … nástřik vzorku … interakce [USEMAP] Resonanční zrcátko - IAsys TIR hranice exponenciální vlna povrch pro imobilizaci resonanční vrstva (n vysoký) spojovací vrstva (n nízký) = resonanční struktura odražené světlo dopadající Æ hranol [USEMAP] Resonanční zrcátko - signál Mod: TM TE úhel odrazu α Intensita odraž. paprsku Vazebná reakce => změna resonančních podmínek nrezonanční úhel odpovídající maximu intensity odraženého paprsku (el. a magn. složky) je průběžně sledován, jeho poloha je úměrná změnám povrchové hmotnosti [USEMAP] Resonanční zrcátko - sensor výměnná měřící kyveta systému IAsys IAsys cell Citlivé povrchy: aminosilanizovaný, karboxylovaný, karboxymethyl-dextranový, hydrofobní, biotinylovaný Rozměry 5 x 2 x 3 cm vibrační míchadlo hranol měřící prostor rezon. zrcadlo nízký n detektor rezonovaný hn spojovací vrstva polarizační hranol [USEMAP] RIFS - reflektometrická interferenční spektroskopie interferenční vrstvy dopadající světlo I1 Δφ = 2nd/λ + φ 400 λ 700 Index lomu n I2 odražené paprsky interferují reflekční spektrum mění tvar po navázání biomolekul rozlišení změny tloušťky 1 pm [USEMAP] Biacore varianty §nyní (2010) dostupné: §4000 (A100) - nejvyšší produktivita, až 4800 interakcí/den §T100 - nejvyšší citlivost §X100 - osobní systém §C - měření koncentrací, certifikovaný provoz §3000 - univerzální, citlivý, lze eluovat pro MALDI/MS §Q - kvalita / kvantita v analýze potravin §J - nejjednodušší jednokanálový systém § § [USEMAP] Porovnání systémů [USEMAP] T100 § [USEMAP] 4000 § [USEMAP] BIAcore § 3000 § § § § §2000 počátkem 90. let minulého století uvedla na trh švédská firma Pharmacia (později Biacore, …, nyní součást GE Healthcare) [USEMAP] BIAcore - automatizace §dávkovač vzorků s pozicemi pro zásobníky [USEMAP] SPR biosensor výměnný biosensor - „čip“ systému BIACORE modifikace povrchu: CM5 karboxymethyl-dextran, HPA hydrofobní, SA streptavidinový, NTA komplexace kovů, … Rozměry 9 x 2.5 x 0.1 cm [USEMAP] Zasunutí čipu § [USEMAP] Pohled dovnitř [USEMAP] Spojení čipu s IFC [USEMAP] BIAcore - průtočný systém §microfluidics system IFC - miniaturní výměnný modul s pneumaticky ovládanými mikroventily, dávkovacími smyčkami a dráhami §přívod pracovního pufru, reagencií a vzorků k jednotlivým kanálům §variabilní nastavení měřící konfigurace průtočné cely - 1 až 4 kanálové měření [USEMAP] Průtočné cely §klasický (2000, 3000) § § sekvenční / paralelní § § § § §hydrodynamická adresace (A100) [USEMAP] Průtočný systém §přímý nástřik do cely §nástřik přes smyčku [USEMAP] Detail toku v cele §způsoby průtoku: -individuálním kanálem (FCi) -dvěma (FC1,2 nebo FC3,4) -třemi (FC1,2,3) nebo všemi §vliv průtočné rychlosti na výměnu obsahu cely [USEMAP] Piezoelektrické biosensory §piezoelektrický efekt - v některých anisotropních krystalech (křemen, turmalín, Rochellova sůl) se při mechanickém namáhání generují orientované dipóly a vzniká elektrické napětí § §naopak, pokud se na krystal přivede střídavé elektrické napětí o vhodné (rezonanční) frekvenci, začne krystal se stejnou frekvencí vibrovat, přitom se převážná část energie (105:1) uchová v oscilujícím systému a nerozptyluje se do okolí [USEMAP] Piezoelektrické materiály §orientace piezoelektrické destičky anisotropních materiálů jsou elektrické, mechanické a magnetické vlastnosti různé vzhledem k různým osám §mechanické deformace: § destička disk § d31 délková radiální § d32 šířková § d33 tloušťková tloušťková § § npřírodní: monokrystaly křemene, z nich se připraví vlastní sensory jako destičky vyřezané pod přesným úhlem (řezy AT, BT, ST, ...) numělé: (dnes i křemen) keramika: polykrystalická, ale uniaxiální (orientované), příprava sintrováním (ZnO, LiNbO3, LiTaO3, Bi12GeO20), snadné tvarování a nanášení nplasty: polyvinylidenfluorid PVDF (-CH2CF2 -)n - směs (asi 1:1) amorfní a polykrystalické formy, z nepolární náhodně orientované a polární orientované složky) [USEMAP] Vibrace piezosensorů §QCM quartz crystal microbalance; SAW surface acoustic wave; SH-APM shear horizontal acoustic plate mode FPW flexural plate (Lamb) wave. § oscilace může probíhat v celém objemu materiálu, nebo pouze v povrchové vrstvě. Konkrétní systémy jsou uvedeny na obrázku; často se uplatňuje několik druhů oscilací současně. [USEMAP] Piezosensory - chemické mikrovážky objemová akustická vlna - schéma tloušťkové střihové vibrace základní stav / amplituda Hmotnostní citlivost: QCM - quartz crystal microbalance držák kontakty destička z křemene kovové elektrody Piezoelektrický krystal AT-řez 5 až 20 MHz Df = -2f Dm 2 0 A rqmq [USEMAP] Měřící uspořádání § počítač čítač (měřič frekvence) oscilační obvod vzorek pumpa odpad průtočná cela s krystalem [USEMAP] Ukázka měřící aparatury PZ setup old čítač peristaltická pumpa průtočná cela s krystalem [USEMAP] Oscilační obvod schéma hradlového oscilátoru TANK1 VCC TANK2 XTAL1 GND1 XTAL2 FFQ NC FFD F NC VCC' F F ' GND2 F ' U1 74LS320 OUTPUT C1 L1 C 16 15 14 1 2 3 7 8 +5V Q [USEMAP] Piezosensory v kapalinách §při navázání látky na aktivní povrch elektrod dojde ke změně resonanční frekvence f0 §změní se hmotnost celého systému a vibrace se zpomalí - frekvence poklesne §pokud krystal osciluje navíc vpřítomnosti kapaliny, dochází k dalším změnám f0 v důsledku tlumení oscilací (viskozita prostředí). [USEMAP] Tlumení v kapalinách §prostup vlny v kapalině - penetrační hloubka δ §cca 180 nm pro vodu a 10 MHz frekvenci [USEMAP] Komerční systémy [USEMAP] Affinix Q § [USEMAP] Affinix Q4 §vícekanálové měření [USEMAP] MU Brno PZ detector computer flow-through cell with PZ crystal sample The change Δf of the resonant frequency f0 of piezoelectric crystals is proportional to the mass change Δm (Sauerbrey’s equation): pump waste Real-time recording of the resonant frequency changes [USEMAP] Detektor MultiLab §portable piezoelectric detector, computer-controlled §highly sensitive and rapid measurements §principle: output frequency from the oscillator(1) is subtracted(5) from a similar stable reference frequency generated by DDS(2) §thus obtained low frequency is filtrated(6), converted to voltage(9), filtrated(10) and finaly converted to digital signal using A/D(11) §the resolution is 0.05 Hz / 20 ms [USEMAP] Flow-cell design 25 Hz 1 min Sample Bad cell (not shown) large internal volume - slow mixing Good cell, crystal fixation not constant Optimized cell, constant pressure on the crystal [USEMAP] QCM-D §měří současně změnu resonanční frekvence a tzv. disipační faktor D - závisí na tlumení oscilací [USEMAP] Rigidní a viscoelastické vrstvy quarsch_vib3 tenký rigidní film: horní i dolní povrch vibrují synchronně viskoelastický film: horní i dolní povrch vibrují s fázovým posunem - větší tlumení, „větší“ odezvy [USEMAP] Více informací z piezosensorů? §měřené změny frekvence neodráží pouze změny hmotnosti, ale i struktury adherující vrstvy §potřeba měřit další parametry, úměrné viskoelastickým změnám (tlumení) §disipační faktor D (Q-Sens) §resistance R (Seiko / PAR) §energie dodávaná krystalu z oscilačního obvodu (AGC, auto gain control) §impedanční měření [USEMAP] Impedanční charakteristika §výsledkem je větší množství informací o dějích na povrchu krystalu a vyšší spolehlivost měření - odlišení hmotnostních a viskozitních změn pasívní měřící metoda na krystal se přivádí proměnná frekvence a sleduje se změna velikosti impedance |Z| a fázový posun Θ [USEMAP] Impedanční měření VCC CLOCK TC0 TC1 TC2 TC3 LOAD SDATA SCLK RESET FOUT ' GND ' AD7008 C2 C1 D +5V Q analog vstup digital výstup počítač OSC 50 MHz C3 R1 R2 D pomocí DDS syntetizátoru AD 7008 [USEMAP] Impedanční měření [USEMAP] Současné trendy afinitních biosensorů §SPR systémy jsou směřovány do farmaceutické oblasti §screening nových látek s potenciálně využitelnými fyziologickými vlastnostmi §cílové biomolekuly se imobilizují na povrch sensoru a sleduje se jejich interakce s vazebnými kandidáty §buď hotové molekuly (náročné - mnoho možností) §nebo „knihovny“ stavebních fragmentů (pár set), z těch reagujících se pak následně vytváří kompletní molekuly [USEMAP]