Zoologická mikrotechnika
Mgr. Mária Seifertová, Ph.D.
Co potřebujete na zápočet?
 Test
 Protokoly
 Preparáty (min. 9)
•Zákaz vstupu osob s příznaky virového infekčního onemocnění (dušnost,
horečka, suchý kašel, náhlá ztráta chuti a čichu) do budov fakulty.
•Dezinfekce
Protokol č. 1
Nativní preparát, vitální barvení
 definovat pojmy nativní preparát a vitální barvení
 postup přípravy preparátu
 obrázek nálevníka rodu Paramecium (kreslíme ve
cvičení) – popsat jednotlivé struktury a organely
 závěr (popsat slovně vlastní pozorování)
Protokol č. 2
Pitva švába
Trávicí soustava švába:
 nakreslit podle preparátů
 popsat jednotlivé části a jejich funkce
Přehled mikroorganizmů vyskytujících se v TS švába
1. hlístice rodu Thelastoma
 nakreslit a popsat (obrázek velký alespoň na půl strany A4)
2. prvoky rodu Gregarina
 nakreslit a popsat - syzygie (obrázek velký alespoň na půl strany A4)
Protokol č. 3
Trvalé preparáty
Nákres - kreslení preparátů pomocí kreslícího ramena - podle typu preparátu
doplnit postup přípravy
Suché preparáty
Uzavírací media s vodou nemísitelná
 popsat postupy a zásady přípravy preparátů do glycerolu, glycerin-želatiny a
media Liquido-Faure
Uzavírací média s vodou mísitelná
 popsat postupy a zásady přípravy preparátů do kanadského balzámu
Doporučená literatura
•Knoz, Jan - Opravilová, Věra. Základy mikroskopické techniky. 1. vyd.
Brno : Masarykova univerzita, 1992. 195 s. ISBN 80-210-0473-8.
•Murphy, Douglas B. Fundamentals of light microscopy and electronic
imaging. New York : Wiley-Liss, 2001. xii, 368 s. ISBN 0-471-25391-.
•Handbook of biological confocal microscopy. Edited by James B.
Pawley. 3rd ed. New York : Springer, 2006. xxviii, 98. ISBN 0-387-25921-
X.
•Jaromír Plášek: Nové metody optické mikroskopie. Skriptum
Fyzikálního ústavu Univerzity Karlovy
•Matis, Dušan a kolektív: Mikroskopická technika. Skriptum PřF
Univerzity Komenského, 1993
+ internet (výrobci mikroskopů)
Světelný mikroskop
Účel mikroskopu:
• zvětšení
• rozlišení detailů
• kontrast
základní pracovní nástroj
Jaký je rozdíl mezi binokulárním světelným mikroskopem a stereomikroskopem?
Stereomikroskop (preparační mikroskop) 2. Nastavení stereomikroskopu
• Kruhová deska stolku
• Dioptrická korekce
• Nastavení vzdálenosti okuláru
• Očnice - pozorování s brýlemi
ČÁST MECHANICKÁ:
stativ, tubus, revolverový
měnič objektivů, stolek,
makrošroub, mikrošroub,
vypínač, ovládání intenzity
světla
ČÁST OSVĚTLOVACÍ:
zdroj světla, zrcátko, polní clona,
kondenzor,
aperturní clona
ČÁST OPTICKÁ:
objektivy, okuláry
Složení mikroskopu CX 31 (světelný mikroskop)
Používaní světelného binokulárního mikroskopu
Příprava mikroskopu k použití
Při přenášení uchopte
mikroskop opatrně jednou
rukou zespodu za stativ (1) a
druhou rukou jej přidržujte za
úchyt (2) v rameni.
*Špatné uchopení (např. za
stolek, tubus, atd.) může
mikroskop poškodit!
Používaní světelného binokulárního mikroskopu
Postup při pozorování ve světelném poli
5. Zaostříme. Otáčejte kolečkem
makroposuvu (makrošroub) ve
směru pohybu hodinových ručiček,
dokud se objektiv (4x, 10x) nepřiblíží
co nejvíce k preparátu. Pozorujte
preparát v okulárech a otáčením
kolečka makroposuvu v opačném
směru posouvejte stolek směrem
dolů. Po hrubém zaostření na
preparát doostřete otáčením kolečka
mikroposuvu (mikrošroub).
2.Otáčením kolečka
nastavení intenzity
osvětlení nastavíme
požadovanou intenzitu
světla.
*Když mikroskop po
spuštění nesvítí, může
být intenzita světla
stáhnutá na nule!
1. Zapněte
hlavní
vypínač.
3. Umístíme
preparátu na
stolek.
4. Otáčením kolečka
posuvu v ose Y a X
posouváme preparát
v svislém směru nebo
ve vodorovném
směru do světelné
dráhy.
6. Nastavte
vzdálenost okuláru
podle svých očí pro
dosažení shodného
zorného pole v
obou okulárech.
Používaní světelného binokulárního mikroskopu
Postup při pozorování ve světelném poli
Nastavení dioptrické korekce:
Dioptrickou korekcí se přizpůsobuje zobrazení v
okulárech stavu zraku pozorovatele tak, aby obraz
byl ostrý pro obě oči.
1. Dívejte se pravým okem do pravého okuláru a
otáčením kolečky makroposuvu a
mikroposuvu zaostřete na preparát.
2. Dívejte se levým okem do levého okuláru a
otáčejte pouze kroužkem dioptrické korekce
(1) dokud nezaostříte preparát.
Použití očnic:
Pozorování s brýlemi - ponechejte očnice v
normální, ohrnuté poloze. Očnice chrání
brýle před poškrábáním.
Pozorování bez brýlí - odhrňte očnice ve
směru šipek, aby bránily pronikání vnějšího
světla mezi očima a okuláry.
Používaní světelného binokulárního mikroskopu
Postup při pozorování ve světelném poli
Přepínání objektivů:
Uchopte revolverový nosič
objektivů (1) a otáčejte jím, dokud
nebude objektiv, který chcete
použít, přesně nad preparátem.
Centrování polní clony - Köhlerovo osvětlení
Nastavujeme do optimální polohy:
• clonu osvětlovacího systému
• clonu kondenzoru
• polohu kondenzoru
*Výsledkem Köhlerova nastavení je rovnoměrné a maximální osvětlení preparátu, ležícího v předmětové rovině.
Současně by měla být dosažena nejlepší kombinace mezi rozlišovací schopností a kontrastem.
Používaní světelného binokulárního mikroskopu
Postup při pozorování ve světelném poli
1. Umístíme preparát a zaostříme s objektivem 10x
2. Uzavřeme polní clonu (1)
3. Kondenzor snižujeme nebo zvyšujeme tak dlouho, až
je obraz svítícího pole ostře ohraničený (2)
4. Polní clonu otevřeme tak, aby se dotýkala okrajů
zorného pole.
5. Obraz svítícího pole posuneme centrovacími šrouby
(3) kondenzoru do středu zorného pole
6. Má-li kondenzor stupnici numerické apertury,
nastavíme na ní hodnotu přibližně ¾ numerické apertury
objektivu.
Světelný binokulární mikroskop
1. Osvětlovací část
Kondenzor soustřeďuje světlo ze
světelného zdroje do kužele, který:
1. rovnoměrně osvětluje preparát
2. odpovídá numerické apertuře
objektivu
Aperturní clona (kondenzorová,
irisová) - umístěna před vlastní
soustavu kondenzorových čoček a
vymezuje šířku proudu světla, který
prochází kondenzorovými čočkami.
(1) stupnice, podle které se nastavuje
numerická apertura kondenzoru
N.A. kondenzoru = 80% N.A. objektivu
Polní clona – vymezuje
maximální velikost zorného
pole, používá se při malém
zvětšení (objektiv 4x), viz
práce s mikroskopem
2.1. Objektivy
Vytváří zvětšený převrácený a skutečný obraz předmětu.
Čím je kratší ohnisková vzdálenost objektivu, tím je větší zvětšení.
Světelný binokulární mikroskop
2. Optická část
Údaje vyznačené na objektivu:
Barevné značení objektivů
Světelný binokulární mikroskop
2. Optická část
2.1. Objektivy
4X červená; 10X žlutá; 10X zelená; 40X modrá, 100X bílá
Imerzní objektivy - druhý barevný
pruh - typ imerze (černý - olej, bílá voda,
okrová - glycerol)
Světelný binokulární mikroskop
2. Optická část
2.1. Objektivy
Numerická apertura objektivu
Numerická apertura (N.A.) = n × sin
N.A. ≥ 1 nelze dosáhnout bez imerze!!!
Se zvětšením roste numerická apertura objektivu.
n….index lomu prostředí (mezi
objektivem a preparátem)
α….úhel mezi středním a okrajovým
paprskem světla vstupujícího do
objektivu
*Numerická apertura je číselná hodnota. S rostoucí numerickou aperturou roste i rozlišovací schopnost
objektivu.
Světelný binokulární mikroskop
2. Optická část
2.1. Objektivy
Přidáním imerzního oleje, který
má vyšší index lomu než vzduch,
mezi preparát a objektiv se
předchází ztrátám světla, které
se láme na rozhraní
preparát/prostředí. Do objektivu
pak dopadne větší množství
paprsků.
Význam použití imerze
Světelný binokulární mikroskop
2. Optická část
2.1. Okuláry
Pro optimalizaci výsledků je potřeba vybírat okuláry odpovídající použitým objektivům (jejich typu a
korekci vad).
Zvětšuje obraz vytvořený objektivem.
*Zvětšení okuláru je prázdné – nezobrazuje více detailů, než bylo zobrazeno objektivem!
Podle uspořádání čoček a pevné clony se okuláry dělí na:
negativní (Huygensovy)
pozitivní (Ramsdenovy) - umožňuje snadnou montáž měřítka – pozor na prach!
Zvětšení obrazu mikroskopem je dáno zvětšením okulárů a zvětšením objektivu.
Užitečné zvětšení mikroskopu:
- Minimální – numerická apertura objektivu x 500
- Maximální – numerická apertura objektivu x 1000
- Maximální užitečné zvětšení mikroskopu je však určeno i rozlišovací schopností objektivu. Za
podmínek, kdy je minimální vzdálenost dvou rozlišitelných bodů srovnatelná s rozlišovací
schopností lidského oka, obraz se nezlepší ani při použití silně zvětšujících okulárů, kdy dostaneme
jen rozměrnější obraz bez nových detailů.
Světelný binokulární mikroskop
Zvětšení mikroskopu
1. dostatečném zvětšení obrazu (pozor na maximální užitečné zvětšení = numerická
apertura objektivu x 1000)
2. rozlišovací schopnosti mikroskopu (závisí na numerické apertuře objektivu a
kondenzoru a kvalitě osvětlení preparátu , tj. optimálním nastavení Köhlerova
osvětlení)
3. kontrastu obrazu, který lze efektivně zvýšit pomocí:
 cytologických a histologických barviv
 optických metod, které převádějí rozdíly v indexu lomu různě tlustých částí
objektů na jasový kontrast obrazu
Světelný binokulární mikroskop
Kvalita zobrazení biologických objektů závisí na:
Slouží k zvýšení kontrastu obrazu tak, aby byl dobře pozorovatelný.
Nejpoužívanější metody:
Temné pole (DF)
Fázový kontrast (PH1, PH2, PH3)
Polarizované světlo
Reliéfní kontrast
Diferenciální interferenční kontrast
Fluorescence
Světelný binokulární mikroskop
Kontrastní metody
Pleurosigma (Diatomaceae). Suchý preparát. Temné pole.
Metoda se používá pro pozorování drobných objektů a jejich povrchových struktur, např. prvoků, houbových spor,
pylových zrn, bakterií, ale i rostlinných pletiv aj.
Pozorování v temném poli – Darkfield (DF):
Světelný binokulární mikroskop
Kontrastní metody
Pozorování v temném poli – Darkfield (DF):
Podstata mikroskopie v temném poli
neboli zástinu spočívá v tom, že do
roviny objektu vstupují z
kondenzoru pouze okrajové, velmi
šikmé světelné paprsky, zatímco
středové paprsky jsou pohlceny a při
zobrazení se neuplatní. Objekt je
tedy osvětlen jen ze stran, paprsky
se od něj odrážejí a lámou. Do
objektivu vstupují jen paprsky
odražené od povrchu objektu a ten
proto září v temném poli.
Světelný binokulární mikroskop
Kontrastní metody
Metoda fázového kontrastu – (PH):
Světelný binokulární mikroskop
Kontrastní metody
Pozorování nativních nebo nebarevných preparátů - vystoupí i nejjemnější struktury v běžném světle
téměř neviditelné (např. studium buněčných a tkáňových kultur).
Nálevník - Procházející světlo Nálevník - Fázový kontrast
Metoda fázového kontrastu – (PH):
Světelný binokulární mikroskop
Kontrastní metody
Podstatou metody je převedení rozdílů v posunu fáze
světla procházejícího různými části objektu, které
nevidíme, na rozdíly v intenzitě světla, kterou
můžeme pozorovat.
Metoda fázového kontrastu – (PH):
Světelný binokulární mikroskop
Kontrastní metody
V ohniskové rovině kondenzoru se nachází
prstencovitá clona (maska s kruhovou
štěrbinou), kterou proniká světlo do objektu a
v objektivu, v místě obrazu kondenzorové
masky, je umístěna fázová maska. V místě
šterbiny u kondenzorové masky je u masky
fázové napařená polopropustná vrstva kovu,
která mění fázi světla o čtvrtinu vlnové délky.
Díky tomuto uspořádání prochází
nedifraktované (neohnuté) záření ze zdroje
(štěrbiny kondenzorové masky) tou částí fázové
masky, která mění fázi světla. Ostatní vlnění,
které se na objektu ohnulo a nebo zlomilo,
projde beze změny. Při interferenci vln
v obrazové rovině se části objektu, které
různým způsobem mění fázi světla projeví
různou intenzitou světla.
.
Jedním z typických artefaktů vznikajících při pozorování ve fázovém
kontrastu je "halo efekt" ohraničující objekty. Tento efekt je výsledkem
neúplného prostorového oddělení optických drah světla pozadí a světla
procházejícího objektem. Část světla po průchodu objektem sdílí
optickou dráhu se světlem pozadí i během průchodu fázovou deskou
objektivu a dochází tak k posunu fáze odlišnému od ostatního světla
procházejícího objektem. Výsledkem je právě vznik "halo" na hranicích
objektu.
vzniknou dva identické obrazy
objektu, které jsou vůči sobě
laterálně posunuty různá tloušťka
preparátu = fázové rozdíly
Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
kolem 1950, Georges Nomarski
mikroskop - 1959 Carl Zeiss
polarizátor
Wollastonův hranol
kondenzor
preparát
objektiv
Wollastonův hranol
analyzátor
lineární polarizace světla
rozdělení polarizovaného světla na
dvě složky
interference dvou laterálně
posunutých obrazů a srovnání
fázových rozdílů v celé ploše obrazu
Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC)
pylové zrno borovice
Ancylostoma
duodenale Clonorchis sinensis
červené krvinky
řez ledvinou myši
příchytné svorky diplozoona
Fázový kontrast DIC
Potřeby pro mikroskopování
Krycí skla - různá tloušťka (0,08; 0,11; 0,13;0,17;0,20 mm)
- velikost (mm) a tvar
Podložní skla - různá tloušťka (1; 1,2 mm) velikost (26 x 70 mm)
- zabroušené hrany, matované
Preparační soustavy - pinzeta, skalpel, nůžky, preparační jehly, štětec, pipeta
Laboratorní sklo - Petriho miska, hodinové sklo, kádinka atd.
Krabice na preparáty
Slohy na preparáty