Mechanismy regulace genové exprese na epigenetické úrovni Vývojová genetika 2021 Rozdílnost jednobuněčných dvojčat – mechanismus? • Jednobuněčná dvojčata vznikají během ranného vývoje embrya (jeho rozdělením), jsou tvořeny tedy stejným genetickým materiálem (spermie i vajíčko) • Často rozdíly ve vzhledu a vlastnostech (např. 30% výšky) • Jak? Genotyp x Fenotyp? • Proč? Prostředí? • Conrad Waddington, 1942 – epigenetika (asimilace, krajinný model), vznik fenotypu(ů) na základě jednoho genotypu • Robin Holliday, 1990 – časová a prostorová kontrola genové aktivity během vývoje komplexního organismu Modely ke studiu epigenetických jevů Epigenetická kontrola chromatinu Genové umlčování Epigenetické obranné mechanismy Meiotické umlčování RNAi DNA a histonová methylace Chromatin v somatických a generativních buňkách Imprinting Paramutace TE genové umlčování RNAi DNA a histonové epigenetické regulace Epigenetická regulace zárodečné linie Poziční efekt (PEV) Polycomb Umlčení X chromozomů Mechanismy • DNA methylace • RNA interference • Histonové modifikace Methylace DNA • CH3 skupiny jsou umístěny na velké jamce dsDNA • Proteiny jako transkripční faktory, které se mohou vázat na DNA mají často kontakt právě ve velké jamce DNA Prokhortchouk a Defossez 2008 Mechanismus DNA methylace Chen et al. 2005 De novo methylace, u živočichů DNMT3a Udržovací methylace, DNMT1 Přímý vztah mezi metabolismem a DNA methylací (metabolom x epigenom) • SAM je prekurzor všech epigenetických modifikací vyžadující methylovou skupinu • DNA methylace • Methylace lysinových residuí • Methylace argininových residuí SAM cyklus – cyklus produkující, „konzumující“ a regenerující SAM molekuly Folátový cyklus – produkce vitamínu B, regenerace DNA a genetického materiálu Důkaz vztahu mezi DNA methylací a metabolismem – Agouti Methylace cytosinu se liší u různých eukaryotických genomů Evoluce DNA methyltransferáz u rostlin Ueda 2020 Specifita DNA methyltransferáz u rostlin • DOMAINS REARRANGED METHYL TRANSFERASE (DRM) - CHH • METHYLTRANSFERASE 1 (MET) – CG • CHROMOMETHYLASE (CMT) – CG • DNA methyl transferase (DNMT) – CG(?) Chen et al. 2005 =Specifická pouze pro rostliny Yaari et al. 2019 Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí • CpG ostrůvky – většinou nemethylovány (u rostlin v malé míře) • Mezigenové oblasti – většinou methylovány • Repetitivní oblasti – většinou methylovány Množství repetic Genomově specifická methylace (např. X inaktivace) Udržení genomové integrity • Dnmt1 linie vykazují vysokou genomovou instabilitu • Umlčení nejenom repetitivních elementů, ale i kryptických promotorů a alternativních míst sestřihu • Mutace v místě repetic (meC = T) jako prevence transpozice • Umlčení repetic a jejich transkripční interference • Potlačení ilegitimní rekombinace „Genome defense model“ – DNA methylace je mutagenní, proto musí mít pozitivní vliv na stabilitu (prof. Timothy Bestro) DNA methylace se liší mezi geny a transpozony Rozdíly DNA methylace koreluje se strukturou genomů a jejich velikostí • S větší procentem repetitivní DNA roste úměrně množství inaktivního chromatinu (dříve fakultativní heterochromatin) a tím se mění i chromozomální distribuce epigenetických značek Umlčení repetic = stabilita genomu a potlačení škodlivých inzercí DNA demethylace (TET – methylcytosin dioxygenáza) • Pasivní DNA demethylace • Rozvolnění „hustoty“ methylace s každým buněčným dělením (nizká aktivita DNMT1) • Aktivní DNA demethylace • -C-C vazba je velmi silná, odstranění přes intermediáty, používající různé systémy (TET enzymy – rodina 10 enzymů) • Především ve vyvíjejících se embryích a zárodečných buňkách, rakovinné buňky, mozkové buňky • 5hmC • 5fC (→BER) • 5caC (→BER) • U rostlin MEDEA, ROS1 (TET orthology prozatím neposány, ALE! Modifikace se v genomu vyskytují-jiné enzymatické dráhy?) BER – „base excision repeair“ TDG – „thymine DNA glycosylase“ AID – „activation induced deaminase“ nebo APOBEC (5mC → T+thymine glycosylase MB4 → BER) Hydroxylace oxidace oxidace An et al. 2017 Proč je DNA methylace dědičná? • DNA methylace je dědičná, protože DNMT1 rozpoznává hemi-methylovanou DNA na obou řetězcích • TET enzymy jsou specificky demethylovány pouze během specifického období během vývoje Aktivní methylace x aktivní demethylace Úloha DNA methylace ve významných procesech a rozdílná úloha v podobných orgánech u rostlin Tang et al. 2020 X inaktivace jako příklad mitotické dědičnosti DNA methylace • X inaktivace je epigenetický mechanismus dávkové kompenzace u savců (samci a i samice mají stejnou dávku genové exprese X chromozomu) • Během vývoje dochází k náhodné X inaktivaci v období gastrulace v embryu, tento jev je posléze předáván do dceřiných buněk The Walter and Elizabeth Hall Institute of Medical Research Mechanismy • DNA methylace • RNA interference • Histonové modifikace Výskyt a diverzita malých RNA Waititu et al. 2020 Klíčové momenty RNAi a genového umlčování • Prekurzor - dsRNA • Štěpení proteinovým komplexem DICER nebo DICER-like • Sestavení RISC komplexu, vazba sRNA ARGONAUTE proteiny • Vazba RISC na základě homologie • Umlčení Carthew, Sontheimer 2009 RISC komplex • PAZ • PIWI • AGO • sRNA Původ a rozdíl siRNA vs. miRNA • siRNA • Deriváty nezávislé na genomu (obsaženy vzácně)mRNA, transponovatelné elementy, viry • Vznik z dlouhých molekul RNA a jejich prodloužených sekund. RNA struktur • Nespecifická produkce siRNA molekul (nespecifický prekurzor) • Konzervativní oblasti poměrně vzácné, siRNA „autosilecing“ efekt • miRNA • Deriváty genomické RNA (obsaženy v genomu) • Vznik z lokálních transkribovaných sekund. RNA struktur (vlásenka) • Syntéza miRNA:miRNA duplexů • Konzervativní genové oblasti příbuzných organismů • miRNA „hetero-silencing“ efekt Biogeneze miRNA • Autonomní miRNA zahrnují ve svých produktech elementy potřebné pro regulaci a iniciaci transkripce • Ostatní miRNA jsou závislé na svých pri-mRNA, u kterých probíhá „parazitický“ proces • Syntézy nových krátkých úseků katalyzovány RNA polymerázou II a III • Většina miRNA katalyzovaných pol RNA II a rovněž většina živočišných miRNA nemá typický signál pro polyadenylaci Základní rozdíl syntézy miRNA u rostlin a živočichů Bartel 2004 Diverzita funkce sRNA Bartel 2004 RostlinyŽivočichové • Funkce v různých vývojových procesech, „micromanagement“ exprese Specifikace exprese miRNA • Různé hladiny regulace genové exprese miRNA zajišťující dokonalý systém kontroly denovo vzniklých transkripčních jednotek • Zavislá na druhu buňky, momentální úlohy a vývojového stádia • Počet jednotlivých miRNA v daném stavu buňky ovlivněn mírou exprese daného lokusu a tvorby pri-/pre-mRNA (50 000 molekul miR-2, miR-52 x 800 molekul miR-124) • Vysoká x nízká úroveň exprese na počet buněk (vysoká exprese důsledkem specializace pouze několika málo buněk, nízká produkce na úrovni např. celého organismu) Molekulární mechanismus funkce RISC - dvě cesty regulace genové exprese • Na úrovni mRNA – RISC komplex a štěpení RNA nebo regulace na úrovni translace (neúplná komplementarita) • Na úrovni DNA – methylace DNA, inaktivace chromatinu Bartel 2004 mRNA specifické štěpení regulace na úrovni translace vazba na DNA (methylace) Mechanismy • DNA methylace • RNA interference • Histonové modifikace Chromatin a DNA - struktura • DNA+histony (H2A, H2B, H3, H4)= chromatin • Chromatin umožňuje svinutí DNA do jádra • Vyšší organizace chromatinu ovlivňuje regulaci genové exprese a přístupnost transkripčních nebo DNA reparačních proteinů DNA Histonový oktamer N-aminokyselinový konec Vyšší organizace chromatinu Vyšší organizace chromozomu záleží kromě dalších faktorů na kontaktech H1 ? Struktura chromatinu ovlivňuje transckripci • Více sbalený chromatin – DNA je méně přístupná transkripčním faktorům • Volný chromatin – DNA je dostupná pro transkripční faktory = genová exprese Transkripční faktory Chromatin Heterochromatin vs. euchromatin • Euchromatin – otevřený, méně kondenzovaný • Heterochromatin – kondenzovaný, nízká nebo žádná genová exprese • Fakultativní – liší se na typu buňky nebo časové organizace (X inaktivace, specifické geny aj.) • Konstitutivní – kondenzovaný chromatin ve všech buňkách • Centromery, telomery, část Y chromozomu • Genové umlčování, udržení integrity genomu (5mC, represivní histonové modifikace) • Centromery, telomery, část Y chromozomu →Nedostatečná nomenklatura z hlediska epigenetiky a významu jednotlivých modifikací! Synapse epigenetických modifikací a organizace chromatinu • Thomas a Christoph Cremer – 2020 „ functional nuclear organization depends on still unexplored movements of genes and regulatory sequences between ANC and INC“ Cremer et al. 2020 ANC – aktivní jaderné komponenty INC – inaktivní jaderné komponenty Vztah mezi organizací chromatinu a epigenetickými modifikacemi • 3D rekonstrukce DAPI barvených jader a intezita ve vztahu k aktivním a represivním modifikacím Cremer et al. 2020 Úloha histonových modifikací • Většina modifikací na Nterminálních koncích • Více než 50 AA může být modifikováno, více než jedním typem modifikace (me1/me2/me3) • Převážně H3, H4 (nejvíce prostudovány), méně H2A a H2B • Kombinace umocněny kombinatoriální komplexitou = histonový kόd The Walter and Elizabeth Hall Institute of Medical Research Histonové modifikace tvoří významnou část genové regulační dráhy Ueada and Seki 2020 Druhově specifická funkce a distribuce a Diverzita histonových modifikací a jejich funkce Histone (lysine) methylation H3K4me • aktivní modifikace • Promotorová oblast a exony H3K9me • Inaktivující modifikace • v genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin H3K27me • Inaktivující modifikace, • V genových oblastech nebo konstitutivní heterochromatin • H3K27me3 důležitá pro regulace vývojových genů u rostlin i živočichů Methylace H3 závisí na velikosti genomu a druhové diverzitě H3K4me =všechny kombinace mají u rostlin i živočichů většinově aktivující charakter H3K9me1, H3K9me2, H3K27me1 =značky inaktivního chromatinu H3K27me2/me3 =druhově specifické, spíše inaktivující charakter •Velikost genomu>500 Mb vede ke změně distribuce aktivních a represivních modifikací! Houban et. al. 2003 Acetylace •Koreluje spíše s genovou aktivitou (např. H3K9ac) •Redukuje pozitivní náboj histonových aminokyselin = DNA je více dostupná pro další enzymy •Spekulativní jako epigenetická modifikace, spíše chromatinová modifikace •Některé ac-skupiny postrádají mitotickou dědičnost, závislé na např. na cirkadiánní rytmu •Velice proměnlivé Fosforylace •Nejvíce prostudovaná modifikace, z hlediska centromer •V závislosti na umístění=rozličná funkce •Závislá na buněčné cyklu, důležitá pro kondenzaci chromatinu H3S10ph(+H3S28ph) V oblasti pericentromer (opak u živočichů H3T3ph and H3T11ph) H3At108(120)ph Vnitřní část centromery Neumann et. al. 2016 Fuchs et. al. 2012 Molekulární evidence kombinatoriální komplexity Nízká exprese Vysoká exprese Nízký afinita Vysoká afinita Nízký afinitaVysoká afinita Nízká exprese Vysoká exprese A - H3K4me3 B - H3K16Ac B - H3S10phA - H3K9me3 BPTF („Nucleosomeremodeling factor subunit“) HP1 (heterochromatin protein, důležitý pro vazbu DNMT1) U Arabidopsis, CMT3 (CHH methylace) se preferenčně váže k dimeru H3K9me3H3K27m3. Rando 2012 „Writers, erasers and readers“ Acetyltransferázy Methyltransferázy Kinázy Ubiquitinázy Deacetylázy Demethylázy Fosfatázy Deubiquitinázy →Rozpoznání specifických histonových značek → Vazba dalších remodelujících proteinů a chromatin-modifikujících enzymů (změna funkce a architektury chromatinu-Swi, ISWI…) Neznámá hierarchie jednotlivých faktorů • HP1 vazba na H3K9me3 • HP1 vazba s DNMT • HP1 vazba HMT a šíření H3K9me3 • DNMT může vázat HDAC =není jasné, které elementy jsou na vyšší regulační úrovni Distribuce histonových modifikací v genových oblastech • H3K27me3 – modifikace typická pro genovou inaktivitu (vývojové geny) • H3K4me2/me3 a H3K9ac – značky typické pro genovou expresi a aktivitu (promotor) • H3K36me3 – značka typická pro genovou expresi (exony) Bart et al. 2010 Diverzita histonových variant a změna struktury chromatinu • Různé varianty H2A, H3, H4 • Každá varianta obsahuje specifické AA, měnící jejich funkci • Zvýšená stabilita • Výskyt AA, které mohou být modifikovány • Úloha v reparačních mechanismech, funkce centromer Martir et al. 2020 Vybrané specifické varianty a jejich funkce Histone Variant Functional association Mammals Yeast Drosophila H3 H3.1 – – S-phase subtypes H3.2 – – S-phase subtypes H3.3 H3.3 H3.3 Transcriptionally active regions Cenp-A Cse4 Cid Centromeric nucleosomes H2A H2A.Z Htz1 H2Ava Different functions in various organisms: maintenance of pericentric and telomeric heterochromatin, transcriptional activation and viability H2A.X H2A H2Ava Sex body in mammals, site of DNA double stranded breaks; condensation and silencing of male sex chromosome MacroH2A – – Inactivation of X-chromosome, interferes with both transcription factor binding and SWI/SNF remodelling H2A.Bbd – – Close spacing of nucleosomes aDrosophila melanogaster has a single H2A variant, H2Av, in addition to the major H2A. H2Av is not only a member of H2A.Z family, it also contains an SQ motif similar to mammalian H2A.X. It is phosphorylated at Ser137 and hence it is a functional homologue of H2A.X. Děkuji za pozornost!