SVĚTELNÁ MIKROSKOPIE ÚVOD DO PŘEDMĚTU BI1301 Botanická mikrotechnika Hana Cempírková Časové mezníky historie světelného mikroskopu •začátky světelné mikroskopie - asi před 400 lety •1590 (1595?) - Hans a Zacharias Janssenovi první složený mikroskop •1653 - Anthony van Leeuwenhoek (1632-1723) •1665 – Robert Hook •1829 – J.J.Lister - konstrukce achromatického objektivu (kombinace čoček) – rozšíření použití mikroskopů v biologii, medicíně, mineralogii, chemii •1828 - William Nicol - hranol z islandského vápence slepený kanadským balzámem = Nicolův hranol - polarizační mikroskopie - využití v mineralogii, průmyslu i biologii •1870 – Ernst Abbe (Abbeův kondenzor) •1931 – Ernst Ruska – první elektronový mikroskop Na tomto slajdu máme shrnutou historii světelného mikroskopu. První složený mikroskop •výrobce brýlí Zacharias Janssen a otec Hans •Okulár a objektiv rozsah zvětšení 3 – 10x http://www.history-of-the-microscope.org/ „Galileův“ mikroskop tento mikroskop ze 17. století přisuzován Galileovi byl vyroben asi až 50 let po jeho smrti micro.magnet.fsu.edu/primer/ museum/galileo.html vyrobený podle principu Janssenova mikroskopu = zaostřování výsuvem tubusu http://www.library.ethz.ch/exhibit/galilei /galileod6.html Anthoni van Leeuwenhoek jednoduchý mikroskop • Thonis Philipszoon (1632-1723) “Anthony from the Lion’s Corner ” Výsledek obrázku pro leeuwenhoek microscope 1653 Anthoni van Leeuwenhoek sice používal jen jednoduchý mikroskop s jednou čočkou, ale ta byla precizně vyrobená. L. byl obchodníkem s látkami a amatérský badatel. Čočky si vyráběl sám. Čočka se umístila do toho malého otvůrku, před ni se připevnil pozorovaný objekt a pozorovalo se směrem ke zdroji světla (třeba svíčka). I s tímto „primitivně“ vypadajícím mikroskopem dokázal vidět třeba prvoky ve vodě nebo spermie. Robert Hooke - Micrographia http://www.history-of-the-microscope.org/images/Robert-Hooke-early-microscope.jpg Výsledek obrázku pro hooke Výsledek obrázku pro micrographia Výsledek obrázku pro micrographia cork https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/08/Micrographia_title_page.gif/800px-Microgr aphia_title_page.gif -1665 -Primitivní složený mikroskop -Vlastnoruční kresby -V řezech korku pojmenoval „buňky“ Dalším mezníkem je vydání knihy Micrographia Robertem Hookem, který knihu i sám ilustroval nákresy pozorovaných věcí. Používal sice jen primitivní složený mikroskop, ale dokázal vidět spoustu detailů – třeba chloupky na bleše nebo otvůrky v řezech korku, které dokonce pojmenoval „buňky“, ikdyž netušil, že to buňky jsou. J.J. Lister – achromatický objektiv Vada barevná (chromatická): čočka má pro každou složku polychromatického světla jiné ohnisko (index lomu je fcí l) - barevná vada velikosti nebo polohy obrazu Výsledek obrázku pro chromatic achromatic microscope Výsledek obrázku pro chromatic achromatic microscope Do doby, než Lister vytvořil achromatický objektiv, tak byla pozorování nejen v biologii, ale třeba i v astronomii omezena tzv. barevnou vadou. Díky tomu, že čočka má pro každou složku polychromatického (bílého) světla jiné ohnisko, tak je problém ve velikosti nebo poloze pozorovaného obrazu. Vhodnou kombinací čoček lze tato vada odstranit. Mikroskopy 18. století tubus z mahagonu stativ z ořechu Mikroskopy v expozici muzea v klášteře Zlatá Koruna •mechanické části mosazné a dřevěné 19. století Zakladatelé firmy Carl Zeiss Jena Abbeův kondenzor Ernst Abbe (1840 - 1905) Carl Zeiss (1816 - 1888) V 19. století došlo k dalšímu důležitému posunu a to díky firmě, resp. Jejím zakladatelům, Carl Zeiss Jena. Docházelo k dalšímu vylepšování mikroskopů výrobou přesných součástek, ale hlavně vyvinuli kondenzor, který bývá označován Abbeův podle svého vynálezce. August Köhler - otec správného nastavení osvětlení mikroskopu Předpokladem pro plné využití NA objektivu je, že kužel paprsků vycházejících z kondenzoru osvětlujících preparát odpovídá numerické apertuře objektivu. August Köhler (1866 - 1948) Köhlerův princip Kondenzor, objektiv a preparát musí být vůči sobě umístěny tak, aby preparát ležel ve společném ohnisku kondenzoru a objektivu http://kfrserver.natur.cuni.cz/studium/prednasky/mikro/mscope/kohler/kohler.htm Výsledek obrázku pro kohlerův princip Numerická apertura (NA) vyjadřuje v mikroskopii účinnou světelnost objektivu. Je to bezrozměrné číslo, které lze vyjádřit matematickým zápisem: NA = n . sin a Kondenzor je totiž důležitý pro správné nastavení osvětlení mikroskopu. Vzorec pro NA….n je index lomu prostředí a alfa je polovina dopadového úhlu. A = n * sin α/2 α ... Polovina úhlu svíraného paprsky vycházejícími z objektu, které jsou zachyceny objektivem n ... index lomu prostředí reálné a = 140º sin70º = 0,939 n(vzduch) ≈ 1 A (NA) = 0,94 Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006 Tady máme ještě ukázku dvou různých objektivů. Objektiv s menším zvětšením má menší numerickou aperturu než objektiv s větším zvětšením Kondenzor = „převrácený objektiv“ soustava čoček s krátkou ohniskovou vzdáleností (průměr čoček větší, barevná a kulová vada neodstraněna) Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006 přesvětleno sníží kvalitu obrazu a ≈ sina správně Apertura (NA) kondenzoru má být shodná s aperturou objektivu (pankratický kondenzor – plynulá změna apertury od 0,16 do 1,4 v souhlase s použitým objektivem) - možná úprava na hodnotu shodnou s objektivem pomocí irisové clony http://www.sci.muni.cz/~anatomy/mikroskop/olympus_centrovani.htm Clony u kondenzoru regulace množství světla, přicházejícího do mikroskopu: polní clona – blíže zdroje světla irisová (aperturní) clona – pod kondenzorem Cloněním ovlivňujeme: - kontrast - hloubku ostrosti - rozlišení podrobností - jas Jednotlivé parametry nelze nastavit nezávisle: http://www.sci.muni.cz/~anatomy/mikroskop/olympus_clony.htm Aperturní clona kondenzoru Kontrast Hloubka ostrosti Rozlišení Jas zcela otevřená malý malá velké velký zcela zacloněná velký velká malé malý Množství světla přicházejícího do mikroskopu můžeme regulovat nejen pomocí irisové neboli aperturní clony pod kondenzorem, ale i díky polní cloně, která je blíž zdroji světla…. Zlepšování rozlišovací schopnosti •definice rozlišovací schopnosti: a = 0.61 λ/(n . sin α), kde n . sin α = NA (numericku apertura) •Zvýšení rozlišení: snížení λ nebo zvýšení NA, resp. n (imerzní olej) • počátek 19. století = asi 0,5 μm • s Köhlerovým osvětlením a lepšími čočkami (Abbeův kondenzor) se limit zmenšil na λ/2 = 0,3 μm • s použitím UV (λ = 254 μm) = rozlišení 0,1 μm • od poloviny 20. století - rozvoj elektronové mikroskopie • SEM 3 nm • TEM 0,2 nm Rozlišovací schopnost mikroskopů se postupným vývojem mikroskopů zlepšovala. Co je to vlastně rozlišovací schopnost? Kromě slovní definice, ve které je to nejmenší vzdálenost, kdy jsme schopni od sebe rozlišit dva sousední body, je možné rozlišovací schopnost definovat i matematicky jako 0,61 krát vlnová délka světla děleno numerickou aperturou. Zvýšit rozlišení je tedy možné buď snížením vlnové délky nebo zvýšením NA, resp. Indexu lomu (např. při použití imerzního oleje). Na počátku 19. st. byla rozlišovací schopnost mikroskopů asi 0,5 mikrometrů….. Rozlišovací schopnost/mez Kotrba, Babůrek, Knejzlík: Návody ke cvičením z biologie, VŠCHT Praha, 2006 rozlišovací mez = nejmenší vzdálenost mezi dvěma body, které daná soustava rozliší jako dva body