PRAKTIKUM Z BIOLOGIE KVASINEK
• 1. Makroskopické a mikroskopické pozorování kvasinek – doc. Paleček
• 2. Konverze buněk na protoplasty – prof. Svoboda
• 3. Mikroskopické pozorování párování kvasinkových buněk – doc. Paleček
• 4. Mikroskopické pozorování sporulace u kvasinek Schizosaccharomyces
versatilis – prof. Svoboda
- obvykle krémová barva – červený pigment (Rhodotorula)
- různé tvary kolonií:
- hladké, drsné … kolonie – kulaté a oválné buňky (S.cerevisiae) – závisí na ECM
- drsné kolonie – protáhlé buňky (Pichia)
- slizovité kolonie – pouzdra (Lipomyces)
Kolonie
Granek and Magwene, PLoS Genet (2010)
Stovicek et al, Fungal Gen Biol (2010)
ECM
Laboratorní kmeny jsou hladké (např. S288C Genotyp:
MATα SUC2 gal2 mal mel flo1 flo8-1 hap1)
• Saccharomyces cerevisiae PJ69-4a
• Schizosaccharomyces pombe 501
• Rhodotorula mucilaginosa
• Pichia membranifaciens
• …
Makroskopie
• Barva: lososová, ružová, dočervena
• Povrch: hladký, lesklý, slizovitý
• Okraje: celistvé
http://www.antimicrobe.org
Makroskopické a mikroskopické pozorování kvasinek
kvasinky < savčí buňky
Bakterie < kvasinky
Mikroskopie - morfologie
- za běžných podmínek převládá kvasinková f.
- rotační elipsoid, kulaté, protáhlé
- 3-15 mikrometrů (bakterie<kvasinky<savčí buňky)
- u jednoho druhu (haploidní<diploidní<polyploidní)
Kvasinková forma - morfologie
- vegetativní rozmnožování:
- pučení (budding) – monopolární (rod Malassezia), bipolární (střídavě na obou pólech=
citronkovitý tvar) nebo multipolární (Saccharomyces, kdekoli, ale nikdy ne na stejném
místě), na sterigmě (pupen spojen s mateřskou buňkou úzkou stopkou)
- Schizosaccharomces přehrádečné dělení (fission)
- Zvláštní tvar má za některých kultivačních podmínek rod Trigonopsis
Pozorování pučící kvasinky S. cerevisiae
https://youtu.be/GFEgB_ytDZYUMass Amherst Libraries
Buněčný cyklus pučící kvasinky S. cerevisiae
- zahájení tvorby pupene a duplikace SPB – začátek S fáze – duplikace DNA …
- rozchod jaderných plaků na opačné póly – přechod z S do G2 fáze
- jádro se protahuje – začátek M fáze (mitózy) – jaderné mikrotubuly odtáhnou chromosomy
- oddělení pupene – cytokineze – přechod z M do G1
- oddělená dceřinná buňka je menší než mateřská – nerovnocenné dělení– pro další dělení
musí dosáhnout určité velikosti => dlouhá G1 fáze
Curr Opin Gen Dev 5 (1995)
• Generovali teplotně-citlivé mutanty, z kterých vybírali kmeny
zastavující v určité fázi buněčného cyklu (cdc = „cell division cycle“
mutanty)
• Výběr dle morfologických (diagnostických) znaků charakteristických
pro určitou fázi buněčného cyklu
Hoffmann a spol, Genetics, 2015
Pozorování poltivé kvasinky S. pombe
Buněčný cyklus S. pombe
- pro konjugaci je kritická G1 fáze jako u S. cerevisiae
S.pombe má rovnocenné dělení - vznikají buňky stejné velikosti – hned
vstupují do S fáze (jsou dostatečně velké) – pro vstup do mitozy musí být
dvojnásobná velikost (kontrola v G2 fázi => nejdelší je G2 fáze)
cdc2
Konverze buněk na protoplasty
Životní cyklus kvasinek
- stabilní haploidní i diploidní buňky (S. cerevisiae – S. pombe okamžitě sporulují)
- haploidní buňky opačného párovacího typu se mohou křížit – diploidní buňky
- diploidní buňky mohou sporulovat – spory obsahují 4 haploidní buňky (po
meiotickém dělení) – 2 a 2 opačného párovacího typu
- homothalické buňky přepínají párovací typ a mohou se křížit …
Mikroskopické pozorování párování kvasinkových buněk
Pozorování pučící kvasinky S. cerevisiae
tvorba shmoo
https://vimeo.com/14316828
haploidní buňky reagují na přítomnost „partnera“ opačného párovacího typu změnou morfologie a zástavou buněčného cyklu
Funkce jednotlivých proteinů v průběhu párování
Ren et al., Science, 2000
KAR1
STE = sterile
Pozorování poltivé kvasinky S. pombe
- tvorba shmoo
- konjugace
Merlinietal,OpenBiol,2013
STE = sterile
lokalizovanátranslace
tvorba shmoo – polarizace
aktinového cytoskeletu
akumulace
faktorů
Signální dráha – α faktor
Wang et al., Nature, 2004
Cdc28
Zastavení buněčného cyklu
Aktivace transkripce
Morfologické změny (aktin)
Sporulace
- homothalické buňky S. pombe se párují a okamžitě sporulují
- u S. cerevisiae dochází k indukci meiosy a sporulaci při nedostatku dusíku v kombinaci s nefermentovatelným
uhlíkatým zdrojem
Hoffmann a spol, Genetics, 2015; http://www.genetics.org/content/suppl/2015/10/02/201.2.403.DC1
Přepínání párovacího typu
Homotalické - HO endonukleasa je exprimována pouze v mateřské buňce v G1 fázi
(dceřinná si uchová původní typ)
Heterotalické – nemají funkční HO endonukleasu
Chant,CurrentOpinioninCellBiol,1996
homotalické
Sporulace – tetrádová analýza
- pouzdro spory je třeba rozrušit a pomocí mikromanipulátoru získat/přenést jednotlivé haploidní buňky do
nových pozic (lze provést i tzv. random sporulation)
- u S.pombe jsou diploidní buňky nestálé a okamžitě sporulují (pouzdro se rozpadá samo)
Mikroskopické pozorování sporulace u kvasinek
Schizosaccharomyces versatilis