MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE
PROKARYOT (PS 2021)
Jiří Doškař, Ivana Mašlaňová
Sylabus předmětu Molekulární biologie prokaryot
1. Úvodní přednáška (obsah, literatura, význam prokaryot)
– Genom prokaryot a charakteristika jeho složek
2. Prokaryotické transponovatelné elementy
3. Využití transpozonů ke studiu prokaryotického genomu, transpozonová
mutageneze
4. Plazmidy I
5. Plazmidy II
6. HGT - Transformace
7. HGT - Transdukce
8. HGT - Konjugace
8. Mutace bakterií
9. Reparace mutačních poškození DNA u bakterií
10. Obranné mechanismy bakterií vůči externí DNA (RM systémy)
11. Obranné mechanismy bakterií vůči externí DNA (CRISPR-Cas)
12. Evoluce bakteriálních genomů
DOPORUČENÁ LITERATURA
 Maloy S.R. et al.: Microbial Genetics, 5. vydání, Jones and Barlett Publ, BostonLondon,
2010.
 Birge E.A.: Bacterial and bacteriophage genetics. Springer 2000, 2006.
 Snyder L., Peters JE, Henkin TM, Champness W.: Molecular genetics of
bacteria, 4nd ed. , ASM Press 2013.
 Miller R. V., Day M. J.: Microbial evolution – Gene establishment, Survival and
Evolution. ASM Press, Washington, D.C., 2004.
 Funnell B.E., Phillipsm G.J.: Plasmid Biology, ASM Press, Washington, D.C.,
2004, 2015
 Persing D.H. ed. Molecular Microbiology – Diagnostic Principles and Practice,
ASM Press, Washington, 2011
 Snustad P., Simmons MJ.: Genetika, český překlad, MU 2009, 2017.
 M.P. Francino: Horizontal gene transfer in Microorganisms. Caister Acad.
Press,Nerfolk, UK 2012.
 Alberts et al.: Molecular biology of the cell. Garland Publ. 2015.
 Power-pointové prezentace přednášek + doplňující texty (IS)
Informace ke zkoušce
Zkouška má dvě části:
A. Písemná příprava – student si připraví odpovědi na 7 otázek,
pokrývajících vybrané tématické okruhy z probírané látky.
Příklady otázek:
1. Znározněte schematicky a popište strukturu Ti-plazmidu a funkce jeho
genů
2. Znázorněte schematicky, jak byla experimentálně prokázána
konzervativní transpozice Tn10
3. Uveďte základní rysy přirozené transformace (charakter přijímané DNA,
průběh přenosu, způsob začlenění DNA do genomu recipienta)
4. Vysvětlete princip SOS-mutageneze
5. Shrňte rozdíly v procesu konjugace u G- a G+ bakterií.
6. Znározněte schematicky a popište fungování systému CRISPR/Cas
7. Vysvětlete pojem abortivní transdukce
B. Ústní část - student doplňuje informace k jednotlivým odpovědím na
základě dotazů zkoušejících.
Písemná příprava trvá 60 minut, ústní část 10-30 minut.
VÝZNAM PROKARYOT Z HLEDISKA
MOLEKULÁRNÍ BIOLOGIE A GENETIKY
 Modelové organismy pro studium základních
biologických procesů
 Využití bakterií v základním výzkumu (klonování
genů, studium jejich exprese, atd)
 Výhody
◼ krátká generační doba, vysoký počet jedinců
◼ snadná kultivace na definovaných půdách, znalost
metabolických drah
◼ existence dobře definovaných mutant
◼ dobře přístupné studiu, snadná izolace biol.
makromolekul a struktur
◼ studium evoluce - možnost sledování genetických
změn v krátkých časových intervalech
PRAKTICKÝ VÝZNAM
PROKARYOTICKÝCH ORGANISMŮ
 patogenita řady druhů (parazitismus - symbioza)
 využití v tradičních biotechnologiích (kvasný
průmysl, příprava nápojů a potravin)
 producenti významných látek (antibiotika, enzymy,
farmaka, sekundární metabolity)
 producenti cizorodých látek připravených
metodami GI (např. inzulin, hormony, protilátky
aj.)
 příprava probiotických preparátů (úprava
mikrobiomu, mikrobiota)
 příprava vakcín genetickou modifikací
(„infektomika“)
 využití extrémofilů a jejich produktů (bakterie a
archea)
A. poznání struktury genomu a funkce jeho složek
- vytváření cílených změn genomu za účelem navození nových vlastností:
- - příprava produkčních kmenů v biotechnologiích
- - Interakce bakterií s hostitelem (patogenní a potenciálně
patogenní druhy) – antigenní struktury x imunitní odpověď
- - příprava vakcín – metody genového inženýrství
- - vyhledání buněčných cílů (molekul a struktur) pro nová terapeutika
B. objasnění mechanismů evoluce
- charakter (makro)mutačních změn genomů
- úloha horizontálního přenosu genů v evoluci genomů
(objasnění vzniku kmenů rezistentních k léčivům nebo
kmenů se zvýšenou virulencí, vznik nových druhů)
Současné trendy v oblasti molekulární biologie prokaryot
Více než desítky tisíc popsaných bakteriálních druhů
According to a new estimate, there are about one trillion species of microbes on Earth, and
99.999 percent of them have yet to be discovered.
10,000,000,000,000,000,000 (1019) tj. deset TRILIONŮ
U prokaryot neplatí paradox hodnoty C
SROVNÁNÍ VELIKOSTI GENOMŮ
PROKARYOT A EUKARYOT
Obsah GC = 22-75 mol%
Velikost genomu vybraných druhů bakterií
1,6 Mb
Velikost genomů bakterií podle jejich životního stylu
Volně
žijící
Obligátní
paraziti
Obligátní
symbionti
Volně
žijící
Velikost genomu
Velmi nízký obsah
paralogních genů
Symbiont Carsonella ruddii, obsahuje kružnicový chromozom o velikosti 159,662 bp, má 182
ORFs, obsah GC 16.5%. Její genom je zatím nejmenší z popsaných, má nejvyšší obsah AT.
97% genomu má kódující kapacitu, jeho geny se překrývají a mají redukovanou velikost.
Geny pro translaci a biosyntézu aminokyselin jsou početné, ale řada genů považovaných za
esenciální chybí. Carsonella se tak podobá organelám.
Genome reduction appear to reach limits of about 400 kb and about 20% GC, which are believed to be the
minimal limits for cellular organisms
Relationship between
genome sizes and GC
content of 358 complete
genomes from Bacteria
and Archaea: red
indicates Carsonella; blue
represents
endosymbionts
Buchnera, Blochmannia,
Wigglesworthia, and
Baumannia; yellow, other
Bacteria; and green,
Archaea
Carsonella ruddii (nebo též Candidatus C. ruddii, protože nebyla kultivována) je endosymbiotická proteobakterie
s nejmenším genomem ze všech buněčných organismů.[1] Carsonella ruddii žije uvnitř těla určitého druhu mer,
drobného hmyzu. Má jen 159 662 párů bází a jejich genom je složen pouze z 182 genů, což je méně, než bylo
vydáváno za minimální nutné množství genů k životu.[1] Mnoho důležitých genů patrně chybí, a tak se zdá, že se
Carsonella dostává v těle svého hostitele do pozice „organely“.[2]
Na hmyzím jedinci jsou patrny žluté skvrny, jsou to místa, kde
endosymbiotické bakterie jsou součástí buněk těla svého hostitele.
Jeden bez druhého se již nemůže obejít. Jsou to svědci evoluce, kdy
se z bakterie stává organela. Útvaru, ve kterém hostitel svého hosta
hýčká, se říká bakteriom.
mera
Nanoarchaeum equitans
Nanoarchaeum equitans je neobvyklý druh archea, objevený v roce 2002. Většinou je řazen do
samostatného kmene Nanoarchaeota, přestože některé studie ho řadí k Euryarchaeota. Dosahuje i na
prokaryotické poměry velmi drobných rozměrů. Byl objeven v mořích poblíž Islandu mikrobiologem Karlem
Stetterem a jeho kolegy.
Popis
Nanoarchaeum byl objeven v horké vodě poblíž hydrotermálních průduchů v mořích u Islandu. Jelikož zde
voda dosahuje bodu varu, jedná se o hypertermofila. Zajímavou skutečností je fakt, že zde Nanoarchaeum
žije v symbiotickém vztahu s jiným archeonem, a to z rodu Ignicoccus. Tento vztah je některými vědci
považován za parazitismus a Nanoarchaeum je tedy zatím jediným známým parazitem z domény archea.
Nanoarchaeum je extrémně drobný, jeho kokovité buňky mají v průměru asi 400 nm.Také genom je velmi
malý a je vůbec nejmenší mezi všemi buněčnými organismy: má jen 490 885 párů bazí. Tato DNA je
však velmi efektivní a 95% jsou kódující sekvence (kódují proteiny či některé druhy RNA). Na druhou
stranu však nebyly nalezeny geny pro biosyntézu lipidů, kofaktorů, aminokyselin či nukleotidů.
Nanoarchaeum
equitans
Mozaikový charakter
Variabilní složka
genomu – adaptace
na prostředí
Vysoká
dynamika
a plasticita
Rozdíly v obsahu
VGE u různých druhů
Variabilní genetické elementy (VGE)
(20 % genomu S. aureus)
Chromozomové kazety
rezistence k meticilinu
(SCCmec)
Jedinečné ostrovy
patogenity (SaPI)
Společné genomické
ostrovy
Profágy
Lokus přídatného
genového regulátoru
(agr)
Integrované plazmidy
Repetitivní elementy
(STAR)
Inzerční sekvence
a transpozony
Pangenom (supra-genom)
Soubor genů u daného druhu bakterií nebo archeí
- odpovídá celkovému počtu genů zjištěných u kmenů
daného druhu – obsah a forma genů u různých kmenů
se výrazně liší.
„Core“ genom – geny přítomné u všech kmenů
Postradatelná část genomu – geny přítomné jen u dvou
nebo více kmenů, často na mobilních elementech
Jedinečné geny – geny vyskytující se pouze u jednoho
kmene
Pangenom určitého bakteriálního druhu může být až
řádově vyšší než jsou genomy jednotlivých kmenů
Počet kopií chromozomu: 1-40/buňku (haploidie, ~polyploidie)
MCLR – multiple chromosome-like replicons – známy u 44 druhů
Příklady organizace bakteriálních genomů
Hlavní chromozom Rhizobium leguminosarum o velikosti 5 Mb
a soubor plazmidů o velikostech od 0.87 kbp do 0.15 Mb, které
dohromady představují 35% celého genomu
Příklady bakteriálních druhů obsahujících více replikonů
PŘÍKLADY PROKARYOT S LINEÁRNÍM
CHROMOZOMEM
 Streptomyces (S. ambofaciens, S. lividans) 10 Mb
 Borrelia burgdorferi (B. hermsii) 0.95 Mb
 Coxiella burnetii 2,1 Mb
 Paracoccus denitrificans - tři molekuly DNA
◼ 2 Mb; 1,1 Mb; 0,64 Mb, dvě jsou lineární
 Agrobacterium tumefaciens - tři molekuly DNA
◼ 3,0 Mb; 2,1 Mb; 0,55 Mb; 0,25 Mb
dNTP vázající se na TP (telomerový
protein) poskytuje 3'-OH
Vlásenkové telomery
Invertronové telomery
Replikace lineárního chromozomu u bakterií r. Borrelia
Protein ResT (telomere resolvase
protein) vytvoří zlomy v obou řetězcích
a znovuspojí je za vzniku vlásenek
Bakteriofág N15 – koncová oblast tos
jeho lineárního genomu + protein TelN –
přenos těchto elementů do E. coli vede k
linearizaci jejího chromozomu
Velikost genomu a počet genů u bakterií a archeí
SEKVENOVANÉ GENOMY PROKARYOT
Současný stav: několik tisíc kompletně sekvenovaných genomů, u
některých druhů více kmenů: značné rozdíly ve velikosti a struktuře
SpeciesStrainTypeBase PairsGenes
Acidobacteria bacterium Ellin345 Acidobacteria 5,650,368 4,777
Acinetobacter sp. ADP1 Proteobacteria Gammaproteobacteria 3,598,621 3,325
Agrobacterium tumefaciens C58 Proteobacteria Alphaproteobacteria 2,841,581 2,722
Anabaena nostoc PCC7120 Cyanobacteria Nostocales 6,413,771 5,368
Anabaena variabilis ATCC29413 Cyanobacteria Nostocales 6,365,727 5,039
Anaeromyxobacter dehalogenans 2CP-C Proteobacteria delta-epsilon 5,013,479 4,346
Anaplasma marginale StMaries Proteobacteria Alphaproteobacteria 1,197,687 949
Anaplasma phagocytophilum HZ Proteobacteria Alphaproteobacteria 1,471,282 1,264
Aquifex aeolicus VF5 Aquificae Aquificae 1,551,335 1,522
Azoarcus sp. EbN1 Proteobacteria Betaproteobacteria 4,296,230 4,128
Bacillus anthracis Ames Firmicutes Bacilli 5,227,293 5,311
Bacillus anthracis Sterne Firmicutes Bacilli 5,228,663 5,287
Bacillus cereus ATCC10987 Firmicutes Bacilli 5,224,283 5,603
Species Strain Type bp Genes
http://www.sanger.ac.uk/resources/downloads/bacteria/
SEKVENOVANÉ GENOMY: ARCHAEA
Aeropyrum pernix K1 1,669,695 2,694
Archaeoglobus fulgidus DSM4304 2,178,400 2,407
Haloarcula marismortui ATCC43049 3,131,724 3,131
Haloferax volcanii DS2
Halobacterium species NRC1 2,014,239 2,058
Methanobacterium thermoautotrophicum delta-H 1,751,377 1,869
Methanocaldococcus jannaschii DSM2661 1,664,970 1,715
Methanococcoides burtonii DSM6242 2,575,032 2,273
Methanococcus maripaludis S2 1,661,137 1,722
Současný stav: několik desítek kompletně sekvenovaných genomů
Species Strain bp Genes
GENETICKÁ ORGANIZACE
PROKARYOTICKÉHO GENOMU
 velmi kompaktní genom s malými mezerami
mezi geny
 většina genomu je obsazena strukturními
geny (převážně jednoduché geny, u ¼
genomů byly nalezeny introny II sk
 malá část (10%) je tvořena nekódující DNA
 operonové uspořádání genů (většinou funkčně
příbuzných)
 pořadí genů není u prokaryot konzervováno
90%
10%
TYPY SEKVENCÍ PROKARYOTICKÉHO
GENOMU
 Kódující oblasti (na chromozomu n. plazmidech)
◼ Geny (ORF) se známou nebo neznámou funkcí
◼ Inzerční sekvence a transpozony
◼ Profágy (a defektní profágy)
 Sekvence přepisované do RNA (rRNA, tRNA)
 Repetice
◼ Polynukleotidové sekvence a tandemové repetice
◼ Krátké roztroušené repetitivní sekvence
◼ Dlouhé roztroušené repetitivní elementy
◼ Mosaikové repetitivní elementy
◼ Chi-místa a jim podobné sekvence
◼ Rhs elementy
Organizmus
Hustota genů je zhruba stejná: 1 gen ~ 1 kb
POČTY PARALOGNÍCH GENŮ
V GENOMECH BAKTERIÁLNÍCH DRUHŮ
Se zvětšováním genomu se zvyšuje obsah paralogních genů
HGT, genové duplikace
Evoluční vztahy mezi ortologními a paralogními geny
Jako homologní jsou označovány geny odvozené z jednoho společného (ancestrálního) genu. Již v roce 1970 bylo
navrženo dělení homologních genů na dva typy: geny paralogní a geny ortologní. Paralogní geny jsou výsledkem
duplikace ancestrálního genu, zatímco ortologní geny jsou výsledkem speciace.
TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH
GENOMECH
A. Polynukleotidové sekvence a tandemové
repetice
 Trinukleotid TGG – nejčastější trinukleotid E. coli (součást penta
nebo oktanukleotidů)
 Nonamer AAGTGCGGT (uptake signal sequence
– USS) H. influenzae - 1465 kopií
 Tandemově opakované polynukleotidové sekvence (GTG)n
nebo (GCC)n - vysoce repetitivní u E. coli, S. typhimurium a
Shigella sp.
 Short tandemly repeated repetitive (STRR) sequences
- heptanukleotidová opakování u sinice Calothrix
 Major polymorphic tandem repeat (MPTR) - polymorfní 10-bp
DR u Mycobacterium tuberculosis a dalších mykobakterií
(podobnost s místy Chi a roztroušenými REP elementy)
TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH
GENOMECH
B. Krátké roztroušené repetitivní sekvence
(kratší než 50 bp)
 REP (repetitivní extragenové palindromatické sekvence) 38
bp, 500 REP u E. coli
 PU (palindromic units) u E. coli a S. typhimurium.
 Mnohokopiový 26-mer (Ngrep) u Neisseria gonorrhoeae a N.
meningitidis
 Mnohokopiový 24-mer DR element u Mycobacterium bovis
(38 kopií)
TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH
GENOMECH
C. Dlouhé roztroušené repetitivní elementy
(delší než 50 bp)
 intergenic repeat unit (IRU)
 enterococcal repetitive intergenic consensus (ERIC) 126 bp
nebo zkrácené formy. Chromozomová lokalizace se liší u kmenů a
druhů
 ERIC-like sekvence 127 bp – enterobakterie, celá bakteriální říše.
 RLEP (545 - 1063 bp) u Mycoplasma leprae 28 (0,6%
genomu)
 Mx-rep u Myxococcus xanthus - 87 pb jádrová sekvence
 Dr-rep (SARK) u Deinocccus radiodurans Element o
variabilní délce (150-192 bp)
 RepMP2, RepMP1, SDC1 (150 bp – 1 kb) u Mycplasma
pneumoniae, v genomu 8-10 kopií.
 RepMP2-like u Staphylococcus
TYPY REPETICÍ V PROKARYOTICKÝCH
GENOMECH
D. Mosaikové repetitivní elementy
 Bacterial Interspersed Mosaic Elements (BIME) –
(kombinace REP a sedmi dalších repetitivních motivů).
500 u E. coli a dalších G- enterobakterií (Klebsiella pneumoniae, S.
typhimurium)
 REP MP 1 300 bp element ohraničený kratšími repetitivními
sekvencemi u M. pneumoniae.
 BOX elementy – rozptýlené repetitivní elementy u G+
(Streptococcus pneumoniae).
„Genomic signature“ - charakteristika frekvence jednotlivých
typů oligonukleotidů v genomech. Genomic signature je u
fylogeneticky příbuzných genomů podobná.
Signature genomics – vyhledávání mutací zodpovědných za choroby
ZÁVĚRY ZE SROVNÁNÍ
SEKVENOVANÝCH GENOMŮ
 Počet informačních genů je v každém genomu
zhruba stejný, i když se jejich velikosti liší až 5x.
 Počet genů ostatních funkčních kategorií je
mnohem variabilnější a má tendenci se zvyšovat
 Se zvětšováním velikosti genomu přibývá
paralogních genů a zvětšuje se též biochemická
komplexita organismu.
 Jedna čtvrtina ORF u každého druhu je
jedinečná a nemá významnou sekvenční
homologii k žádné známé nukleotidové nebo
proteinové sekvenci.
HORIZONTÁLNÍ PŘENOS GENŮ
 Často přenášené: operační geny
(metabolismus a regulace, buněčné struktury)
 Zřídka přenášené: informační geny
(transkripce, translace)
 Horizontálně jsou přenášeny variabilní genetické
elementy (a geny na nich lokalizované)
◼ profágy,
◼ plazmidy,
◼ IS-elementy,
◼ transpozony,
◼ Integrony
◼ Genomické ostrovy
POČET HORIZONTÁLNĚ PŘENESENÝCH GENŮ
U VYBRANÝCH DRUHŮ BAKTERIÍ A ARCHEIÍ
Druh Velikost genomu (Mbp) Počet ORF Horizontálně přenesené ORF
Proteobacteria počet %
Escherichia coli 4,64 4289 381 9,6
Haemophilus influenzae 1,83 96 96 6,2
Helicobacter pylori 1,67 1553 89 6,4
Rickettsia prowazekii 1,11 834 28 3,6
Gram-pozitivní bakterie
Bacillus subtilis 4,21 4100 537 14,5
Mycoplasma genitalium 0,58 480 67 14,5
Mycoplasma pneumoniae 0,82 677 39 5,9
Mycobacterium tuberculosis 4,41 3918 187 5,0
Spirochaete
Borrelia burgdorferi 0,91 850 12 1,56
Treponema pallidum 1,14 1031 77 8,3
Chlamydiae
Chlamydia trachomatis 1,04 894 36 4,3
Deinococcus radiodurans 2,65 2580 95 3,92
Synechocystis sp. 3,57 3169 219 7,5
Thermotoga maritima 1,86 1846 198 11,63
Archaea
Aeropyrium pernix 1,67 2694 370 14,0
Methanobacterium therm. 1,75 1869 179 10,3
Methanococcus jannaschii 1,66 1715 77 5,0
Pyrococcus abyssi 1,76 1765 124 7,35
Bakterie s umělým genomem
Tým čtyřiadvaceti genetiků v čele s Craigen Venterem syntetizoval v
laboratořích The J. Craig Venter Institute dědičnou informaci
jednoduché bakterie Mycoplasma mycoides složenou z více než
milionu písmen (1 Mbp) genetického kódu. Tak dlouhou molekulu
nelze vyrobit najednou. Vědci nejprve syntetizovali její kratší části a ty
pak skládali do větších celků. Nakonec byly součásti genomu tak
velké, že si s nimi už laboratorní technika neporadila. Finální
kompletaci bakteriální DNA proto genetici svěřili buňkám kvasinek. V
těch pak získali úplný genom bakterie, který přenesli do příbuzné
bakterie Mycoplasma capricolum.
Gibson DG, et al.: Creation of a bacterial cell controlled by a chemically synthesized
genome. Science. 2010 Jul 2;329(5987):52-6.
FYZIKÁLNÍ ORGANIZACE
BAKTERIÁLNÍHO CHROMOZOMU
 dsDNA - není obalená jadernou membránou
 vazba malých proteinů typu HU (histon-like)
- 105 molekul, vázajících se sekvenčně nespecificky, ovlivňujících
flexibilitu DNA (ohýbání DNA do smyček) („architektura“ nukleoidu).
Účast při replikaci, transkripci a rekombinaci
 Proteiny HN-S vázající se na AT-bohaté oblasti DNA, zvyšuje její teplotní
stabilitu a brání transkripci. Možná mají podobnou funkci jako histony.
 Protein Fis – ovlivňuje topologii a superhelicitu DNA
 Vazba proteinu IHF (integration host factor), vázající se sekvenčně
specificky na DNA, zejména na regulační oblasti
 50 superhelikálních smyček u E. coli, bez účasti RNA
 kontrola stavu superhelicity: topoizomeráza, gyráza – změny vinutí při
replikaci, přichycení na membránu
Archea: mají rudimentární histony příbuzné histonům eukaryot
STRUKTURA CHROMOZOMU E. coli
 4,6 Mb, 50% GC, 1 μm
Bakteriální nukleoid
…molekulární mechanismy udržující nukleotid v buňce jsou
neznámé, ale jistě existují specifické systémy, které zajišťují jeho
replikaci, transkripci, rekombinaci a další funkce…
Organizace chromozomu u E. coli.
Esteban Toro, and Lucy Shapiro Cold Spring Harb
Perspect Biol 2010;2:a000349
(A) The Caulobacter chromosome is linearly organized, and anchored to the flagellated pole viaparS/ParB/PopZ. (B)
In Vibrio cholerae, the origin region of the larger chromosome (chromosome I) is localized to the cell pole, whereas the
origin of the smaller chromosome is localized to the cell center. The organization of the bulk of the chromosomes, as well
as their separation or intermingling, are currently unknown. (C) Four loci have been localized in vegetative cells of Bacillus
subtilis, and their organization is reminiscent of the linear order seen in Caulobacter. Although the origin region is localized
near to one pole, it appears not to be anchored to the cell membrane. (D) Sporulating cells of B. subtilis, however, do
anchor the origin region, through RacA/DivIVA, to the negatively curved membrane at the pole. RacA also binds all along
the chromosome, compacting it into a long “axial filament” before sporulation. (E) The E. coli origin localizes to mid-cell,
and the two replichores are separated into opposite cell halves. The terminus is broadly localized (arrows), and may be
found on either side of the cell center
Organizace chromozomu u modelových bakterií