Fluorescenční mikroskopie principy a použití • objekt absorbuje záření určité vlnové délky, které se vnitroatomovým přeskupením změní na záření o delší vlnové délce • excitace: viditelné světlo, UV, X, a, b, g Luminiscence Stokesův zákon: lE < lF Emitované záření má větší vlnovou délku a tudíž nižší energii. E = h . c/l Stokesův posuv l • fosforescence – vyzařování světla trvá i po přerušení excitace • fluorescence – nemá setrvačnost, záření zaniká po přerušení excitace Luminiscence Světelný zdroj • Intenzivní a téměř monochromatické ozáření, tj. NE halogenové lampy • Xenonové obloukové lampy nebo rtuťové výbojky s excitačními filtry • Lasery • Výkonné LED • Lasery nejčastěji pro konfokální mikroskopii, ostatní pro epifluorescenční mikroskopy Detekce fluorescence • spektrofluorometry a „microplate readers“ měří průměr vlastností vzorků (µl až ml) • fluorescenční mikroskopy rozlišují fluorescenci jako funkci prostorových koordinát ve dvou nebo třech rozměrech pro mikroskopické objekty (menší než ~0.1 mm v průměru) • fluorescenční scannery včetně „microarray readers“, rozlišují fluorescenci jako funkci prostorových koordinát ve dvou rozměrech pro makroskopické objekty, jako jsou elektroforetické gely, bloty a chromatogramy • průtokové cytometry (Flow cytometers) měří fluorescenci každé buňky v protékajícím proudu, což umožňuje identifikovat, kvantifikovat nebo sortovat subpopulace buněk ve velkém vzorku Princip fluorescenčního mikroskopu excitační (budící) filtr závěrný (bariérový) filtr vzorek Excitační filtry - Olympus z katalogu UG = ultraviolet glass BG = blue glass IF = interference filter Bariérové filtry - Olympus z katalogu L = longpass filter Y = yellow filter O = orange glass Transmisní fluorescenční mikroskop Dichroické zrcadlo a princip funkce Schéma epifluorescenčního mikroskopu Epifluorescenční mikroskop - Olympus BX-51 „Kostky“ = kombinace filtrů a dichroického zrcadla pro epifluorescenci Nikon Kombinace filtrů (Olympus) a metody /nm/ Excitace Kostka Dichr.zrcadlo Excitační filtr Bariérový filtr Použití UV U-MWU2 U-MNU2 DM400 330 – 385 360 - 370 420 autofluorescence DAPI Hoechst 33258 B U-MWB2 U-MNB2 DM500 450 – 480 470 - 490 515 FITC, Akridinoranž G U-MWG2 U-MNG2 DM570 510 – 550 530 - 550 590 Rhodamin, TRITC, PI, IY U-MWIY2 DM600 545 580 610 Texas red Typy fluorescence autofluorescence barvení = fluorochromy fluorochromem značené protilátky indukovaná fluorescence sekundární fluorescence imunofluorescence = primární fluorescence Srovnání fluorescenčních barviv • primární (autofluorescence) – častá u rostlinných pletiv • chlorofyl • lignin, suberin • pryskyřice, sekundární metabolity Fluorescence • sekundární – fluorochromy – specifická vazba na určité struktury (DAPI, Hoechst 33258) • fluorescenční imunohistochemie – spojuje sekundární fluorescenci s reakcí: antigen x protilátka vysoká specificita a citlivost • značení GMO fluoreskujícími proteiny (GFP,YFP) 1. autofluorescence pletiv (zvýraznění struktur bez barvení) 2. fluorochomy: znázornění jader (barvení DAPI, Hoechst 33258 a Hoechst 33342), kalóza (anilín. modř) 3. sledování životaschopnosti buněk (FDA, PI) 4. imunohistochemie – lokalizace určitých proteinů pomocí fluorescenčně značených protilátek 5. fluorescenční in situ hybridizace (FISH) – detekce určitých sekvencí DNA 6. detekce transgenů (GFP), detekce aktivity genů Fluorescenční mikroskopie - použití 1. autofluorescence Autofluorescence ligninu v xylému a sklerenchymu Snímek příčného řezu cévním svazkem foto-soutěž Nikon, 2004 UV excitace Příčný řez stonkem zvýraznění endodermis a sekundárních krycích pletiv 2. fluorochromy Fluorescence kalózy v pylových láčkách fluorochrom: anilínová modř UV excitace Stonek jedle v modrofialovém světle barvení akridinovou oranží Fluorescenční barviva fluorescein a rhodamin Two fluorescent dyes that are commonly used in fluorescent microscopy are fluorescein and rhodamine. Fluorescein emits an intense green fluorescence when excited with blue light. Rhodamine, emits a red fluorescence when excited with green-yellow light. Different cell constituents may be stained with both molecules and visualized simultaneously under the microscope. 3. sledování životaschopnosti buněk Sledování životaschopnosti buněk substrát: FDA (fluoresceindiacetát) esterázy fluorescein + acetát P. Debergh kombinace obrazu fluorescence a sv. pole Buňky kalusu mrkve Daucus carota ssp. carota Nomarského diferenciální interferenční kontrast (DIC) fluorescence živých buněk po inkubaci s FDA ukázka živé/mrtvé buňky, buněčná suspenze BY-2, FDA+PI> testování viability, živé buňky zelené, mrtvé- červená jádra (PI) Kombinace fluorochromů a filtrů DAPI + FITC Kombinace fluorochromů a filtrů FITC barví se mikrotubuly propidium jodid barví jádra kombinovaný obraz kultura buněk A549 Kombinace DAPI a fázového kontrastu DAPI fázový kontrast kombinovaný obraz FISH (fluorescenční in situ hybridizace) základní metoda molekulární cytogenetiky: podstatou je hybridizace = navázání sondy k chromozomální DNA sonda = malý fragment DNA značený fluorescenčním barvivem (fluorochromem), který se váže na specifické místo chromozomu. http://www.mgki.hu/molecular-cytogenetic-studies-in-situ-hybridisation chromosomy ječmene (fluorored) sondy: GAA trinukleotid sekvence (zelená) pAs1 (červená) Detekce transgenů, detekce aktivity genů (GFP) GFP • The green fluorescent protein (GFP) is a protein composed of 238 amino acid residues (26.9 kDa) that exhibits bright green fluorescence when exposed to light in the blue to ultraviolet range.[2][3] Although many other marine organisms have similar green fluorescent proteins, GFP traditionally refers to the protein first isolated from the jellyfish Aequorea victoria. The GFP from A. victoria has a major excitation peak at a wavelength of 395 nm and a minor one at 475 nm. Its emission peak is at 509 nm, which is in the lower green portion of the visible spectrum. The fluorescence quantum yield (QY) of GFP is 0.79. The GFP from the sea pansy (Renilla reniformis) has a single major excitation peak at 498 nm. • In cell and molecular biology, the GFP gene is frequently used as a reporter of expression.[4] It has been used in modified forms to make biosensors, and many animals have been created that express GFP, which demonstrates a proof of concept that a gene can be expressed throughout a given organism, in selected organs, or in cells of interest. GFP can be introduced into animals or other species through transgenic techniques, and maintained in their genome and that of their offspring. To date, GFP has been expressed in many species, including bacteria, yeasts, fungi, fish and mammals, including in human cells. Scientists Roger Y. Tsien, Osamu Shimomura, and Martin Chalfie were awarded the 2008 Nobel Prize in Chemistry on 10 October 2008 for their discovery and development of the green fluorescent protein. Arabidopsis DR5::GFP Auxin Reporter embryokořen kořen + auxin DR5rev 35S min GFP 35S pA anti-IAA AB J. Frimlvizualizace přítomnosti auxinu DR5::GFP histochemická lokalizace IAA Auxin v embryogenezi Arabidopsis J. Friml vizualizace přítomnosti auxinu QC SCR::GFP (Endodermis + QC) J. Friml Regenerace QC Sledování aktivity genu SCR PtK1 buňky: mikrotubuly (protilátka proti tubulinu značená FITC = zelená) a DNA (DAPI = modrá) (A. Khodjakov, Ph.D.,Wadsworth LabsAlbany, NY) originální snímek http://www.aqi.com/index.php snímek po úpravě Fotostabilita fluorescence OG514 Oregon Green 514 phalloidin fluorescein phalloidin 1s 10s 20s 30s X-ray fluorescence microscopy image of the seed capsules of the nickel hyperaccumulator plant Alyssummurale. The red colour shows its structure, whereas the green colour shows calcium, and blue shows nickel.