Izolace RNA Detekce RNA Nekódující RNA Manipulace genové exprese přes RNA http://www.gene-quantification.de/chapter-3-pfaffl.pdf Metody založené na práci s RNA Mgr. Jiřina Medalová, Ph.D. Oddělení fyziologie a imunologie živočichů jipro@sci.muni.cz RNA Výsledek obrázku pro RNA Tři hlavní typy RNA v buňkách A C G U https://www.youtube.com/watch?v=K1xnYFCZ9Yg od 3,15 Hypotéza RNA světa Základní fakta * celková buněčná RNA („total“ RNA) zahrnuje řadu typů RNA, které se mohou lišit svými fyzikálněchemickými vlastnostmi a tedy i nároky na jejich izolaci • * 80 % buněčné RNA tvoří ribozomální RNA • 1 - 5 % mediátorová „messenger“ RNA (mRNA) • <1 % transferová RNA (tRNA) • * pro izolaci mRNA za účelem studia genové exprese se využívají jak metody vhodné pro izolaci celkové RNA, tak specifické postupy umožňující přípravu „čisté“ mRNA; Izolace RNA * Izolace celkové RNA * extrakce pomocí organických rozpouštědel * afinitní/adsorpční metody * izolace mRNA * pomocí oligo(dT) substrátů – kuličky, kolony * zdroj – celková RNA nebo přímo z buněčných/tkáňových lyzátů * RNA je citlivá k degradaci ribonukleázami (RNázy) * nedotýkat se vzorků, pracovat v rukavicích, používat RNase-free špičky, zkumavky, voda * používat inhibitory RNáz, např. guanidin isothiokyanát (GITC) – denaturace proteinů, včetně RNáz * vedle proteinů je třeba také odstranit kontaminující DNA Výsledek obrázku pro RNA isolation Extrakce RNA pomocí organických rozpouštědel přenos RNA do čisté zkumavky – precipitace a přečištění ethanolem a vysrážená RNA je rozpuštěna ve vodě zbavené RNáz Homogenizace a lyzace buněk směs fenol:chloroform:isoamyl alkohol – inkubace a centrifugace vodná fáze obsahuje RNA, zatímco genomová DNA a zbytky buněčného materiálu vytvářejí úzkou vrstvu na rozhraní vodné a organické fáze; Afinitní purifikace RNA Lyzace buněk nanesení lyzátu na kolonu (obsahuje jak nukleové kyseliny, tak zbytky buněk) promytí ethanolem – odstraní nečistoty, zatímco nukleové kyseliny zůstanou navázány na membránu Dnáza promytí rozpuštění RNA ve RNAse-free H2O * Extrakce organickými rozpouštědly * Použitelná i ve velkých objemech * Nízké náklady * Toxická organická rozpouštědla * Časová náročnost * RNA může být kontaminována DNA • * * Afinitní purifikace * Vysoce kvalitní RNA, * Nehrozí kontaminace DNA (DNáza) * Časová úspora * Vysoká cena Srovnání metod izolace RNA Kontrola kvality a čistoty RNA * Nanodrop spektrofotometr * A260 – 1.0 ~ 40 ug/ml * A260/A280 ~ 2.0 * * * • * Agilent 2100 bioanalyzer –Kapilární eletroforéza Separace v agaróze Malý objem (2ul), rychlé měření bez speciálních kyvet qRT-PCR * dynamická regulace hladiny mRNA – detekce změn je zásadní pro studium změn exprese specifických genů; • * Kvantifikace exprese proteinů podle množství molekul mRNA využívající reverzní transkripci a PCR • * Reverzní transkripce převede mRNA na cDNA –Primery oligoT, náhodné hexa-nona oligonukleotidy, specifické primery pro konkrétní RNA * * Kvantifikace je umožněna použitím fluorescenčně značených molekul – nárůst fluorescence po každém cyklu * * Po každém cyklu je provedena detekce přírůstku = odpadá nutnost kvantifikace pomocí elektroforézy * Výsledek obrázku pro q real time PCR Značení nových řetězců DNA Principle of PCR * Interkalace fluorochromů vázajících se jen do dvouřetězcové DNA (SybrGreen) alternativa Syto9, EvaGreen… HRM dyes http://dyes.gene-quantification.info * Značení nukleotidů pomocí 32P * Použití fluorescenčně značených prób (TaqMan) Reporter: 6-carboxy-fluorescein Quencher: 6-carboxy-tetramethyl-rhodamine Reporter fluoreskuje až po degradaci quencheru exonukleázovou aktivitou Taq polymerázy Alternativa – Molecula Beacon probes, Scorpion probes qpcr-technology Typy qRT-PCR * One step qRT-PCR • - kombinace syntézy prvního cDNA řetězce (reverzní transkripce) a PCR reakce ve stejné zkumavce • + zjednodušení reakčního postupu a snížení rizika kontaminace • + rychlejší zpracování velkého množství vzorků • + díky tomu, že se amplifikují všechny mRNA (cDNA) dosáhneme • vyšší senzitivity (stačí i 0.01 pg celkové RNA) • - možné použít jen „sequence-specific“ primery • - celá reakce je použita pro jedno PCR, nemožnost opakování • * Two step qRT-PCR • - nejprve se provádí reverzní transkripce z celkové RNA pomocí oligo dT primeru za vzniku cDNA (do reakce vstupuje 1 ug celkové RNA) • - PCR probíhá v nových zkumavkách (do reakce vstupuje 1,5 ul cDNA z přepisu) • + z jednoho přepisu je možné provést cca 25 PCR reakcí (různé primery) • + možnost optimalizovat PCR s použitím různých polymeráz, primerů atp. • + srovnání exprese různých genů na stejném vzorku • - vyšší riziko kontaminace • - více pipetovacích kroků Hodnocení kvantitativní real time PCR * Určení Ct (Cp) – manuálně nebo pomocí maxima 2. derivace - bod, kde dochází k nejstrmějšímu stoupání amplifikační křivky vzorku * Čím vyšší Ct, tím méně molekul mRNA bylo ve vzorku – https://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techqpcr/ Výsledek obrázku pro tečna maximum druhé derivace Maximum 2. derivace = nejstrmější tečna Model PCR plot Křivka tání (melting curve) * Na konci reakce proběhne postupné zahřívání celé reakce, po dosažení bodu tání Tm dojde k degradaci DNA (pokles fluorescence) * Specifitu reakce ilustruje křivka tání (melting curve) – • musí mít jen jeden vrchol = jeden produkt * http://labguide.cz/metody/real-time-pcr/ Více info: https://theses.cz/id/go0fw3/Bakalarska_praceEliska_Ruzickova.pdf Vyhodnocení qRT-PCR Name Ct průměr HPRT DCt 2^-DCt F16 K3 31,84 31,43 31,635 36,39 -4,755 27,0021 F16 LY3 32,17 33,18 32,675 36,985 -4,31 19,8353 F16 K6 32,25 32,13 32,19 35,225 -3,035 8,1965 F16 LY6 31,83 31,84 31,835 34,97 -3,135 8,7847 F16 K9 31,16 31,01 31,085 36,34 -5,255 38,1867 Průměr - HPRT Absolutní kvantifikace – kalibrační křivka ze vzorků o známém množství molekul RNA Relativní kvantifikace – srovnání s expresí house-keeping genu (HPRT) RNA sequencing * Zjistit, co to je RNA sequencing!!!!! Manipulace genové exprese pomocí RNA * Antisense oligonukleotidy * RNA interference (post transkripčně) –SiRNA –ShRNA –MiRNA – RNAi Antisense DNA oligonukleotidy * Syntetické oligonukleotidy 10-20 bp * Fosfodiesterová vazba nahrazena fosfotioátovou (přidaná síra, odolná nukleázám) * Vazba antisense oligo zabrání ribozomové mašinérii produkovat protein, nebo rozštěpí RNA pomocí RNázy H (štěpí duplexy RNA/DNA) Výsledek obrázku pro antisense oligonukleotid https://www.idtdna.com/pages/products/functional-genomics/antisense-oligos Výsledek obrázku pro antisense oligonukleotid https://gedtestingcenter.org/the-theory-behind-antisense-oligonucleotide-therapy Terapie antisense oligonukleotidy * Fomivirsen (Vitravene) (IE2) – cytomegalovirová retinitida – injekce přímo do sklivce * * Mipomersen (Kynamro) (ApoB100) – homozygotní familiární vysoký cholesterol – podkožní injekce * * Affinitak (PKC-a), Genasense (Bcl-2) – nádory – injekce intratumorálně * * AV1-6002 (Ebola virus), AV1-6003 (Marburg virus) – hemoragická horečka – intravenózní podání * * AP1-2009 (Trabedersen) (TGFb2) – pokročilé gliomy • - injekce intratumorálně * Nekódující RNA * Ribozymální RNA katalyzují biochemické reakce podobně jako proteiny * snRNA (small nuclear), která odstraňuje introny při výrobě mRNA * snoRNA (small nucleolar), která pracuje na maturaci ribosomální RNA (metylace, pseudouridynylace) * scaRNA (small cajal) modifikuje snRNA a snoRNA * siRNA (small interfering), dsRNA vede k degradaci mRNA o stejné sekvenci (antivirová funkce) * hnRNA (heterogenous nuclear) vysokomolekulární RNA obsahující nezprocesovanou mRNA * Telomerázová RNA slouží jako primer pro dosyntetizování nukleotidů na 3´ konci * gRNA (guide) RNA editace, může manipulovat s bázemi * tmRNA (transfer-messenger) bakteriální RNA má funkci mRNA i tRNA zároveň * miRNA (mikro) blokuje translaci některých mRNA * piRNA (piwi interacting) interakce s proteiny piwi – postranslační umlčování * Xist – RNA umlčující X chromozom u žen * * shRNA (short hairpin) uměle vytvořená molekula tvořící RNA induced silencing complex * * Efektor - RISC * RISC - RNA-induced silencing complex * Pomocí proteinu s endonukleázovou aktivitou Argonaut(Ago) /Piwi a proteinů TRBP dojde k připojení vedoucího řetězce (guide strand, gs) do RISC * Navigace celého komplexu k místu komplementárním s gs, dicer (endoribonukleáza) vytvoří krátké úseky ds RNA a Ago (Rnáza) rozštípne vzniklý hybrid přibližně uprostřed jeho délky * Vedlejší řetězec (passenger strand, ps) je degradován nukleázami, stejně jako naštíplý gs * Výsledek obrázku pro RISC RNA https://www.invivogen.com/review-rna-interference TRBP = human immunodeficiency virus (HIV)-1 transactivating response (TAR) RNA-binding protein miRNA * mikro RNA – 21-27 b, která se přirozeně vyskytuje v genomu, je přepsána podobně jako mRNA (poly A konec, 5´čepička) do pri-miRNA (Drosha) – pre-miRNA (Dicer) – miRNA – aktivace RISC * Částečně komplementární s mRNA * Často se nachází v intronech * asi 2578 (600) miRNA v lidském genomu, ovlivňují asi 60 % genů * Často studována v souvislosti s nádory a onemocněním myokardu, deregulace exprese * Jeden gen je regulován více miRNA, jedna miRNA reguluje více genů * • Výsledek obrázku pro miRNA Processing miRNA Overview of miRNA biogenesis and function. miRNAs are transcribed by RNA Pol-II to form a pri-miRNAs which is cleaved by the nuclease Drosha to produce a pre-miRNA which exports into the cytoplasm to generate mature miRNAs by Dicer. After that, the guide strand of miRNA binds to Ago2 that linked to the RISC to modulate the translation of target mRNAs, while passenger strand of miRNA is typically degraded. Exportin 5 Výsledek obrázku pro shRNA Využití nekódující RNA – RNA interference * siRNA * Krátká dsRNA (20-25 bp) * Exogenní původ (viry) i – endogenní původ (centromery, repetice) – * shRNA * Vlásenkovitá struktura dsRNA * Čistě arteficiální struktura (plazmid) * Drosha a Dicer rozštěpí – shRNA za vzniku siRNA – http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/6/64/SiRNA_structure2.jpg Hlavní problém – jak doručit molekuly dsRNA do cytosolu siRNA vs shRNA * Stabilní nebo transientní interference * SiRNA – transientní interference (transfekce) * ShRNA - stabilní interference (pomocí infekce) * Riziko – velké množství dsRNA molekul v cytoplazmě vede k off-target štěpení * Pravidla a návod pro konstrukci oligonukleotidů https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3679364/ * In vivo RNAi * „nahá“ siRNA – játra, ledviny - Invivofectamin (Invitrogen), shRNA - Adenoviry (toxické) * Adeno-asociované virové vektory – potencionálně slibné * Terapeutické pokusy (op-shRNA) • * op-shRNA – vytvoření větší molekuly, která se lépe tranfekuje An external file that holds a picture, illustration, etc. Object name is nihms-987858-f0002.jpg Biodegradabilní polykation – např. poly(beta-amino ester) Periodická shRNA je přepisována jako konkatemer, mnoho molekul v cytoplazmě https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4923333/ Bifunkční shRNA D.D. Rao et al. / Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759 Schematic of the bi-functional shRNA concept. The bi-functional concept is to design two shRNAs for each targeted mRNA; one with perfect match, one with mismatches at the central location (bases 9–12). The purpose of the bi-functional design is to promote loading of mature shRNAs onto both cleavage-dependent and cleavage-independent RISCs, so that the expression of target mRNA can be more effectively and efficiently shut down both through target mRNA degradation and through translational repression. D.D. Rao et al. / Advanced Drug Delivery Reviews 61 (2009) 746–759 Příklady regulace miRNA v nádorech * Protinádorová funkce * Role tumor supresoru * miR-15a a16-1 * delece těchto genů je častá u B lymf CLL * Delece miRNA vede ke zvýšené expresi Bcl2 a p53, tj. potlačení apoptózy a zrychlený průchod b. cyklem * https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0753332217316530?via%3Dihub * Let7 * Mutace Let7 miRNA vede k nadměrné aktivaci genu pro Ras * Pro nádorová funkce * Aktivace drah vedoucích k podpoře metastázování * miR-21/miR-29a se váže na TLR7,TLR8 (jako ligand) * https://www.researchgate.net/publication/228105286_MicroRNAs_bind_to_Toll-like_receptors_to_induce_ prometastatic_inflammatory_response * Hypermetylace CpG ostrůvků * Umlčení miRNA vede k rozvoji nádorů * https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1574789112000798 Hypermetylace miRNA https://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1574789112000798-gr1.jpg https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1574789112000798 Shrnutí * Hypotéza světa RNA * * mRNA se nejvíce studuje v souvislosti s expresí genů (qRT PCR) • * Antisense oligonukleotidy jsou využívány i k terapii • * Nekódující RNA jsou používány jako nástroj k posttranskripčnímu umlčení genů • * Deregulace miRNA vede k progresi nádorů