Metody přípravy protoplastů
Regenerace buněčné stěny u protoplastů
Fuze protoplastů jako metoda hybridizace
kvasinek
Další aplikace protoplastové formy
kvasinkových buněk.
Protoplasty jako modelový objekt
studia biologie kvasinek
Metody přípravy protoplastů
• Mechanické rozbití kvasinkových buněk v hypertonickém
roztoku
• Autolýza buněčné stěny
• Aplikace enzymů lyzujících buněčnou stěnu
– Výběr osmotika - sorbitol, mannitol, KCl, MgSO4 a koncentrace
– Aplikace látek rušících S-S vazby v buněčné stěně –
merkaptoetanol,dithiothreitol aj
Buňky kvasinky Saccharomyces
cerevisiae a čerstvě vytvořené protoplasty
Trigonopsis variabilis
Protoplasty S. cerevisiae ve fázovém kontrastu (3a) a po lýze v
destilované vodě – pokovený preparát v elektronovém mikroskopu (3)
Protoplasty S. cerevisiae ve fázovém kontrastu (3a) a po lýze v destilované
vodě – pokovený preparát v elektronovém mikroskopu (3). Nejsou
pozorovatelné žádné zbytky buněčné stěny, pouze zbytky organel a
cytoplasmy.
Povrch čerstvě připraveného protoplastu S. cerevisiae. Drobná granula (G)
plasmatické membrány jsou vlastně intramembránové proteiny. Invaginace (I) jsou
aktuální rezervou povrchu při zvětšování či zmenšování objemu protoplastu.
I
G
Tvar rostoucího protoplastu není
určován regenerující buněčnou stěnou,
ta jen modifikuje morfologii rozpínající
se cytoplasmy
Regenerace protoplastů S. cerevisiae v tekutém mediu.
Protoplasty rostou polárně nebo multipolárně, vakuolizují (Obr. 4a), probíhá
karyokineze, cytokineze je však zablokována. Na povrchu rostoucích protoplastů
se tvoří fibrilární síťovina (Obr. 4b), tvořená ꞵ-1,3 glukanem Mannan-proteiny,
další stěnová komponenta, jsou uvolňovány do media.
Fibrilární síťovina na povrchu
protoplastu rostoucího v
tekutém mediu.
Ultratenký řez v ELM
N
N
MT
V
GA
BS
Regenerace
protoplastů v
želatinovém gelu:
Protoplasty zůstávají
sférické, zvětšují svůj
průměr, jádra se dělí a
na povrchu je zřetelná
pevná stěna. Po 8 –
12 hod. kultivace se
objevují pupeny a
vytváří se mikrokolonie
buněk. Želatina a další
gely (agar, alginát)
patrně „dočasně“
nahrazují buněčnou
stěnu – zabraňují
difuzi stěnového
materiálu z povrchu
protoplastu, a tak
umožňují jeho
organizaci do pevné
buněčné stěny
Tvorba kompaktní buněčné stěny na
povrchu protoplastů
Povrch a řez kompaktní buněčnou
stěnou
Morfologie regenerace protoplastů v agarovém gelu
První generace revertovaných buněk mají abnormální
morfologii, která se u dalších generací postupně vrací k
typické elipsoidní formě
Na povrchu polárně rostoucích
protoplastů pokračuje tvorba fibrilární
stěny, která po dosažení určité
hustoty nahradí gelové prostředí.
Revertovaná buňka má již povrch
hladký, podobně jako kontrolní buňky
Vývoj protoplastu Sch. pombe na
povrchu agarového media. Protoplast
roste polárně, nejstarší části se
zakulacují a mají zřetelnou pevnou
stěnu. Pak vzniká septum a v další
generaci se již objevují cylindrické
buňky typické pro Sch. pombe.
Izolovaná buněčná stěna u revertovaného
protoplastu Sch. Pombe.
Hrubá stěna na povrchu
protoplastu
Hladký povrch buňky
Aglutinace protoplastů ve 40% polyethylenglykolu (PEG) a vytváření
polyprotoplastů s více jádry po zředění PEG živným mediem
Povrchy agregovaných
protoplastů ve 40% PEG
Lokální poruchy struktury
plasmatické membrány po
inkubaci protoplastů ve
40% PEG 30 min při 370 C.
Je pravděpodobné, že v
těchto místech začíná fuze
cytoplasmy adherovaných
protoplastů
Adherující plochy aglutinovaných
protoplastů v 40% PEG
Příklad mezidruhové hybridizace kvasinek S. cerevisiae his- x S. pombe trpcestou
fuze protoplastů
Tyto druhy jsou fylogeneticky vzdálené, S. cerevisiae má 16 chromosomů, S. pombe pouze 3. Vhodně
fuzované protoplasty v důsledku genetické komplementace mohou (selektivně) růst na minimálním
agaru. ←Hybridní protoplasty však na buňky nerevertují.
Aplikace protoplastů kvasinek v
buněčné biologii a genetice
1. Studium funkce buněčné stěny
● mechanická bariéra
● signální funkce – recepce stresových faktorů, feromonů aj
● recepce signálů pro start cytokineze
● syntéza komponent buněčné stěny
2. Studium struktury plasmatické membrány
3. Studium nepohlavní hybridizace kvasinek cestou fůze
protoplastů
4. Transformace kvasinek izolovanou DNA
Protoplasty α + a, pouze
neorientovaný růst (Obr. 1),
žádná fuze
Protoplasty α + buňky a:
párovací výběžky tvoří pouze
buňky (Obr. 2-4). Žádná fuze.
Buněčná stěna je tedy nezbytným
faktorem pro realizaci sexuálního
párování kvasinek.
1 2
3 4
Interakce buněk a
protoplastů opačných
párovacích typů u Sacch.
cerevisiae