Blokové cvičení z Metod aplikované biochemie a buněčné biologie 2019 Jméno: Modelový systém: HEK 293 – Human Embryonal Kidney – epiteliální charakter https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/CRL-1573.aspx?geo_country=cz Agonista antagonista https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0301468117300774 A) V nepřítomnosti Wnt ligandů, nebo v případě zablokování dráhy (DKK1, SFRP) je cytosolický b-catenin konstitutivně fosforylován v destrukčním komplexu (APC, CK1, AXIN, GSK3), následně ubiquitován a degradován v proteasomu. ZNRF3 a RNF43 (E3 ubiquitin ligázy) ubiquitinují a tak destabilizují receptory Frizzled a LRP a tak inhibují Wnt signalizaci. B) Vazba Wnt ligandů (Wnt3a) na jejich receptor inhibuje destrukční komplex, b-catenin se akumuluje, translokuje do jádra a umožňuje přepis genů, které mají v promotoru vazné místo pro TCF/LEF transkripční faktor, na který se b-catenin váže. R-spondin (RSPO) posiluje Wnt signalizaci, protože vytváří ternární komplex LGR proteinů s ZNRF3/RNF43, který indukuje autoubiquitinaci ZNRF3/RNF43, což vede k jeho degradaci v proteasomu. Wnt3a b-catenin RNF43 RSPO Ve zkratce: > > Vzorky: 1. CTR = catenin kontrolní hladina (450 ul DMEM) 2. WNT3a = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a) 3. RSPO = catenin (300 ul DMEM + 150 ul CM RSPO) 4. WNT+ RSPO+ = catenin (150 ul DMEM + 150 ul CM Wnt3a + 150 ul CM RSPO) PROTOKOLY Kultivace buněk Pasážování a vysévání buněk HEK 293 buňky (HEK) se kultivují na polystyrenových miskách firmy TPP v inkubátoru Heraeus (teplota 37 ˚C, 5 % CO[2] a 95 % vlhkost) v kultivačním mediu DMEM (Dulbecovo modifikované Eaglovo médium, High glucose, Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA) s přídavkem 10 % FBS (fetální hovězí sérum, Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1,2 mM L-glutaminu (Gibco, Thermo Fisher Scientific), a 100 U/ml Penicilinu/Streptomycinu (HyClone, Thermo Fisher Scientific). V dalším textu bude tato směs označována jako DMEM médium, pokud nebude specifikováno jinak. Pasážování zásobních HEK buněk je nutné provést každé cca tři dny nebo po dosažení 80 % konfluence. Buňkám se odsaje médium, opatrně se opláchnout 2 ml PBS (fosfátový pufr; phoshate buffered saline, pH 7,4) a pro enzymatické uvolnění buněk od povrchu misky se používá 0,5 ml Trypsin-EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová; Biotech, LM-T1706/100, Onsala, Švédsko). Po 2 - 3 minutách inkubace HEK s Trypsin-EDTA v inkubátoru by mělo dojít k uvolnění buněk, pro vizuální kontrolu buněk použijeme inverzní mikroskop CKX 41 (Olympus, Tokio, Japonsko). Následně zneutralizujeme Trypsin přídavkem 1 ml média DMEM. Suspenzi buněk (1,5 ml) přeneseme do 15 ml zkumavky. Cca 20 ul suspenze kápneme do Burkerovy komůrky. Spočítáme buňky ve 20 středních čtvercích, výsledná suma je označena jako p Množství buněk v 1 ml suspenze = p. č. h .10^3= p. 250 .10^3= p.25 .10^3 y 20 č… reciproká hodnota plochy políčka (25) h… reciproká hodnota výšky komůrky (10) y… počet políček y (20) Pro transfekci vysejeme 50 000 buněk na jednu 24W jamku (0,5 ml) (celkem 5+1 jamky = 300 000 buněk = 0,3 x10^6) Výpočet: M x 10^6 …. 1 ml 0,3 x 10^6 …. X ml Ze suspenze odebereme X ml a přidáme DMEM tak, aby celkový objem byl 6 x 0,5 ml = 3 ml (tj. 3 – X ml) Důkladně promícháme a do každé 24W jamky vysejeme 0,5 ml výsledné suspenze, zamícháme S-J+V-Z. Vložíme do inkubátoru. Pro ATP assay vysejeme: 1. 25 000 = ml 2. 50 000 = ml 3. 100 000 = ml 4. 200 000 = ml, 5. 400 000 = ml buněk do 2 ml misek. Doplníme do 2 ml DMEM, vložíme do inkubátoru. Stanovení počtu buněk ATP assay Metoda stanovení relativního množství ATP je založena na chemiluminiscenci zprostředkované ATP z lyzátu buněk. Buňky opláchneme 2 ml PBS a přidáme do misky 200 μl lyzačního pufru Somatic cell ATP releasing reagent (Sigma Aldrich) a celá směs se inkubuje 10 minut na třepačce v RT. Lyzát pak v poměru 1:1 (po 20 ul) smícháme s roztokem ATP mix (191013 Cot, BioThema, Handen, Švédsko), jehož obsahem je směs luciferázy s luciferinem. ATP z lyzátu umožní luciferáze štěpit luciferin, který pak emituje chemiluminiscenci. V co nejkratším čase pak tyto směsi lyzátů s ATP mixem měříme na luminometru Hidex. Výsledek: Transfekce buněk Buňky vysejeme den předem (150x10*3 b na jamku v 24W desce - do 0,5 ml DMEM) Zkontrolovat, jestli je konfluence 70 – 80 % Příprava transfekčních směsí – na 1 jamku: SS plazmidu 500ng/ul 1. 100 ul DMEM pure + 150 ng každého plazmidu (celkem 0,45 ug DNA) výpočet: 500 ng…. 1 ul 150 ng…. x ul 2. 100 ul DMEM pure + 1,8 ul PEI (poměr DNA : PEI = 1:4, tj. 0,45x4 = 1,8) pRLtkLuc Super8X TOP Flash pmax GFP Výpočet: DMEM pure 345 368 pmax PEI 1 jamka 100 ul 1,8 ul 6 jamek Připravené transfekční směsi důkladně zvortexujeme, krátce stočíme a necháme 15 minut inkubovat při RT. Obě zkumavky smícháme, důkladně promícháme a opět 15 minut inkubujeme při RT. Do každé jamky přidáme 210 ul výsledné transfekční směsi. Po 3 hodinách odsajeme vše z jamek, přidáme DMEM a 150 ul kondiciovaného média (CM) s WNT3a (W+) nebo Respondinem (R+) (dle rozpisu vzorků). Vše inkubujeme přes noc v inkubátoru. Stanovení účinnosti transfekce Mikroskopicky - Fluorescenci vzorků způsobenou expresí plazmidu pMAX s GFP nafotíme na konfokálním fluorescenčním mikroskopu Leica kombinací zeleného filtru a průchozího světla, abychom byli schopni určit jak množství svítících buněk, tak počet všech buněk v zorném poli. Výsledek je poměr pozitivních buněk ku všem buňkám. Výsledek: Účinnost transfekce PEI je přibližně %. Metoda TopFlash = Dual Luciferase Assay (kit Promega ) Odsajeme médium Přidáme opatrně 1 ml PBS, odsajeme, na sucho inkubujeme v -80 °C Rozmrazíme pufr LAR II a Stop & glow buffer Naředíme si 5x lyzační pufr – 1 jamka 50 ul, 6 jamek 300 ul, tj. 240 ul MQ H[2]0 + 60 ul 5x lysis buffer Přidáme 50 ul 1x lyzačního pufru do každé jamky a inkubujeme 15 min/RT na třepačce Naředíme si 100x Stop & glow reagent v Stop & glow buffer (25 ul na jamku, tj. 150 ul) Výpočet: ul Stop & glow buffer + ul Stop & glow reagent = 150 ul Nachystáme si luminometr a stripy na měření Do stripu nakapeme 20 ul lyzátu z každého vzorku (důkladně zhomogenizovaného) U luminometru velmi rychle přikápneme 25 ul LARII substrátu pro firefly (FF) luciferázu Změříme chemiluminiscenci Přidáme Stop & glow roztok pro renilla (R) luciferázu (inhibice aktivity FF luciferázy, substrát pro R luciferázu) Změříme chemiluminiscenci Výslednou hodnotu spočítáme jako podíl FF luciferázy a R luciferázy Výsledek: -K (buňky bez plazmidu) K WNT3 RSPO Wnt3a+RSPO Stanovení účinnosti transfekce fluorimetricky Lyzát z TopFlash metody napipetujeme do stripu pro fluorescenční měření a změříme při excitaci 480 nm a emisi 510 nm. Spočítáme poměr fluorescence vzorku ku netransfekované kontrole. Výsledek: -K (buňky bez plazmidu) K Wnt3a RSPO Wnt3a+RSPO qRT-PCR Izolace mRNA Ve dni 0 bylo k 70 % konfluentním buňkám přidáno CM dle rozpisu. Vzorky opatrně opláchneme PBS a poté přidáme 350 μl lyzačního pufru RLT s 1 % merkaptoethanolem (Sigma Aldrich) Výpočet: 6 vzorků = ul RLT + ul merkaptoetanolu K izolaci mRNA použijeme návod z komerčního kitu RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden, Německo) Vzorky přeneseme do 1,5 ml zkumavky, přidáme 350 ul 70 % etanolu, pipetou důkladně zamícháme (precipitace) Přeneseme do kolonky vložené do 2 ml sběrné zkumavky Centrifugace 10000 RPM/30 s, vylejeme proteklou tekutinu (RNA navázána na kolonku) Přidáme 700 ul pufru RW1, centrifugace 10 000 RPM/30 s, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 500 ul pufru RPE, centrifugace 10 000 RPM/30 s, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Přidáme 500 ul pufru RPE, centrifugace 10 000 RPM/2 min, vylejeme proteklou tekutinu (promývání) Vyměníme 2 ml sběrací zkumavku a centrifugujeme 13 000 RPM/1 min Vyměníme 2 ml zkumavku za 1,5 ml zkumavku, přidáme 30 ul RNase-free H[2]0, centrifugace 10 000 RPM/1 min (eluce) Eluát ještě jednou naneseme do kolonky a znovu zcentrifugujeme 10 000 RPM/1 min Naředíme si 1 ul vzorku + 9 ul RNase free H[2]O a změříme koncentraci vyizolované mRNA na spektrometru NanoDrop® ND-1000 Spectrometer (Thermo Fisher Scientific). Izolovanou celkovou RNA uchováváme v –80 ˚C. Přepis mRNA do cDNA = reverzní transkripce Reverzní transkripce slouží k vytvoření templátu DNA (cDNA = complementary DNA), který bude vstupovat do polymerázové řetězové reakce (PCR). Celý proces je založen na použití reverzní transkriptázy, což je RNA dependentní DNA-polymeráza. Po celou dobu práce je nutné vzorky uchovávat na ledu kvůli jejich nestabilitě. PRÁCE NA LEDU! Z celkové RNA odebereme 1 ug (výpočet), který doplníme RNase free H[2]O do objemu 11,5 ul. Přidáme 1 μl 0,5 ug/ulM Oligo(dT), inkubace vzorků 5 minut při 65 ˚C (PCR cykler). Přidáme 4 μl 5x RT reakčního pufru, 2 μl 10 mM směsi nukleotidů dNTP, 0,5 μl (20 U) RNázového inhibitoru RiboLock a 1 μl (200 U) RevertAid reverzní transkriptázy (vše Thermo Fisher Scientific). Zamícháme a krátce centrifugujeme, inkubace hodinu při 42 ˚C a dalších 10 minut při 70 ˚C pro denaturaci enzymu, čímž ukončíme reakci. Vzorky cDNA jsou skladovány při -20 ˚C. Výpočet: Vzorek koncentrace RNA 1 ug RNA (ul) H[2]O (do 11,5 ul) Reakční mix pro RT: 1 vzorek 5 vzorků 5x RT reakční pufr 4 ul dNTP 2 ul RiboLock 0,5 ul RevertAid RT 1 ul Real time PCR 1. Do každé jamky (20 ul) patří: 1,5ul cDNA templátu 18,5 ul Master mixu: 3 ul 2xcc Roche - LighCycler 480 SYBR green I master kit (směs nukleotidů, FastStart Taq DNA polymeráza, SYBR green, MgCl[2]) 0,375 ul každého z primerů (SS 20 uM) vypočítej výslednou koncentraci: 1,7 ul MgCl[2] (SS 25 mM) vypočítej výslednou koncentraci: Doředit do 18,5 ul sterilní RNase-free MQ H[2]O Detekované geny: HPRT, cMyc, Axin2, cyklin D1 Sybr green 1. primer 2. primer MgCl[2] H[2]O 1 vzorek 3 0,375 0,375 1,7 13,05 ul 16+4 vzorky 60 7,5 7,5 34 261 ul Do jamek na dno napipetovat v duplikátu (vedle sebe) master mix pro daný gen Přidat 1,5 ul cDNA všech vzorků (podle rozpisu) na horní část jamky HPRT cMyc Axin2 CD1 Zcentrifugovat 5 min/4 °C, vložit do LC 480 (Roche) A K 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 B W C R D WR E K F G H Dopiš do obrázku teploty a dobu pro jednotlivé fáze cyklu 40 cyklů Vyhodnocení podle maxima 2. derivace křivky Výsledek: Western blotting Příprava SDS lyzátů Den předem bylo k 70 % konfluentním buňkám přidáno CM dle rozpisu. Ze vzorků odsajeme médium a opatrně přidáme 1 ml PBS, které také odsajeme Přidáme 100 ul laemli lyzačního pufru (sodium dodecyl sulfate, 2 % SDS, 10 % glycerol a 100 mM TRIS pH 6,8, 0,05 % bromfenolová modř, 25% merkaptoetanol). Inkubujeme 10 minut na ledu a následně přeneseme do zkumavek (vzorky je možné uchovávat v -20 °C). PRÁCE NA LEDU! Rozbití buněčných struktur a DNA provedeme sonikací a vařením na 95 °C/5 min v bločku. SDS-polyakrylamidová gelová elektroforéza (SDS-PAGE) 2x polyakrylamidový gel 8 %, tloušťka 1 mm, 10 jamek Před nanesením vzorků na gel je důkladně zvortexujeme. Do každé jamky v gelu napipetujeme 20 μl z každého vzorku (1-8) a do krajních jamek napipetujeme 1,5 μl barevně značeného proteinového standardu (PagerRuler Plus Prestained Protein Ladder, ThermoScientific). Elektroforéza 130 V 1 hodinu (proteiny, jež díky SDS získaly záporný náboj, migrují ke kladné elektrodě). Wet blotting Přeneseme gely s proteiny rozseparovanými podle MW na metanolem aktivovanou PVDF (Polyvinylidene difluoride) membránu (Immobilon-P membrane, Merck, Kenilworth, USA), vyrobíme tzv. sandwich, důležité je myslet na to, že proteiny migrují ke + elektrodě a musí přitom přejít z gelu na membránu. Složení použitých roztoků: Transferujeme proteiny na PVDF 100 V/70 minut, membránu vyjmeme, opláchneme promývacím pufrem. Blokujeme nespecifické vazby protilátek pomocí inkubace 20 minut v blokačním pufru (5 % roztok netučného sušeného mléka rozpuštěného v promývacím pufru). Imunodetekce Nařežeme membránu na proužky, kde předpokládáme výskyt hledaných proteinů podle barevných standardů. Proužky vložíme do 50 ml falcon zkumavky, ve které jsou 3 ml roztoku blokačního pufru s příslušnými specifickými I. Ab protilátkami v příslušné koncentraci (viz obrázek). kDa 250 130 100 72 55 35 pS1490-LRP6 150-250 kDa (cs-2568, 1:1 000) R Aktivní b catenin (ABC), 92 kDa (Millipore5665, 1:1000) M Aktin b 42 kDa (sc-1615, 1:1 000) G Inkubujeme přes noc 4 °C, na rolleru Membrány druhý den přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Připravíme nové falconky s 3 ml blokačního pufru se sekundárními protilátkami (II. Ab), konjugovanými s křenovou peroxidázou, ředěnými 1:5 000. Do II. Ab vložíme opláchnuté membrány (dle druhové specifity I.Ab) a inkubujeme na rolleru 60 minut/RT. Membrány přemístíme do misky a třikrát opláchneme promývacím pufrem po dobu 10 minut (shaker). Nachystáme si substrát pro peroxidázu s obsahem peroxidu vodíku a luminolu (Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate, Merck Millipore) – smícháme obě složky v poměru 1 ml : 1 ml. Membrány znovu seřadíme a zalijeme substrátem, který špičkou rovnoměrně rozmístíme a překryjeme fólií. Detekci signálu provedeme pomocí programu FusionSL a zařízení s CCD kamerou (Fusion SL, Vilber), které detekuje chemiluminiscenci vzniklou oxidací luminolu po rozštěpení peroxidu vodíku peroxidázou. Závěr: Napište, jak odpovídají naše výsledky předpokladům