Molekulární ekologie mravenec Msat paternita - barvy J. Bryja, M. Macholán, A. Konečný Co je molekulární ekologie? Uměle vytvořený obor vymezený technickým přístupem. Na ekologické a evoluční problémy hledá odpověď na základě molekulárně-genetických dat. (Zoologové a botanici nakoupili cyklery a sekvenátory, snažili se je využít i k něčemu jinému než je fylogenetická analýza => vznikla molekulární ekologie) Pracuje na různých úrovních variability DNA (genom, jedinec, populace, skupina populací, max. skupina blízce příbuzných druhů) Je to vlastně aplikovaná populační genetika – analyzuje a interpretuje získaná molekulárně-genetická data HM00363_ HM00361_ Klasické problémy a metody ekologie (zoologie, evoluční biologie) + Molekulárně-genetická data a populačně-genetické analýzy Mezioborová disciplína Molekulární ekologie Příbuzné přednášky, tj. co se zde objeví jen okrajově? •M. Macholán - Evoluční biologie + Mechanismy mikroevoluce • •J. Bryja, M. Macholán - Genetické metody v zoologii • •J. Zukal – Behaviorální ekologie • •S. Pekár – Ekologie populací • •aj. (molekulární ekologie „prorůstá všude“) • Její význam vzrůstá ... •Je populární – časopis Molecular Ecology (od 1992) – dnes 24 čísel za rok •Vyšly i její učebnice •Na řešení velmi odlišných problémů používá obdobné metody • Molecular and Statistical Advances These papers primarily present new techniques for collecting and analysing data for molecular ecology studies. These submissions can also describe meaningful comparisons of statistical, computational or molecular methods, or alternatively demonstrate the existence of important problems with current procedures. Computer Programs These articles typically present new computer software or substantial updates of existing programs. Authors should clearly describe the need for the program and the rationale behind its design, as well as a summary of functions, usage and output. When relevant, authors should present an evaluation of a program’s performance compared to existing software based on real or simulated data. Programmers are urged to remember that ‘user-friendly’ programs are more likely to be used by the community, and that it is helpful if programs require standard input/output file formats (e.g., Genepop or Arlequin). Submissions should include a user manual or README file with adequate guidance for new users. Software and supporting documentation should be accessible from a long-term server (e.g., github), but can additionally be made available at academic websites. Permanent Genetic Resources These articles describe the development of significant genetic resources for application to evolutionary or ecological questions. For example, these papers could describe NGS projects in which sequenced transcriptomes, genome fractions or whole genomes have been analyzed such that a readily usable resource is presented to the molecular ecology community. These articles may also present data on novel applications of the standard DNA barcoding loci to a hundred or more species, where the paper presents a readily usable resource. + Invited technical reviews, Opinions, etc. Proč používat molekulární metody v ekologii? • •Často nelze jinak •paternita – páření často skryté a nemusí vést k oplození • •identifikace z trusu, chlupů - pohyb jedinců skrytě žijících druhů • •izolace populací – nemusí být zřejmá •počet migrantů – nelze sledovat naráz všechny jedince • •adaptace – nejsou zřejmé na první pohled (např. imunitní geny) • Proč používat molekulární metody v ekologii? •ecological, evolutionary, and population genomics •population structure and phylogeography •landscape genomics •community ecology and coevolution •reproductive strategies •relatedness and kin selection •sex allocation •population genetic theory •analytical methods development •conservation genetics •speciation and hybridization •microbial biodiversity •evolutionary dynamics of QTLs •ecological interactions •molecular adaptation and environmental genomics •impact of genetically modified organisms • Vychází z populační genetiky •Slavní zakladatelé moderní syntézy, třicátá léta •Matematické modely spojující genetiku a evoluční teorii • • wright-sewall9 Hypothetical adaptive landscape Ronald Fisher Sir Ronald Fisher photo of Haldane addressing a political rally Ronald Fisher John B. S. Haldane Sewall Wright adaptivní krajina JBS Haldane Technické výlety (omezeně) Analýza dat Msat paternita - barvy http://t2.gstatic.com/images?q=tbn:ANd9GcT14HnvwAl7s9VzBRcX_Fg9Q-aetmYhuwJz-JYALZ6u3O6ilDXZ Organismy üDiploidní s pohlavním rozmnožováním ü üVětšinou obratlovci ü üBudou ale i někteří bezobratlí ü üRostliny fungují často jinak! Ale občas i o nich bude řeč. [USEMAP] Získání genetických dat – viz Genetické metody v zoologii Genotypizace – analýza genotypu •stanovení formy určitého úseku DNA (alely, haplotypu) - výběr daného znaku (= markeru) souvisí s úrovní genetické variability • 1)izolace celkové DNA z tkání 2)amplifikace požadovaného úseku DNA (u PCR-based metod) 3)studium variability daného úseku (lokus) 4) Způsoby získání DNA z volně žijících živočichů 1.destrukční – živočich je usmrcen kvůli získání tkání potřebných na genetické analýzy 1. 2. nedestrukční (invazivní) – živočich je odchycen a je mu odebrán vzorek tkáně nebo krve n 3. neinvazivní – zdroj DNA je „zanechán za živočichem“ a je získán bez potřeby odchytu, manipulace či dokonce pozorování Izolace DNA •rozmanitý biologický materiál – musí obsahovat buněčná jádra nebo mitochondrie s nedegradovanou DNA •dnes většinou komerční kity •velký vliv fixace vzorků • • • Genetické markery •Kódující DNA (geny) •Přepisované sekvence •Genetický kód •Ovlivňují fenotyp •Podléhají přírodnímu výběru •Narůstající význam v molekulární ekologii (transkriptomika) •Nekódující DNA •Nefunkční (neznámá funkce) •Neutrální k přírodnímu výběru – větší variabilita •Většina DNA u eukaryot •Pseudogeny •Repetitivní DNA Typy genetických markerů •sekvence jaderné nebo organelové (mt, cp) DNA – Sangerovo sekvenování nebo „next-generation sequencing“ • •jaderné znaky • - dominantní (AFLP) – multi-locus markery • - kodominantní (mikrosatelity, SNPs) – single locus markery Různé otázky – různé přístupy •Příbuznost (neutrální znaky) –identita (stopy stejného jedince, klony) –paternita, vzdálenější příbuzní –vztah populací (izolovanost, výměna migrantů) –fylogeografie (historie šíření) –hybridizace, hybridní zóny – •Geny pod selekcí –MHC, MUP, ABP, reprodukční proteiny –geny pro zbarvení –detekce selekce – • • •Ochranářská genetika ? vrány vydra face PCR •Z celkové DNA si namnožíme jen úsek, který nás zajímá. • •Co se bude množit? To určí primery. • •Primery – krátké oligonukleotidy komplementární k úsekům ohraničujícím místo našeho zájmu. • primer AGGGGACGTACACTCAGCTTT templát TCCCCTGCATGTGAGTCGAAA primer primer DNA templátu tento úsek se bude množit PCR Příklad programu 95°C 3 min 95°C 30 s 60°C 30 s 72°C 1 min 35x zpět 72°C 10 min Cykly (obvykle 20-40): denaturace (95°C ) nasednutí primerů (50-65°C ) elongace=polymerizace (72°C ) Nejprve však často prodlužená denaturace celkové DNA Nakonec prodloužená elongace • pcr Cycler MJ Research Cycler Eppendorf RoboCycler Stratagene „Molekulárně-genetické“ metody •analýza polymorfismu DNA •délkový polymorfismus (princip mikrosatelitů) CGCACATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA Rozdělení fragmentů DNA podle velikosti •Agarosa - Hrubé rozdělení (do rozdílu 15 bp) • •Polyakrylamid – Přesnější rozdělení (4 bp) • •Sekvenátor, fragmentační analýza – nejpřesnější (fluorescenčně značené PCR fragmenty, např. značené primery) tools_1a 3LOKCELE detektor laserový paprsek - + „Molekulárně-genetické“ metody •analýza polymorfismu DNA •sekvenční polymorfismus (princip SNPs): CGCATCTCTAGCTTCGATTCAGGAA CGCATCTCTAGCTTTGATTCAGGAA genotyp diploidního jedince: C/T Studium variability DNA fragmentů, které se neliší délkou •Sangerovo sekvencování (velmi dobré pro mtDNA, u nDNA problém s odlišením alel u heterozygotů) •SNP („single nucleotide polymorphism“) analýza – např. RFLP, SSCP, microarrays – chips, atd. CCGATCAATGCGGCAA CCGATCACTGCGGCAA T G Deployment of the portable genome surveillance system in Guinea. „High-throughput sequencing“ Illumina MinION Typy populačně-genetických dat Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 170/172 133/136 Ind_2 168/172 133/139 Ind_3 168/168 136/139 Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 A/T C/T Ind_2 A/T T/T Ind_3 T/T C/T Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 +/- -/- Ind_2 +/+ +/+ Ind_3 -/- +/- Jedinec Marker 1 Marker 2 Ind_1 + - Ind_2 + + Ind_3 - - mikrosatelity SNPs SINE AFLP Typy získaných dat – kodominantní znaky počet lokusů počet jedinců počet populací počet vzorků v 1. populaci počet vzorků v 2. populaci, atd. genotypy, tj. velikosti fragmentů v populaci geografické koordináty pop1 pop2 formát GenAlex http://www.anu.edu.au/BoZo/GenAlEx/ Genepop file format – jednoduchý ASCI kód (.txt) - jednotlivé alely pro daný lokus jsou seřazeny podle velikosti a očíslovány - tj. např. 128/130 je převedeno na 10/11 Typy dat: Sangerovo sekvenování Illumina fastq format „Alignment“ à contig (ze stejného jedince) Typy získaných dat – sekvence DNA Contigs from NGS individual reads reference (in resequencing) consensus Typy získaných dat – srovnání sekvencí mezi jedinci Fig1 PCR + Sanger = ca 1000 bp ddRAD („snps“ file) = 500 000 bp (depending on sequencing intensity etc.) ddRAD („usnps“ file) = 1 SNP/locus = 50 000 SNPs (depending on sequencing intensity etc.) Tak, a co teď s těmi daty ...