Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Oddělení fyziologie a imunologie živočichů jipro@sci.muni.cz •Izolace DNA •Separace DNA •PCR •Manipulace genové exprese •Plazmidy •Transfekce Metody založené na práci s DNA DNA – primární a sekundární struktura Výsledek obrázku pro DNA https://www.thoughtco.com/nucleic-acids-373552 1.Dvě vlákna, z nichž každé tvoří pravotočivý helix, vzájemně svinuté, parametry 2.Monosacharid + fosfát = páteř vně šroubovice – polární povrch 3.Báze lokalizovány uvnitř šroubovice, roviny kruhů kolmo na osu, stohování bází, patrové hydrofobní interakce 4.Komplementární párování basí odpovídá Chargaffovým pravidlům, vodíkové můstky 5.Dvoušroubovice má dva žlábky: velký(mělký a široký) a malý (úzký a hluboký) 6.Polynukleotidové řetězce mají antiparalelní uspořádání: 5‘ → 3‘ 3‘ → 5‘ velikost se udává počtem párů bazí – bp Terciární struktura DNA Výsledek obrázku pro terciárnà strukturA DNA http://www.mojechemie.cz/Biochemie:Nukleov%C3%A9_kyseliny Lineární forma -Jaderná DNA eukaryot - - Kruhová forma -Prokaryota, -Plastidy, mitochondrie Replikace DNA http://147.33.74.135/knihy/uid_es-002/ebook.html?p=replikace_dna Izolace DNA fenol-chloroformová izolace alkoholová precipitace, Fenol a chloroform Izolace pomocí fenol-chloroformu je klasickým způsobem izolace DNA. Tato izolace je poměrně pracná a zdlouhavá, ale poskytuje velké množství velmi čisté DNA. K lyzátu, který se ponejprv získá rozrušením tkání a buněk, a působením proteázy (lyzační pufr s SDS, DTT, proteáza K), se postupně přidává fenol či směs fenolu a chloroformu, které z lyzátu vyváží proteiny. Přidáním těchto látek k vodnému roztoku dojte k separaci roztoku do dvou fází. Horní fáze je vodný roztok obsahující DNA, spodní je pak organická fáze fenolu či chloroformu. Mezi vodnou a organickou fází se hromadí proteiny. Přečištění se provádí pomocí precipitace DNA pomocí přídavku etanolu a octanu sodného a extrakce DNA z roztoku Izolace DNA dnes Výsledek obrázku pro isolation of DNA Výsledek obrázku pro isolation of DNA Kity založené na kolonkách na bází oxidu křemičitého a různé koncentraci solí Kity založené na magnetických kuličkách High salt Low salt High salt Low salt Separace DNA * DNA je záporně nabitá, míchá se s loading pufrem - bromfenolová modř + xylen cyanol (5 kbp fragment) a těžítko – sacharóza, glycerol * * * * * * * * * * * * Separace v 1% agarózovém gelu, barvení ethidium bromidem https://www.britannica.com/science/gel-electrophoresis Návod: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4846332/ Kapilární elektroforéza Výsledek obrázku pro DNA kapilárnà elektroforéza Výsledek obrázku pro DNA kapilárnà elektroforéza Záznam: •Využívá se fluorescenčně značených PCR produktů •Nutný vnitřní standard - Fragmenty konkrétní délky Pokročilé separační metody (pro zvídavé hlavičky) * Variace na agarózové elfo: * kapilární elektroforéza https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18428903 * pulsed field-gradient electrophoresis •https://www.researchgate.net/publication/20485237_Large_DNA_separation_using_field_alternation_aga r_gel_electrophoresis * DNA separation and enrichment using electro-hydrodynamic bidirectional flows in viscoelastic liquids https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26936389 * Size-selective separation of DNA fragments by using lysine-functionalized silica particles https://www.nature.com/articles/srep22029 * DNA Separation in Nanowall Array Chips https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ac201184t * * • * PCR * Klasická forma * Vzniklé produkty –Jsou separovány na –agarózovém gelu, EtBr * Namnožení fragmentu DNA podle specifických primerů * PubMed (Nucleotide), nalezení genu a navržení primerů – * real time PCR * Po každém cyklu PCR vzroste fluorescence o nově vzniklé molekuly, možno monitorovat ihned * Umožňuje kvantifikovat (relativně nebo absolutně) množství původních templátových molekul DNA * S pomocí reverzní transkripce (přepis mRNA na cDNA) umožňuje stanovit hladinu exprese příslušného genu –https://www.slideshare.net/sheetalnarkar01/polymerase-chain-reaction-8421686 – – • https://www.researchgate.net/profile/Nathaniel_Cady/publication/223138442/figure/fig5/AS:2030302061 28136@1425417581527/Polymerase-chain-reaction-PCR-is-an-amplification-based-technique-for-DNA-detec tion_W640.jpg Variace PCR * Nested PCR - 2 sady primerů, první delší produkt slouží jako templát pro druhou reakci * Asymetrická PCR – jeden primer je v nadměrném množství – preferenčně se syntetizuje jen jeden řetězec * AFLP PCR – pro detekci polymorfismů (využívá RFLP) • (https://botanika.prf.jcu.cz/laboratory/aflp.html) * Inverzní PCR – v plazmidu, namnoží úsek kolem známého místa * Multiplex PCR – více párů primerů v jedné reakci * In situ PCR – přímo v buňce ukotvené na sklíčku * Alelově specifická PCR – identifikace SNP, který je součástí primeru * Long PCR – velmi dlouhé úseky (specifická polymeráza) https://www.slideshare.net/sheetalnarkar01/polymerase-chain-reaction-8421686 Analýza fragmentů DNA •Nejpoužívanější metody: • * Southern blotting a hybridizace se značenou sondou • * RFLP * * Vyříznutí fragmentu po restrikčním štěpení dle velikosti, osekvenování * * FISH Southern Blotting http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/images/pic032.gif http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_20.htm RFLP * Polymorfismus délky restrikčních fragmentů * Mutace mohou vytvořit nebo zničit restrikční místo * * * * * * * * * * * Možné kombinovat s PCR – namnožení úseku s předpokládanou mutací • Principle of RFLP analysis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techrflp/ Sekvenace DNA - Maxam Gilbert Maxam and Gilbert gel * Namnožení úseku pomocí PCR * Značení 5´ konců pomocí 32P * Chemická modifikace bází + štěpení * G – dimetyl sulfát + piperidin * G+A – kys. mravenčí + piperidin * C – NaCl + hydrazin * C+T – H2O + hydrazin * DMS a hydrazin jsou toxické!!! * Nepříliš oblíbená metoda * * * * * Sekvenace DNA - Sanger * Různě fluorescenčně značené terminální nukleotidy (dideoxynukleotidy) v PCR s jedním primerem * Výsledek obrázku pro DNA sequencing https://www.slideshare.net/AboalgasimGoma/dna-sequencing-methods-69359203 Next Generation Sequencing •Princip: Velké množství reakcí Sangerovi metody v malém objemu jede paralelně na čipu • •Výhody: * v jednom běhu jede mnoho reakcí zároveň (miliony) * Reakce jsou v mikrolitrech a mohou být provedeny na čipu * Velice rychlá reakce * Mnohem levnější než Sanger (sekvenace lidského genomu: 2001 – 100 milionů dolarů, 2015 – 1245 dolarů) * Krátký fragment – 50-700 bp * http://labguide.cz/sekvenovani-nove-generace/ http://web.natur.cuni.cz/zoologie/biodiversity/prednasky/GenetickeMetodyVZoologii/Prednasky_2013/Ne xtGenerationSequencing_2013.pdf Srovnání pokročilých sekvenačních metod: https://en.wikipedia.org/wiki/DNA_sequencing Výsledek obrázku pro FISH method FISH - fluorescence in situ hybridization * rozeznání specifické sekvence nukleotidů přímo in situ pomocí fluorescenčně značených sond https://www.researchgate.net/profile/Thomas_Liehr2/publication/41824404/figure/fig3/AS:195799607713 794@1423693672162/Chromosome-aberrations-studied-by-Multiplex-FISH-M-FISH-method-applying-whole_W64 0.jpg https://www.researchgate.net/publication/41824404_Two_siblings_with_immunodeficiency_facial_abnorma lities_and_chromosomal_instability_without_mutation_in_DNMT3B_gene_but_liability_towards_malignancy _A_new_chromatin_disorder_delineation/figures?lo=1 Multiplex FISH Výsledek obrázku pro FISH Manipulace genové exprese * Šlechtění * In vitro metody * Genové inženýrství •Hlavní úspěchy: * * Stanovení sekvence řady genomů, regulačních sekvenci atd. * Konstrukce fylogenetických stromů druhů * Biotechnologie (vakcíny, produkce hormonů, atd.) * Perspektivní využití v genové terapii monogenních chorob * Modifikace genů vedoucí k získání žádoucích vlastností organizmu * Modifikace genů pro studium signálních drah nebo výrobu živočišných modelů lidských chorob * * * – Výsledek obrázku pro genové inženýrstvà Obsah [skrýt] 1Význam genového inženýrství 2Odkazy 2.1Související články 2.2Zdroj Význam genového inženýrství✎ upravit | ☲ editovat zdroj umožnilo poznání úplných a přesných sekvencí řady eukaryotních genů, vč. regulačních sekvencí výrazně doplnilo konstrukci fylogenetických „stromů“ živočišných a rostlinných druhů genové manipulace zahájily současně novou éru biotechnologií, umožnily výrobu nové generace vakcín (proti hepatitidě A i B, proti chřipce, slintavce, atd.) genové „doplněné“ bakterie, resp. kvasinky, dnes produkují lidské hormony: inzulin, somatostatin, somatotropin a řadu mozkových hormonů (enkefalinů a endorfinů) z bakterií s rekombinovanou DNA lze získat také mimořádně čisté AMK, enzymy, alkaloidy, steroidy, giberilliny a další biologicky aktivní látky v prakticky neomezených množstvích v medicíně se perspektivně může uplatnit genová terapie dědičných chorob Přestože genetické modifikace považujeme za jednu z technologicky nejnáročnějších disciplín, má svůj základ už v dávné minulosti. Selektivní křížení bylo využíváno našimi předky a je dokonce možno o něm najít zmínku v Bibli. Tato technika má však mnoho omezení, někdy trvá i staletí, než se požadovaný znak objeví a výsledky jsou celkem nejisté. Nové metody jsou mnohem účinnější. Zjednodušenou verzí je vkládání tzv. plazmidů (kruhových řetězců DNA) do bakteriální buňky, bakterie pak začne produkovat požadovanou látku. Dalším stupněm je pak vkládání nových genů do genomu rostlin a živočichů. Selektivní křížení V přírodě přežívaly vždy jen ty nejadaptabilnější a nejsilnější organismy, ale ne vždy to byly zrovna ty, které člověk potřeboval. Lidé si tedy vybírali ty organismy, které nesly potřebné znaky. Příkladem může být obilí. Jsou druhy, které mají vysoký výnos zrní, a druhy velmi odolné vůči klimatu. Křížením těchto druhů získáme velmi odolnou rostlinu, která zároveň uživí větší počet obyvatel. Obdobně lze postupovat i u živočichů, vzhledem k delší generační době je však tento proces náročnější. Selektivní křížení je velmi jednoduchý a účinný způsob, nevýhodou je však jeho relativně vyšší časová náročnost a nejistý výsledek. Vkládání plazmidů Plazmidy jsou součástí genomu většiny bakterií, jedná se o kruhový úsek DNA kódující nějaký protein nedůležitý pro funkci bakterie jako takové, ale může jí pomoci přežít v nepříznivých podmínkách. V přírodě právě plazmidy často nesou geny zodpovídající za rezistenci vůči antibiotikům. Metody genového inženýrství nám umožňují vytvořit rekombinantní plazmidy, které nesou požadované geny. Pro vpravení plazmidu do bakterie musíme překonat její buněčnou stěnu (toho se dosáhne pomocí CaCl[2] a následným zchlazením) a membránu (k otevření membrány se používá „tepelného šoku“). Plazmidy se pak snadno dostanou dovnitř. Bakterie je pak schopna vyrábět zvolený protein. Tímto způsobem se vyrábí některé lidské hormony, zejména inzulín. Vkládání genů Ve své podstatě je tento proces velmi podobný vkládání plazmidů s tím rozdílem, že vyšší organismy mají nucleus a nestačí tedy jen vložit plazmid do cytoplazmy, ale genetická informace musí být začleněna do jaderné DNA. Příprava rekombinantní DNA probíhá stejně jako u plazmidu, ale není uzavřena do kruhové sekvence. Pro implantaci genu je potřeba použít nějaký vektor. Lze využít služeb některého speciálně upraveného viru, tzv. „genové pistole“, nebo elektrického proudu. Tímto způsobem bylo upraveno už několik rostlin. Příkladem mohou být jahody odolné vůči mrazu nebo Bt kukuřice, která produkuje insekticidní toxin. Knock-out genu: homologní rekombinace – selekce rezistentního mutanta embryonální kmenové buňky •Herpesvirová TK – fosforyluje gancyclovir (analog T) - fosforylovaná forma zastavuje syntézu DNA a tak indukuje apoptózu https://www.slideshare.net/nanayawsam/gene-knockout-41679109 Výsledek obrázku pro gene knockout Článek: https://www.scq.ubc.ca/studying-gene-function-creating-knockout-mice Založená na homologní rekombinaci Výsledek obrázku pro gene knockout Knock-out genu: Cre/LoxP systém * Systém pochází z bakteriofága P1 * Cre – rekombináza (štěpí mezi sekvencemi LoxP) * Exprese Cre může být specificky časově nebo tkáňově limitována * loxP místa se musí vklonovat pomocí PCR * Buňky s podmíněnou expresí Cre x myší modely http://www.scq.ubc.ca/wp-content/creLoxP.gif https://www.scq.ubc.ca/studying-gene-function-creating-knockout-mice Delece úseku Inverze úseku Knock-out: Recombinase-mediated cassette exchange FLP/FRT (RMCE) * Systém pochází z kvasnic * Rekombináza Flipáza (FLP) se váže na FRT vazebná místa (nebo jejich mutovanou variantu), jsou v genomu přirozeně * Vyštěpení genu (FRT ve stejném směru) nebo jeho inverze (FRT v opačném směru), nebo integrace nové DNA (FRT a mutantní FRT) * FRT sekvence: https://www.researchgate.net/publication/45281356_Multiplexing_RMCE_Versatile_Extensions_of_the_Flp -Recombinase-Mediated_Cassette-Exchange_Technology tk WT FRT M FRT Cas9 in vivo: Bacterial Adaptive Immunity Knock-out: CRISPR/CAS9 systém * CRISPR - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats * CAS9 – enzym s nukleázovou a helikázovou aktivitou – –Zdrojem je adaptivní imunitní systém prokaryot –Cizorodá DNA se inkorporuje do CRISPR míst – přepis do RNA, nastříhání do crRNA – s pomocí transaktivující tracrRNA –crRNA pak rozeznává cizorodou DNA, která je pomocí Cas9 rozstříhána https://www.neb.com/tools-and-resources/feature-articles/crispr-cas9-and-targeted-genome-editing-a- new-era-in-molecular-biology Protospacer adjacent motif - rozeznání cizorodé DNA In the acquisition phase, foreign DNA is incorporated into the bacterial genome at the CRISPR loci. CRISPR loci is then transcribed and processed into crRNA during crRNA biogenesis. During interference, Cas9 endonuclease complexed with a crRNA and separate tracrRNA cleaves foreign DNA containing a 20-nucleotide crRNA complementary sequence adjacent to the PAM sequence. (Figure not drawn to scale.) CRISPR/CAS9 systém * HDR – 70-90 bp kolem místa štěpení * Single guiding RNA – různé crRNA a jedna tracrRNA https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/0c/DNA_Repair.png/800px-DNA_Repair.png https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/9/9a/CRISPR_overview_-_en.svg/800px-CRISPR_ove rview_-_en.svg.png https://en.wikipedia.org/wiki/CRISPR Produkce mutantních myší http://www.scq.ubc.ca/wp-content/Chimericmouse.gif https://www.scq.ubc.ca/studying-gene-function-creating-knockout-mice Typy mutací typu loss of function * Ztráta funkce genu * Úplná nebo částečná ztráta funkce genu * Hypomorfní mutace * Částečná ztráta funkce, zvláště v různých obdobích vývoje organizmu * Podmínečná mutace * Ztráta funkce genu za speciálních podmínek (teplotně senzitivní mutanti, přidání chemikálií) * Ztráta funkce genu v různých vývojových stádiích * Dominantně negativní mutace * Potlačuje funkci wt alely u heterozygotů * Haploinsuficience – pro vývoj jsou nutné dvě wt alely, proto je mutantní alela dominantní u heterozygota • – Nadměrná exprese genu * Konstitutivně aktivní gen (výměna podmíněně aktivované domény za konstitutivně aktivní doménu) * Gen zájmu fúzovaný s promotorem pro často přepisovaný, silně inducibilní promotor (myosin, Gal1) * Genová amplifikace (spontánně v případě řady onemocnění) * Exprese původně inaktivního genu (demetylace, acetylace promotoru) * * Nejčastěji je nadměrné exprese dosaženo pomocí TRANSFEKCE PLAZMIDŮ Plazmidy * Umělé jednořetězcové kruhové molekuly DNA sestavené z různých prokaryot * GFP izolovaný z planktonového korýše Pontellina Plumata Promotor z cytomegaloviru Protein zájmu polyA konec z SV40 viru Gen pro rezistenci Počátek replikace Vektor pMaxGFP (AMAXA) * Plazmidy (i jinou nízkomolekulární DNA) je možné množit pomocí kompetentních bakterií a následně izolovat pomocí kolonkových kitů (mini-, midi- a maxiprep) * * Heat shock kompetentních bakterií E. Coli plazmidem zájmu * Růst bakterií na selekční půdě (antibiotikum) * Izolace rezistentní kolonie a její namnožení v selekčním LB médiu * Izolace nízkomolekulární DNA pomocí kolonkového kitu: * Lyzace bakteriálního peletu a RNA * Precipitace proteinů a genomové DNA * Přenos supernatantu na kolonu a vazba plazmidu na pryskyřičných kuliček (promytí) * Eluce plazmidové DNA a její přečištění – * * * Izolace DNA - princip • video návod on line https://is.muni.cz/auth/el/1433/test/s_zakazky/ode15/045-medalova/DNA.mp4.video Izolace plazmidové DNA pomocí kolonkového kitu \\ha-bay.ics.muni.cz\homes prihlasovaci jmeno je> UCN\uco (VCETNE UCN\) Transfekce * Přenos cizorodé DNA pomocí vektorů * Vektory - molekuly DNA do nichž je včleněn gen zájmu * Nejčastěji se používají plazmidy - malé bakteriální kruhové molekuly DNA * SiRNA (in vitro i in vivo) 00192l http://2009.igem.org/wiki/images/1/17/HD09_p31.png Transfektanti * Cílem je vnesení cizorodé DNA do jádra eukaryotických buněk * Transfektanti – buňky obsahující cizorodou DNA –Stabilní tranfektanti: cizorodá DNA se včlenila do buněčného genomu –Tranzientní transfektanti: cizorodá DNA není integrovaná do genomu, geny v plazmidu jsou přepisovány jen po omezenou dobu cca 24 až 96 hodin https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/ProteinExpressionAnalysis/Im ages/0714/sho-transfection.jpg https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/global/life-sciences/ProteinExpressionAnalysis/Im ages/0714/sho-transfection.jpg Důležité parametry * Pro transfekci je vhodná 40 – 80 % konfluence buněk –Málo buněk – bb nejsou v kontaktu a rostou špatně –Mnoho buněk – kontaktní inhibice, zastavení v G0 vede k rezistenci k průniku DNA i jiných makromolekul * DNA proniká lépe do aktivně se dělících buněk než do G0 –V průběhu mitózy dochází k rozložení jaderné membrány, což umožní průnik DNA do jádra * U primárních kultur je kritické číslo pasáže * Snaha o co nejnižší pasáž i u stabilních linií (<50) * V sadě experimentů by se číslo pasáže nemělo příliš lišit –U imortalizovaných linií se mění charakteristika buněk v průběhu času a proto je možné že nereagují stejně i když se transfekce provádí při stejných podmínkách Confluency and Growth Phase Cells should be transfected at 40–80% confluency (cell type dependent) – Too few cells cause cell cultures to grow poorly without cell-to-cell contact – Too many cells result in contact inhibition, making cells resistant to uptake of DNA and other macromolecules Actively dividing cells take up DNA better than quiescent cells (breakdown and perforation of the nuclear membrane during mitosis enable nuclear delivery) Number of Passages for Primary Cells The number of passages should be low (<50) The number of passages for cells used in a variety of experiments should be consistent Cell characteristics can change over time with immortalized cell lines and cells may not respond to the same transfection conditions Cells may not respond to the same transfection conditions after repeated passages Stabilní transfektanti •Inkorporace plazmidové DNA nesoucí gen zájmu do genomu tak, aby nebyla umlčena, byla správně zařazená do čtecího rámce a rychle překládaná •Nutný selekční marker (rezistence k antibiotiku) – buď ve stejném plazmidu nebo transfekce dvou plazmidů najednou (5:1 ve prospěch genu zájmu) • •Postup: 1.Elektroporace genu zájmu a selekčního markeru 2.48 h inkubace v médiu bez selekčního ATB 3.Pasážování naředěných buněk (1:100, 1:500) do média se selekčním ATB – výměna po 3 dnech (do 10 dnů by měly zahynout buňky bez inkorporovaného selekčního markeru) 4.Za 2 – 5 týdnů se objeví ostrůvky rezistentních buněk 5.Vypíchnutí těchto dobře rostoucích kolonií a jejich další kultivace v médiu s ATB 6.Naředit rezistentní buňky tak, aby byla 1 b. na 100 ul média a rozpipetovat je do 96 jamkové desky. Ujistit se, že není v jamce více jak jedna buňka. Pod tlakem ATB vybrat nejlépe rostoucí kolonii. 7. • • Výsledek obrázku pro stabile transfection protocol Nejčastější metody transfekce * Směs negativně nabitého Ca(H2PO4)2 a pozitivně nabitého CaCl2 tvoří precipitát, do kterého se naváže DNA * Kationické polymery DEAE-dextran, polyetylenimin (PEI) – negativně nabitá DNA se naváže na polykation a endocytózou se přenese do buněk * Liposomy (lipofectamin) – DNA je obalena lipidovou kapsulkou, která může fúzovat s membránou * Fugene – neznámé složení neliposomálního typu, etanol * Elektroporace – vytvoření pórů (Neon) • •Krevní buňky je možné transfekovat jen elektroporací •Vápenaté ionty http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10-0826_transfection_tutorial_interactive.pdf * Smíchání DNA s CaCl2 * Přidání směsi do roztoku Ca(H2PO4)2 * Tvorba precipitátu, který se přidá k bb * Pohlcení precipitátu endocytózou nebo fagocytózou PEI * Kationické polymery jsou hydrofilické, a proto jsou rozpustné ve vodě * Jsou schopné velmi efektivně kondenzovat DNA (záporný náboj) * Komplexy DNA/PEI musí být malé (< 100 nm) * Internalizace endocytózou * Akumulace v endosomech a lyzosomech kolem jádra * Jen malé množství komplexů z těchto organel unikne a dostane se do jádra Cationic polymers differ from cationic lipids in that they do not contain a hydrophobic moiety and are completely soluble in water. Given their polymeric nature, cationic polymers can be synthesized in different lengths, with different geometry (linear versus branched). The most striking difference between cationic lipids and cationic polymers is the ability of the cationic polymers to more efficiently condense DNA. There are three general types of cationic polymers used in transfections: Linear (histone, spermine, and polylysine) Branched Spherical Cationic polymers include polyethyleneimine (PEI) and dendrimers www.nano-lifescience.com http://www.nano-lifescience.com/research/gene-delivery.html Lipofekce http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10-0826_transfection_tutorial_interactive.pdf Cationic Lipids: Liposomes/Lipoplexes Cationic lipids are amphiphilic molecules that have a positively charged polar head group linked, via an anchor, to an apolar hydrophobic domain generally comprising two alkyl chains Structural variations in the hydrophobic domain of cationic lipids include the length and the degree of non-saturation of the alkyl chains Electrostatic interactions between the positive charges of the cationic lipid head groups and the negatively charged phosphates of the DNA backbone are the main forces that allow DNA to spontaneously associate with cationic lipids Cationic Lipids: Liposomes/Lipoplexes Cationic lipids are amphiphilic molecules that have a positively charged polar head group linked, via an anchor, to an apolar hydrophobic domain generally comprising two alkyl chains Structural variations in the hydrophobic domain of cationic lipids include the length and the degree of non-saturation of the alkyl chains Electrostatic interactions between the positive charges of the cationic lipid head groups and the negatively charged phosphates of the DNA backbone are the main forces that allow DNA to spontaneously associate with cationic lipids * Kationické lipidy – liposomy/lipoplexy (Lipofectamin) * Jsou to amfifilické molekuly s kladně nabitou polární částí, která je spojena s nepolární hydrofobickou doménou * Elektrostatické interakce mezi kladnou částí a negativně nabitou DNA vede k tvorbě komplexů pohlcených endocytózou Elektroporace * Vystavení buněk elektrickému poli vede ke zvýšení permeabilizace membrány * Směs buněk a plazmidu v pufru se v kyvetě vloží do elektroporátoru * Podmínky –proud kV/cm –délka pulsu um-ms * http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/10-0826_transfection_tutorial_interactive.pdf Electroporation exposes a cell to a high-intensity electric field that temporarily destabilizes the membrane. 2 During this time the membrane is highly permeable to exogenous molecules present in the surrounding media. 3 DNA then moves into the cell through these holes. 4 When the field is turned off, the pores in the membrane reseal, enclosing the DNA inside ELEKTROPORACE - NUKLEOFEKCE https://tools.lifetechnologies.com/content/sfs/prodImages/high/TransfectSystKit.JPG * Kombinace elektroporace a dalších činidel (Resuspension buffer R/T) pro zvýšení účinnosti transfekce • * Elektrickým pulzem se naruší i jaderná membrána a plazmid se dostane přímo do jádra buněk – vysoká efektivita https://www.youtube.com/watch?v=q-4X_eTtX8o Méně časté metody * Magnetické kuličky –Paramagnetické kuličky pokryté vektorovou DNA jsou pomocí magnetu vneseny do buněk * Balistické technologie (gene gun/bioballistic=biolistic) –Částečky zlata s navázaným genem se vstřelí do buněk * Mikroinjekce –Skleněnou pipetou je vnesen roztok s DNA propíchnutím membrány (mikromanipulátory) * Laserfekce/optoinjekce –Pomocí objektivou s vysokou aperturou je světlo zaostřeno na bod (cca 1 um v průměru) po setinu sekundy, čímž se naruší cytoplazmatická membrána * * Metody založené na použití virů (infekce) * PEI –+ cena/efektivita –- nutnost výměny média (toxicita) * Lipofectamine –+ efektivita –- nutnost výměny média, cena * NEON –+ efektivita, není nutno měnit médium, použití na krevní buňky –- cena * Fugene –+ efektivita, není nutno měnit médium –- cena – –Rozhodující je poměr efektivita : cena * * Výhody a nevýhody Advantages of Lipids Deliver nucleic acids to cells in a culture dish with high efficiency Easy to use, minimal steps required; adaptable to high-throughput systems Using a highly active lipid will reduce the cost of lipid and nucleic acid, and achieve effective results Disadvantage of Lipids Not applicable to all cell types Advantages of Calcium Phosphate Inexpensive High efficiency (cell type dependent) Can be applied to a wide range of cell types Can be used for transient and stable transfection Disadvantages of Calcium Phosphate Reagent consistency is critical for reproducibility Small pH changes (±0.1) can compromise transformation efficiency Size and quality of the precipitate are crucial to the success of transfection Calcium phosphate precipitation does not work in RPMI, due to the high concentration of phosphate within the medium Advantages of Electroporation Nonchemical method that doesn’t seem to alter the biological structure or function of the target cells Easy to perform High efficiency Can be applied to a wide range of cell types Disadvantage of Electroporation Cell mortality (if using suboptimal conditions) Možnosti využití transfekce •Transfekcí je možné ovlivnit * Molekulární mechanizmy zahrnuté v kontrole buněčné proliferace, diferenciace, přežití/smrti * změnu buněčného fenotypu a mezibuněčné komunikace * Uvedené procesy hrají úlohu ve vývoji nádorových onemocnění a mohou být potencionálně využity v protinádorové terapii. • •Transfekcí můžeme vnést do buněk také * Reportérový plazmid (bGAL, LUC, CAT…) * Expresní plazmid (konjugát proteinu a fluorescenčního proteinu – GFP, YFP, mCherry…) * SiRNA (cílený knock-out genů) SHRNUTÍ transfekce ANd9GcQ8EuJf29f8HmS098egyIsR6VAaN3d8W_Kuca5vrxtlko6cf9ZM http://imgur.com/gallery/MaR3ubp