Měření rychlosti čistého příjmu nitrátu sledováním úbytku NO3
z
roztoku
Hodnocení vlivu indukce na rychlost příjmu, sledování kinetiky příjmu
1. Obilky kukuřice necháme cca 5-7 dní naklíčit na miskách s polyethylenovými (PE) perlami zalitými
vodou.
2. Vzrostlé semenáčky potom přesadíme do míchané vodní kultury. Kultivační vanu (16 pozic, 6 L)
naplníme živným roztokem o poloviční koncentraci (1,25 ml každého zásobního koncentrátu na 1 L
roztoku) a semenáčky do víka vany upevníme pomocí měkkých zátek po dvou do každého otvoru.
Vany umístíme do klimaboxu při teplotě 20°C a fotoperiodě 16 h. Pět až sedm dní před
předpokládaným měřením přeneseme polovinu rostlin do jiné kultivační vany naplněné roztokem
obsahujícím všechny živiny kromě dusíku (= neindukované rostliny) a u druhé poloviny rostlin
pouze vyměníme původní roztok s obsahem dusíku za čerstvý o stejném složení (=indukované
rostliny).
3. Před vlastním měřením připravíme v klimaboxu PE lahvičky se vzduchovaným živným roztokem.
Podle typu roztoku a předpůsobení rostliny rozdělíme rostliny na dvě varianty s šesti úrovněmi
dusíku (3 opakování ve variantě):
a) živný roztok s dusíkem ve formě nitrátových iontů (indukované rostliny)
v koncentracích: 0,1 - 0,2 – 0,5 – 1 – 2 - 5 mM
b) živný roztok s dusíkem ve formě nitrátových iontů (neindukované rostliny) ve stejných
koncentracích jako v bodě a)
Živný roztok bude mít stejné složení, jako ten, ve kterém byly pěstovány indukované rostliny
(Hoaglandův roztok), lišit se bude pouze koncentrací nitrátů.
4. Všechny roztoky připravíme v dostatečném množství a jejich pH nastavíme na 6,0.
5. Asi hodinu před začátkem inkubace rostliny opatrně přeneseme z kultivačních van do expozičních
nádobek naplněných stejným roztokem, jako byl v kultivačních vanách, abychom omezili vliv stresu
z manipulace s rostlinami na rychlost příjmu.
6. Na začátku měření rychlostí příjmu (inkubace) z každé z lahviček odsajeme (pomocí hadičky
napojené na vývěvu s rezervoárem) opatrně všechen živný roztok a lahvičku naplníme příslušným
čerstvým roztokem podle typu varianty. Odměříme přesně objem inkubačního živného roztoku a
znovu upevníme rostliny. S rostlinami manipulujeme velmi opatrně a zejména se snažíme co
nejméně dotýkat kořenů.
7. Zbytky připravených roztoků použijeme na stanovení počáteční koncentrace nitrátových iontů.
8. Od okamžiku zasazení rostlin do roztoku měříme délku expozice rostlin (s přesností na minuty),
která by měla být v rozmezí 1 - 3 hodiny, podle koncentrace nitrátu ve sledovaném roztoku – menší
koncentrace – kratší inkubace.
9. Na konci měření vyndáme rostliny z lahviček. Z kořenů při tom opatrně okapeme živný roztok
zpátky do lahvičky.
10. Změříme koncový objem živného roztoku v nádobce pomocí odměrného válce a roztok uschováme
v uzavřené lahvičce pro stanovení koncové koncentrace nitrátů. Vzorky uchováváme v mrazničce.
11. Kořeny měřených rostlin osušíme buničitou vatou, oddělíme od nadzemní části a zvážíme jejich
čerstvou hmotnost. Potom je vložíme do označeného sáčku a usušíme při 80°C 24 h.
12. Koncentraci nitrátů v roztoku stanovíme buď pomocí ISE nebo spektrofotometricky.
13. Rychlost čistého příjmu potom vypočítáme pro každou lahvičku zvlášť podle níže uvedeného
vzorce a vztáhneme ji jak na čerstvou hmotnost, tak i na sušinu kořenů. Při výpočtu látkového
množství NO3
musíme
brát v úvahu jak změnu koncentrace, tak i změnu objemu v průběhu expozice
rostlin!
NUR = [n(NO3
)1
– n(NO3
)2]/
(m * t) [ mol g-1
h-1
]
NUR - rychlost čistého příjmu
n(NO3
)1,
n(NO3
)2
- látkové množství NO3
v
lahvičce na začátku a na konci expozice (mol)
m – hmotnost kořenů v lahvičce (g)
t – časový interval, po který byly rostliny exponovány (h)
14. Vypočtěte průměrné rychlosti příjmu pro každou koncentraci NO3
a
pokusnou variantu a zapište do
tabulky s naměřenými daty. Zjištěné průměrné rychlosti vyneste do grafu v závislosti na
koncentraci nitrátových iontů v roztoku.
Měření koncentrace nitrátových iontů v roztoku
Kolorimetrické stanovení
Tento způsob analýzy je výhodný zejména pokud potřebujeme přesně analyzovat roztoky s nízkou
koncentrací NO3
–
nebo máme-li k dispozici pouze malé množství vzorku.
1. Připravíme čerstvá reakční činidla. Činidlo A - 5 g k. salicylové rozpustíme v 96% H2SO4 a
doplníme na 100 ml 96% k. sírovou. Činidlo B - rozpustíme 40 g NaOH v dest. vodě a
doplníme na 500 ml dest. vodou.
2. Připravíme kalibrační řadu z koncentrátu (0,0680 g NaNO3 rozpustíme ve 100 ml dest. vody =
8mM ) ředíme na 0 - 0,1 - 0,2 - 0,5 - 1,0 - 2,0 - 4,0 -6,0 mM do 50 ml odměrek.
3. Provedeme reakci v označených 1,5 ml mikrozkumavkách : 40 l činidla A přidáme k 10 l
vzorku nebo standardu, promícháme, rychle centrifugujeme (cca 20 sec.) a necháme inkubovat
20 min. při pokojové teplotě. Potom přidáme 1 ml činidla B, promícháme a necháme
vychladnout na pokojovou teplotu. Absorbanci vzorků měříme při 410 nm.