> > >
Masivně paralelní sekvenování
Boris Tichý
Sdílená laboratoř Genomika
Brno, 20.09.2021

‹#›
> >
Informace je uložená v DNA
Informace uložená jako sekvence bazí A, C, G, T
V každé lidské buňce je ~ 3 miliardy bazí = ~ 3 metry = ~ 6.6 pikogramů
Sekvence DNA je v každé bunce stejná

‹#›
>
Sekvenování DNA
> >
Vytvoření různě dlouhých fragmentů DNA
Dideoxy-NTPs → ukončení polymerace
Gel → kapilární elektroforéza
Značené primery nebo ddNTPs
https://www.youtube.com/watch?v=FvHRio1yyhQ
https://www.youtube.com/watch?v=e2G5zx-OJIw

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
PCR amplifikace jednotlivých DNA fragmentů a sekvenování
nebo
Sekvenování jednotlivých DNA fragmentů
= Single molecule sequencing
Sekvence je čtena při syntéze nového řetězce
Technologie a přístroje přizpůsobeny paralelizaci
Stovky milionů jednotlivých PCR reakcí a sekvenací najednou
(běžně prodávané kapilární sekvenátory jsou max. 96-kapilární)
Většinou kratší sekvence – desítky bazí
(kapilární – běžně až 1000 bazí)

‹#›
>
Sekvenování DNA

>
Masivně paralelní sekvenování
> >
Sequencing by synthesis
Polymeráza
Sestavování nového řetězce z jednotlivých nukleotidů
Sequencing by ligation
Ligáza
Sestavování nového řetězce z oligonukleotidů
>
Non-enzymatic sequencing
Nanopory, elektronová mikroskopie
Přímé čtení sekvence

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Roche/454
Pyrosekvenování
>
https://www.youtube.com/watch?v=bFNjxKHP8Jc
https://www.youtube.com/watch?v=hL--H_u649A

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Ion
Emulzní PCR

> >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Ion Torrent
>
https://www.youtube.com/watch?v=ZL7DXFPz8rU&t

> >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Ion Torrent
> > >
Ion Torrent PGM
Kapacita 2GB/běh
Ion S5
Kapacita 10+GB/běh
Ion Proton
Kapacita 10+GB/běh

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Bridge amplifikace

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Sekvenování s reverzibilními terminátory

‹#›
> > > >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Patterned flowcell + exclusive amplification
https://www.youtube.com/watch?v=fCd6B5HRaZ8
https://www.youtube.com/watch?v=DJQn-qA6tTw

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
Sekvenování s reverzibilními terminátory

‹#›
> >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie Illumina
> > >
NextSeq 2000
Kapacita 3 genomy/běh (9/týden), 360GB/běh
NextSeq 550
Kapacita 1 genom/běh (3/týden), 120GB/běh
MiSeq
Kapacita 0,15 genomu/běh, 15GB/běh
>
NovaSeq
Kapacita 48 genomů/běh (150/týden) , 6TB/běh
> >
MiniSeq
Kapacita 0,07 genomu/běh, 7,5GB/běh
iSeq
Kapacita 0,01 genomu/běh, 1,2GB/běh

‹#›
> >
Masivně paralelní sekvenování
Qiagen GeneReader
>
Uzavřená technologie
emPCR + SBS

‹#›
>
Masivně paralelní sekvenování
> > >
Class IIs restriction endonucleases
400 – 500 bp
Technologie cPAL

‹#›
>
Masivně paralelní sekvenování

‹#›
>
Masivně paralelní sekvenování

‹#›
> >
Masivně paralelní sekvenování
Sekvenování (hybridizací a) ligací

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie cPAL
Kompletní systém pro sekvenování lidských genomů a exomů
Výrobce BGI (Čína)
Kapacita 12.000 genomů/rok, cena $ 12M

‹#›
> >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie cPAS
DNBSEQ-T7
DNBSEQ-G50
DNBSEQ-G400
20G/6Tb
300M/60Gb
3,5G/1,4Tb

‹#›
> >
Masivně paralelní sekvenování
Technologie SMRT
(Single Molecule Real Time)
>
With an active polymerase immobilized at the bottom of each  ZMW, nucleotides diffuse into the ZMW
chamber. In order to detect incorporation  events and identify the base, each of the four
nucleotides A, C, G and T are  labeled with a different fluorescent color. Since only the bottom
30nm of the  ZMW is illuminated, only those nucleotides near the bottom fluoresce.
http://www.pacb.com/smrt-science
https://www.youtube.com/watch?v=NHCJ8PtYCFchttps://www.youtube.com/watch?v=v8p4ph2MAvI

‹#›
> >
Masivně paralelní sekvenování
Oxford Nanopore
> >
https://www.nanoporetech.com
https://www.youtube.com/watch?v=hs0FdiTHMbc
https://www.youtube.com/watch?v=GUb1TZvMWsw
'Strand sequencing' is a technique that passes intact DNA polymers through a protein nanopore,
sequencing in real-time as the DNA translocates the pore.
>
SmidgION
MinION
GridION
PromethION

‹#›
> > >
Masivně paralelní sekvenování
ReadCoor
Fluorescent In Situ Sequencing

‹#›
> > >
Kontrola kvality vzorku
Metody
Spektrofotometrie
Fluorimetrie
Elektroforéza
PCR/qPCR
Problematické vzorky
FFPE – fragmentace, modifikace
Rostliny – kontaminace
Tkáně – fragmentace
...

‹#›
>
Kontrola kvality vzorku
> >
NanoDrop
Trinean DropSense
Substrakce kontaminant
…
Spektrofotometrie

‹#›
> > >
Kontrola kvality vzorku
Qubit
Fluorimetrie
>
Fluorescenční barviva
Aktivace vazbou s DNA/RNA
PicoGreen
RiboGreen
OliGreen
Kvantifikace neovlivněná kontaminanty
Selektivní kvantifikace dsDNA, ssDNA, RNA

‹#›
> >
Kontrola kvality vzorku
Elektroforéza
>
Integrita (fragmentace)
Kontaminace
Koncentrace
Agarosový gel
Fragment Analyzer
BioAnalyzer
TapeStation
...

‹#›
> > >
Kontrola kvality vzorku
PCR/qPCR
Kontrola integrity
PCR produkty různých délek
Kvantifikace
Detekce PCR inhibitorů

Adobe Systems > >
Děkuji za pozornost
Středoevropský technologický institut
c/o Masarykova univerzita
Žerotínovo nám. 9
601 77 Brno, Česká republika
www.ceitec.cz | info@ceitec.cz