Měření aktivity NR 1
Stanovení aktivity nitrát reduktázy in vivo
Princip stanovení: Aktivitu enzymu nitrát reduktázy (NR) sledujeme na základě rychlosti
tvorby produktu katalyzované reakce – nitritu za přítomnosti vysokého nadbytku substrátu a
stabilního pH. Toto technicky jednoduché stanovení vychází z předpokladu, že aktivita NR se
v pletivech rostlin výrazně nemění i několik desítek minut po oddělení od zbytku rostliny.
Protože na počátku měření už v pletivu redukce probíhá, je nutné korigovat rychlost tvorby
nitritu na jeho počáteční obsah v pletivu. Proto při analýze používáme dvě sady vzorků.
Cíl práce: Zjistit aktivitu NR v listech a kořenech rostlin tabáku za různé dostupnosti nitrátu
v médiu a určit, jak se varianty liší v relativním rozdělení aktivity NR mezi kořeny a listy.
Pomůcky: 20 ml lahvičky s víčky, třepačka, vodní lázeň, pH metr
Materiál: rostliny tabáku (Nicotiana tobacco) pěstované ve vodních kulturách obsahující 0,2
6 mM roztok dusičnanových iontů.
Inkubační roztok:
Fosfátový pufr 100 mM, pH 7,5, 5% 1-propanol, 100 mM KNO3
Příprava pufru z roztoků - K2HPO4 – [V-ml]:200 400 600
- [m-g]: 3.484 6.968 10.452
- KH2PO4 – [V-ml]:100 200 300
- [m-g]: 1.361 2.722 4.083
Přidávejte pomalu roztok KH2PO4 k roztoku K2HPO4 za stálého míchání až do dosažení
požadovaného pH.
Rozpusťte 1.01g KNO3 ve 100 ml pufru a vznikne 100 mM roztok.
Postup inkubace:
Opláchněte měřené pletivo destilovanou vodou.
Nakrájejte pletivo na malé kousky, dobře promíchejte a připravte z každého orgánu rostliny 4
vzorky (z listů o hmotnosti 0,1g, z kořenů 0,2g) a vzorky dejte do označených inkubačních
lahviček. Aktivitu změříte ve třech rostlinách každé varinaty.
Přidejte 5 ml inkubačního roztoku do každé lahvičky a začněte měřit čas inkubace.
Lahvičky dejte na třepačku.
Po 10 minutách dejte první 2 vzorky z každého orgánu do vodní lázně zahřáté na 95°C. Po 15
min. lahvičky vytáhněte, nechte zchladnout. Přeneste cca 1,5 ml inkubačního roztoku do
označené mikrozkumavky. Uložte v mrazničce.
Po 90 minutách dejte do vodní lázně zbytek lahviček a opakujte stejný postup jako u první
sady vzorků.
Analýzu provedeme u 5 rostlin z každé varianty.
Měření aktivity NR 2
Analýza koncentrace nitritu:
Roztoky: 1% sulfanilamide v 3M HCl (=sulfanilic acid-SAC) – 1.05g sulfanilamide rozpusťte
ve 100 ml HCl
0.02% NED-HCl ve vodě, 20 mg NED (N-1-Naftyl Etylendiamin Dihydrochlorid)
rozpusťte ve 100 ml H2O
Postup:
Smíchejte 0.5 ml inkubačního roztoku + 0.5 ml NED + 0.5 ml SAC ve 2ml mikrozkumavce,
dobře promíchejte.
Inkubujte v temnu 20 min.
Změřte absorbanci roztoku při 540 nm.
Příprava kalibrační řady:
Rozpusťte 172.5 mg NaNO2 v 500 ml vody, tím získáte 5mM zásobní roztok A. Rozpusťte
5ml roztoku A v 50ml odměrné baňce a získáte 0.5 mM zásobní roztok B.
Zředěním 0.5, 1, 2, 5, 8 and 10 ml roztoku B ve vodě v 50ml odměrkách získáte 5, 10, 20, 50,
80 a 100 uM standardní roztoky.
Postup vyhodnocení:
U párových vzorků (z jednoho orgánu) odečteme množství nitritu (na jednotku inkubované
biomasy) zjištěné po 10 minutách od množství zjištěného po 90 minutách. Výsledkem bude
množství nitritu vytvořené při vlastní inkubaci (80minut) a to pak podělíme časem inkubace
v hodinách a získáme aktivitu NR v příslušném vzorku pletiva (mikromol NO2- g(čerstvé
hmotnosti)-1 h-1).
Výsledky prezentujeme ve sloupcovém grafu jako srovnání průměrné aktivity v kořenech a
listech u obou zkoumaných variant.