CG020 Genomika
Přednáška 7
Proteinové interakce v genových regulacích
Jan Hejátko
Funkční genomika a proteomika rostlin,
Středoevropský technologický institut (CEITEC)
a
Národní centrum pro výzkum biomolekul,
Přírodovědecká fakulta,
Masarykova univerzita, Brno
hejatko@sci.muni.cz, www.ceitec.eu
2
 Zdrojová literatura
 Wilt, F.H., and Hake, S. (2004). Principles of Developmental Biology. (New York ;
London: W. W. Norton).
 Ainger, K., Avossa, D., Morgan, F., Hill, S.J., Barry, C., Barbarese, E., and Carson, J.H.
(1993). Transport and localization of exogenous myelin basic protein mRNA microinjected
into oligodendrocytes. J Cell Biol 123, 431-441.
 Alberts, B. (1998). The cell as a collection of protein machines: preparing the next
generation of molecular biologists. Cell 92, 291-294.
 Grefen, C., Stadele, K., Ruzicka, K., Obrdlik, P., Harter, K., and Horak, J. (2008).
Subcellular localization and in vivo interactions of the Arabidopsis thaliana ethylene
receptor family members. Molecular Plant 1, 308-320.
 Hu, C.D., and Kerppola, T.K. (2003). Simultaneous visualization of multiple protein
interactions in living cells using multicolor fluorescence complementation analysis. Nat.
Biotechnol. 21, 539-545.
 Shahbabian, K., and Chartrand, P. (2012). Control of cytoplasmic mRNA localization.
Cellular and molecular life sciences : CMLS 69, 535-552.
 Van Leene, J., Witters, E., Inze, D., and De Jaeger, G. (2008). Boosting tandem affinity
purification of plant protein complexes. Trends Plant Sci 13, 517-520.
 Walter, M., Chaban, C., Schutze, K., Batistic, O., Weckermann, K., Nake, C., Blazevic, D.,
Grefen, C., Schumacher, K., Oecking, C., Harter, K., and Kudla, J. (2004). Visualization of
protein interactions in living plant cells using bimolecular fluorescence complementation.
Plant J 40, 428-438.
Genomika 07
3
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
Osnova
4
 Funkční význam specifických interakcí proteinů
 Většina proteinů v buňce existuje ve
formě komplexů, které mohou dále
navzájem interagovat
 Proteazom
 proteinový komplex zodpovědný za
degradaci nepotřebných proteinů v
buňce
Význam interakcí
proteinů
1fnt
5
Proteazom
 Skládá se z centrálního komplexu
označovaného jako 20S a regulačních
částí (19S, někdy také 11S)
 Umožňuje cílenou degradaci proteinů
označených specifickou značkou,
malým proteinem (76 aa) - ubiquitinem
Význam interakcí
proteinů
6
By Rogerdodd, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=1291009
Ubiqutinace proteinů
„polibek smrti“
ubiquitin aktivující enzym
(ubiquitin activating enzyme)
ubiquitin vázající enzym
(ubiquitin conjugating/ubiquitin carrier enzyme
ubiquitin ligáza
(ubiquitin ligase)
By Rogerdodd - Own work, CC BY-SA 3.0,
https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=477
1409
7
Proteasome –řízená proteolýza
8
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
Význam PI
9
Regulation by histone
acetyl transferases or
histone deacteylases
10
CpG or CpNpG
CpNpNp
CpG
DNA methylation in animals vs. in plants
methylation status methylation status
Cell-specific methylation allows maintain of
tissue-specific gene expression profiles
Mechanism of transcriptional regulation by
DNA methylation mostly unknownImprinting and “cell memory”
11
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
Význam PI
12
Iniciace Transkripce
13
14
Positive TFs
Negative TFs
Iniciace Transkripce
15
Signal recognition
Dimerization
DNA binding
and
transcription
activation every 7th aa
Transcriční regulace
prostřednictvím TAFs
16
ProENDO16:REPORTER (sea urchin)
Deletion
mutagenesis Positive, interaction with
TAFs
Upregulation in the
presence of A and B
Developmental specificity
Combinatorial control
Midgut
Primary or skeletogenic
mesenchyme cells
Vegetal plate
Multifaktoriání kontrola promotorů
17
Regulation of β-globin type of
hemoglobin chains expression
Locus control region
Development-dependent
activation by LCR
•Acetylation of H3?
•Involvement of other
genes?
Cca 50 kbp
Multifaktoriání kontrola promotorů
18
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
Význam PI
19
BICOID mRNA NANOS mRNA
 Význam lokalizace mRNA
 Lokalizace proteinového produktu
genu v čase a místě
 asymetrické dělení během
vývoje
 polarizace embrya
Lokalizace mRNA
Shahbabian and Chartrand, 2012
ASH1 mRNA
20
 Role lokalizace mRNA
 Omezení exprese potenciálně
toxických proteinů
 lokalizace exprese
mRNA pro MYELIN
BASIC PROTEIN (MBP)
do oblasti myelinizace
nervových buněk
Lokalizace mRNA
Ainger et al., 1993
MBP mRNA
21
Shahbabian and Chartrand, 2012
 Difůze a ukotvení mRNA
 Během ranné oogeneze u drápatky je
Xcat-2 mRNA lokalizována do tzv.
mitochondriálního oblaku (MO,
Balbianiho tělísko)
 Pohyb MO je částečně závislý na
depolymerizaci mikrotubulů (tzv.
molekulární motor)
 Ukotvení na vegetálním pólu je dáno
interakcíá MO s ER
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
22
 Lokalizovaná degradace mRNA
 V embryogenezi u Drosophila m.
dochází k polární lokalizaci Hsp83
mRNA, podobně jako NANOS
mRNA
 Hsp83 mRNA je lokalizována v
celém embryu, zde je však
destabilizována prostřednictvím cis
elementů jak v 3’UTR (HDE), tak v
kódující oblasti (HIE)
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 HIE elementy jsou rozpoznávány proteinem SMAUG, který
zprostředkováva vazbu degradačního komplexu
CCR4/POP2/NOT
 V oblasti posteriorního pólu je Hsp83 mRNA chráněna před
účinkem SMAUG tzv. HPE elementem v 3’UTR; mechanismus
této ochrany je dosud neznámý
Shahbabian and Chartrand, 2012
23
Shahbabian and Chartrand, 2012
 Aktivní transport mRNA
 Asymmetric Synthesis of HO1
(ASH1) je represor HO u S.
cereviseae; inhibice HO
endonukleázy v dceřinných buňkách
zabraňuje změně párovacího typu
 ASH1 mRNA je aktivně
transportována prostřednictvím
„molekulárních motorů“
asociovaných s aktinem
Lokalizace mRNA
Mechanizmy
 ASH1 mRNA obsahuje 4 cis
elementy (3 v CDS a 1 ve
3’UTR), které jsou
rozpoznávány RNA vazebným
proteinem SHE2
 SHE2 umožňuje
prostřednictvím SHE3 vazbu
na „molekulární motor“,
MYO4, který se váže na aktin
a umožňuje transport ASH1
mRNA do dceřinné buňky
Shahbabian and Chartrand, 2012
ASH1 mRNA
24
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
Význam PI
25
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
 Stabilita proteinů
Význam PI
26
Jing and Strader, Plant Structural Biology, Hormonal Regulations (2018)
Auxinová signalizace
27
 Funkční význam specifických inteakcí proteinů
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Sestřih hnRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
Význam PI
28
 PI a přenos signálu
 prostřednictvím G proteinu a
fosfolipasy C
 Signální kaskády využívající cAMP
PI a přenos signálu
29
Přenos signálu a
fosfolipáza C
30
Receptory aktivované G
proteiny
31
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
Osnova
32
PI in vivo
Koimunoprecipitace
 založena na izolaci proteinových komplexů
pomocí protilátek rozpoznávajících jeden z
interagujících proteinů
CKI1
MY
C
CKI1
HA
αMYC
αHA
CKI1
MY
C
AHK3
HA
αMYC
CKI1-MYC
CKI1-HA
AHK3/4-HA
CKI1-HA
33
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
Osnova
34
PI in vivo
Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 izolace proteinových komplexů pomocí
rekombinantních proteinů, fúzovaných s dvěma
různými vazebnými doménami
 proteiny izolovaných komplexů jsou po rozdělení
na 1D ELFO identifikovány pomocí MS
 calmodulin-binding protein (CBP)
 IgG vázající domény proteinu A (ProtA)
 místo rozpoznávané specifickou
proteázou z TEV viru (tobacco etch
virus)
POI
 výhodou je použití dvou nezávislých proteinových
domén pro afinitiní purifikaci a tedy velká
specificita
35
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
Osnova
36
PI in vivo
Dvouhybridní kvasinkový test (Y2H)
 izolace proteinových komplexů pomocí
rekombinantních proteinů, každý z nich fúzovaný
s částí transkripčního faktoru Gal4
 jeden z proteinů (návnada, bait)
fúzovaný s DNA vazebnou doménou
Gal4 (Gal4-BD)
 druhý z proteinů (kořist, prey) fúzovaný
s aktivační doménou Gal4 (Gal4-AD)
 Interakce proteinů umožní rekonstituci vazebné
domény s aktivační doménou a spuštění
reportérového genu
 vizuální detekce (modré zbarvení, LacZ)
 auxotrofní selekce (růst na médiu bez
histidinu, His)
 umožňuje vyhledávání interakčních partnerů v
expresních knihovnách jednotlivých organismů
37
Y2H
38
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
Osnova
39
 Proteinová interakce je detekována na
základě reasociace fluoreskujícího proteinu
 každý z potenciálních interakčních
partnerů je fúzován s jednou z
podjednotek fluoreskujícího
proteinu, např. YFP
 při interakci dojde ke
znovuobnovení fluorescence
 Kromě identifikace vlastní interakce
umožňuje i lokalizovat interakci v buňce
PI in vivo
bimolekulární fluorescenční
komplementace (BiFC)
40
 Funkční význam specifických interakcí proteinů v
regulaci genové exprese
 Struktura chromatinu
 Regulace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Stabilita mRNA
 Stabilita proteinů
 Přenos signálu
 Metody analýzy proteinových interakcí in vivo
 Koimunoprecipitace
 Tandemová afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkový dvouhybridní test (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýza zprostředkované membránové vazby (MeRA)
Osnova
41
PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
 Umožňuje identifikaci interakcí cytoplazmatických
proteinů s membránovými proteiny
 membránový protein je fúzován s
fluoreskujícím proteinem
 potenciální ineterakční partner je
fúzován s jimým fluoreskujícím
proteinem, lišícím se svým emisním
spektrem
 v případě interakce dojde ke změně
lokalizace cytoplazmatického proteinu
na membránu (kolokalizaci s
membránovým proteinem)
42

PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
43
GFP
GFPGFPGFP
P35S::ERS1:RFP + P35S::ΔTM-ETR2:GFP
PI in vivo
Analýza zprostředkované membránové
vazby (MeRA)
44
 Proteiny a jejich interakce jsou zásadním
mechanismem regulace genové exprese
 Podílejí se na regulaci
 Struktury chromatinu
 Iniciace transkripce
 Lokalizace mRNA
 Zprostředkovávají regulaci genové exprese v odpovědi na různé
typy signáĺů
 Proteinové interakce lze detekovat in vivo např.
pomocí
 Koimunoprecipitace
 Tandemové afinitní purifikace (TAP-tag)
 Kvasinkového dvouhybridního testu (Y2H)
 Bimolekulární fluorescenční komplementace (BiFC)
 Analýzy zprostředkované membránové vazby (MeRA)
Klíčové koncepty
45
Diskuse