1
Laboratorní cvičení: Farmakologie Imunoterapie 2020
V rámci laboratorního cvičení budou připraveny různé morfologie liposomálních nanočástic,
a to metodou hydratace lipidního filmu s následnou sekundární úpravou: extruze a opakované
rozmražení v tekutém N2. Do liposomálních nanočástic bude během hydratace enkapsulováno
různé množství hovězího albuminu, BSA. Metodou dynamického rozptylu světla, DLS, bude
stanovena velikost, polydisperzita a koncentrace liposomů. Morfologické změny částic budou
také pozorovány pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM).
Teoretická část
Liposomy (Ilustrační video)
Liposomy představují uzavřené dvojvrstvé vezikuly složené z amfifilních látek, nejčastěji
fosfolipidů, dosahující velikosti od zhruba 20 nm, až po mikrometrové částice. Jejich
samovolný vznik ve vodném prostředí je řízen zejména hydrofobním efektem. Minimalizace
entropicky nevýhodné interakce mezi acylovým řetězcem fosfolipidu a okolní vodnou fází vede
k organizaci fosfolipidových molekul do dvojvrstvy a k následné vezikulaci. Strukturu
ovlivňuje geometrie jednotlivých molekul. Pokud je polární část větší než nepolární acylový
řetězec, molekuly se formují do struktur s velkým poloměrem zakřivení, micel. Pokud je polární
a nepolární část srovnatelně velká, molekuly mají tendence tvořit dvojvrstvy. Reverzní
struktury vznikají v případě menší polární části oproti acylovému řetězci1
.
Jejich rigidita, struktura a velikost je dána jednak lipidní kompozicí a také metodou přípravy.
Obecně se liposomy rozlišují dle velikosti na SUV (small unilamellar vesicles), LUV (large
unilamellar vesicles) a GUV (gigant unilamellar vesicles). Dle počtu lamel na unilamelární,
multilamelární, multivesikulární, multivesikulárních multicentrické částice (viz Obr. 1) a dle
náboje na neutrální, anionické nebo kationické. Důležitým parametrem je teplota fázového
přechodu, tj. teplota přechodu z uspořádaného, rigidního stavu do fluidní membrány. Tato
teplota závisí na stupni nasycenosti a délce acylového řetězce, může se pohybovat od −20 °C
pro nenasycený dioleoyl až po cca 55 °C pro nasycené řetězce u distearoylfosfatidylcholinu1
.
2
Obr. 1- Srovnání strukturních typů liposomů2
Metody přípravy lipidních nanočástic (Ilustrační video II)
Mezi klasické metody přípravy liposomů v objemu (batch metody) patří zejména: Hydratace
lipidního filmu: (Ilustrační video zde) Daná kompozice fosfolipidů je rozpuštěná v organickém
rozpouštědle, nejčastěji chloroformu či ve směsi chloroform/metanol. Rozpouštědlo je následně
odpařeno za sníženého tlaku v rotační vakuové odparce. Odpařením vznikne na stěně skleněné
baňky tenký film jednotlivých dvojvrstev fosfolipidu. Film je poté hydratován vhodným pufrem
za intenzivního míchání za dané teploty, dle nejvyšší tranzitní teploty daného fosfolipidu. Takto
vzniklé vezikuly se vyznačují velkou polydisperzitou a různým počtem lamel (MLV). Metodu
lze doplnit mražením a rozmražením suspenze, kdy vznikají unilamelární liposomy s větším
objemem enkapsulované vodné fáze. K dosažení cílené velikosti a polydisperzity/homogenity
vezikul slouží další sekundární metody zejména extruze (Obr. 3 – Manuální extrudér.Obr. 3),
při které je suspenze liposomů opakovaně tlačena přes uniformní válcové póry polykarbonátové
membrány, čímž dochází k redukci jejich velikosti dle velikosti pórů (Obr. 4)3
.
Obr. 2 – Schéma přípravy liposomů metodou hydratace lipidního filmu se sekundární
úpravou (Avanti® Polar Lipids).
3
Obr. 3 – Manuální extrudér.
Obr. 4 – Příklad postupného snižování velikosti (A) liposomů extruzí. 3.0 – suspenze liposomů
před extruzí, 3.1 – extruze přes 400nm membránu, 3.2 – extruze přes 200nm membránu, 3.3 –
extruze přes 100nm membránu a 3.4 – extruze přes 80nm membránu. (B) nárůst koncentrace
částic při extruzi. Data měřená pomocí dynamického rozptylu světla, MADLS.
Další možností přípravy liposomů je Mikrofluidní metoda, výsledkem které jsou lipidní
nanočástice (LNP) s přesně navrhnutou strukturou a vysokou mírou enkapsulované látky.
Princip je založen na laminárním mísení organické (lipidní) a vodné (RNA) fáze v kapiláře o
konstantním průtoku a pod konkrétním úhlem. Laminární, či turbulentní proudění je dáno
Reynoldsovým číslem dle rovnice:
(1)
kde ρ – hustota tekutiny; V – rychlost tekutiny; D – průměr kapiláry; µ - dynamická viskosita
tekutiny. Pro hodnoty Re < 2100 se jedná o laminární proudění, které zajišťuje homogenní
míchání s vysokou mírou opakovatelnosti. Pod odkazem naleznete ilustrační video Reynoldsův
experiment.
Při míchání je liposom sestavován postupně zevnitř. Nižší pH způsobí, že ionizovatelný lipid
začne být kationický, čímž začnou první elektrostatické interakce se záporně nabitou RNA a
4
zformují jádro částice. Ostatní lipidy se zformují okolo jádra. Video od komerční firmy pro
ukázku: Ilustrační video Mikrofluidiky.
Důležitým faktorem určujícím enkapsulační efektivitu (EE) a biologickou aktivitu LNP je N/P
poměr. Jedná se o molární poměr mezi aminy (N, kladné v nízkém pH) na ionizovatelných
lipidech a fosfáty (P, záporné) na struktuře RNA. N/P poměr se mění v závislosti na formulaci,
nelze tedy určit jeden optimální poměr pro všechny formulace. Nižší N/P poměr vede k většímu
objemu enkapsulované látky, nicméně by nikdy neměl být 1:1, neboť by kladný náboj nestačil
pro ochranu RNA.
Obr. 5 – Schéma spojení RNA(-) s lipidy (+) a vytvoření adekvátního N/P poměru pro ochranu
RNA (®2020 Precision nanosystems inc.).
Napříč dalšími faktory je třeba zmínit parametry mixování, které ovlivňují charakteristiky
částice, jako je velikost či polydisperzní index (PDI). Celkový průtok (TFR) a Průtokový poměr
(FRR) jsou nejlépe ovlivňující parametry ladění pro dosažení optimálních částic pro danou
aplikaci. Obecně se dá říct, že vyšší TFR a FRR koresponduje s menšími částicemi.
Obr. 5 – Schéma mikrofluidní kazety (B) a jejího výřezu pro ukázku laminárního proudění (A)
(®2020 Precision nanosystems inc.); Detail mikrofluidního kanálku (C)
5
Dynamický rozptyl světla (Ilustrační video III)
Metoda dynamického rozptylu světla ((DLS – z anglického Dynamic Light Scattering), dává
do korelace Brownův pohyb s velikostí částic. Brownův pohyb je náhodný pohyb částic
vyvolaný tepelným pohybem rozpouštědla, které naráží do částic analytu. Rozptýlené záření (v
našem případě červený laser, 633 nm) v určitém čase různými částicemi vykazuje fázový posun
a jednotlivé paprsky vzájemně interagují. Interakce může být positivní nebo negativní a to
v závislosti na vzájemné pozici částic. Za daný časový úsek částice změní svoji polohu právě
díky Brownovu pohybu. Malé částice jsou tímto pohybem ovlivněny více než částice velké.
Protože se tak změní vzájemná pozice částic, změní se i fázový posun a tím celková intenzita
rozptýleného záření. Vzdálenost částic od detektoru se v čase neustále mění a tím se neustále
mění intenzita rozptýleného světla. Fluktuace intenzity koreluje s rychlostí pohybu částic. Pro
malé částice, pohybující se rychle, bude i větší míra fluktuace intenzity rozptýleného záření,
než v případě velkých, pomaleji se pohybujících částic4,5
.
Měření takových změn intenzit je vyjádřeno autokorelační funkcí. Zařízení, korelátor, posuzuje
míru podobnosti mezi dvěma signály za krátké časové úseky (viz Obr. 6).
Obr. 6 – Schématické znázornění fluktuace intenzity rozptýleného záření jako funkce času4
.
Počáteční intenzita rozptýleného světla je postupně porovnávána s intenzitou v čase t + dt,
t + 2dt, t + 3dt až t = ∞. Časové úseky (dt) jsou v řádu nanosekund/mikrosekund. Jednotlivé
intenzity se od sebe v čase odchylují, v čase t = ∞ je myšleno čas v řádu desítek milisekund,
kdy už nedochází ke korelaci, korelační faktor se rovná nule. Oproti tomu pro ideální korelaci
se korelační faktor rovná jedné. Graf závislosti korelační funkce na čase se nazývá korelogram.
Čas, ve kterém začne korelační funkce prudce klesat, je vyjádřením průměrné velikosti částic
vzorku. Sklon křivky je pak charakteristický pro polydisperzitu vzorku4
.
6
Korelační funkce
Pro monodisperzní částice má korelační funkce G exponenciální tvar a je vyjádřena rovnicí:
1 B ∙ exp 2 ,
sin "
#
$,
(1)
kde τ je časová prodleva mezi jednotlivým záznamem, B je amplituda funkce, rychlost pohybu
částic, způsobená Brownovým pohybem, je vyjádřena difuzním koeficientem D,
n je index lomu disperzního prostředí, λ0 je vlnová délka laseru a θ je úhel pozorování vzhledem
k počátečnímu paprsku4
.
Pro polydisperzní vzorky se do rovnice (1) zavádí suma všech exponenciálních poklesů
zahrnutých v korelační funkci.
Obr. 7 – Příklad korelační funkce pro malé a velké částice 4
.
Velikost částic je vypočítána z translačního difuzního koeficientu použitím Stokes-Einsteinovy
rovnice:
%
&'
6)* (2)
kde Rh je hydrodynamický poloměr, D je difuzní koeficient, k je Boltzmanova konstanta, T je
teplota a η je viskozita prostředí.
Hydrodynamický poloměr představuje aproximaci, jejíž hodnota referuje ke kulové částici o
daném průměru, která má stejný difuzní koeficient jako analyt. Difuzní koeficient není závislý
jen na jádru částice, ale také na její struktuře, koncentraci a iontové síle. Celková koncentrace
iontů v roztoku ovlivňuje rychlost difuzního pohybu částice, a to změnou tloušťky elektrické
dvojvrstvy, Debyeovy délky. Zvětšení elektrické dvojvrstvy zapříčiní snížení rychlosti difuze,
částice se poté jeví větší4
.
Distribuční analýza
Analýzou korelační funkce lze získat jednak střední velikost částic (z-average)
a vyjádření distribuce (index polydisperzity) metodou Analýza kumulantů (Cumulants
analysis). Další, nezávislou analýzou korelační funkce získáváme rovněž distribuci velikosti
7
analyzovaného koloidu. Takto získaná velikost je vyjádřena jako závislost relativní intenzity
rozptýleného světla na různých velikostech analytu. Kromě distribuce intensity rozlišujeme
distribuci dle objemu a počtu. Distribuce dle intensity bude vyjádřena6
:
%,-
100 /-01
/-01 /231 (3)
kde Na je počet částic frakce a, %Ia vyjadřuje relativní intensitu částic o velikosti a, obdobně
počet částic Nb pro velikost b. Rozdíl intensity rozptýleného světla populací a a b se bude lišit
v poměru 1:1 000 000. Poměr plyne z Rayleigho aproximace, kdy je rozptýlené světlo úměrné
průměru částic d6
. Pro stejný případ dvou populací bude distribuce objemu, relativní objem
částice Va o velikosti a je vyjádřena6
:
% -
100 /-04
/-04 /234 (4)
Jednotlivé populace se budou lišit v poměru 1:1000, poměr plyne ze závislosti objemu koule,
která je úměrný průměru částic d3
. Posledním typem je distribuce počtu, kde jednotlivé
populace budou v poměru 1:16
:
%/-
100 //-
/2
(5)
Obr. 8 – Příklad teoretického rozdělení dvou částic o velikosti 5 a 50 nm dle počtu (červená),
objemu (zelená) a intenzity (žlutá)6
.
MADLS (Multi-angle dynamic light scattering) (Ilustrační video IV)
Technika MADLS rozšiřuje metodu DLS o dva měrné úhly. Back scattering 173°, nejčastěji
užívaný v DLS, kombinuje se Side scattering 90° a Forward scattering 12°. Limitace plynoucí
z použití jednoho měrného úhlu popisuje Mieho rozptyl tj., asymetrický rozptyl světla
na částicích větších, než je 1/20 vlnové délky použitého světla, s převahou šíření ve směru
původního paprsku (viz Obr. 9). Na schématu jsou viditelná intenzitní minima a maxima.
Částice, spadající svojí velikostí do oblastí minima, budou vykazovat nízkou intenzitu
rozptýleného světla, a nízkou míru rozlišení. Kombinací tří úhlů lze minimalizovat limitace
plynoucí z Mieho rozptylu a ze závislosti intensity rozptýleného světla na velikosti, která roste
8
se šestou mocninou průměru částice MADLS umožnuje rozlišit rozptýlené světlo pocházející
z relativně malých částic, u kterých dostáváme nízký signál pro forward scattering, ale lze je
dobře rozlišit v back scattering a side scattering, od rozptylu pocházejícího od velkých částic
o nízké koncentraci v oblasti Mieho minima, které jsou pro back scattering a side scattering
v oblasti nízké intenzity7,8
.
Obr. 9 – Porovnání intensity Mieho rozptylu při různých úhlech8
.
Oproti DLS, zavádí MADLS také tzv. adaptivní korelaci, která porovná jednotlivé koreogramy
a izoluje ty, u kterých se projevují náhodné události, které nevypovídají o celkové povaze
vzorku, například výskyt prachové částice. S rostoucí citlivostí tj., se zmenšujícím se objemem,
ze kterého je snímán rozptyl světla, roste pravděpodobnost těchto událostí. Adaptivní korelace
tyto náhodné události izoluje, což se projeví na kvalitě výsledné korelační křivky. Kombinací
intenzity rozptýleného světla ze všech tří úhlů spolu s velikostí částic a z informací o indexu
lomu částic a prostředí, umožnuje technika MADLS vypočítat koncentraci částic v objemu8
.
Transmisní elektronová mikroskopie TEM (Ilustrační video VI)
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) je mikroskopická metoda, při které je preparát
(tenký řez o tloušťce cca 100 nm nebo suspenze částic uchycená na mřížce) ozařován paprskem
elektronů. Primární elektrony jsou emitovány z katody, tenkého wolframového vlákna (o
průměru cca 0,1 mm) tvarovaného do písmene „V“. Katoda je žhavena na mezní teplotu (cca
2800 K), při překročení této teploty dochází k termoemisi elektronů. Kromě termoemise
rozlišujeme také autoemisní generování elektronů, kdy je naproti studené katodě ve tvaru hrotu
umístěna elektroda s vysokým napětím. Vzniklé silné elektrické pole uvolňuje elektrony
z povrchu hrotu. Pro termoemisní princip je vyžadováno vakuum v rozmezí 10−3
až 10−5
Pa,
pro autoemisní princip pak vakuum 10−7
až 10−8
Pa. Vlákno katody je vystředěno do otvoru
tzv. Wehneltova válce. Primární elektrony jsou „odsávány“ z otvoru Wehneltova válce ke
kruhové anodě. Elektrony mající správný směr jsou urychlovány dále do tubusu k čočkám.
9
Elektromagnetické čočky elektrony fokusují do tenkého svazku a udržují jejich trajektorii,
takto fokusované primární elektrony interagují se vzorkem. Interakcí dochází k pružným a
nepružným rozptylům (Obr. 10).
Obr. 10 – Schéma interakce primárního paprsku elektronů se vzorkem.
Při pružném rozptylu primární elektrony interagují s jádry atomu, vlivem interakce jsou
elektrony odchýleny od původní trajektorie. Při nepružném rozptylu pak primární elektrony
interagují s elektrony v elektronovém obalu, a tím tyto elektrony přechodně excitují. Tento
primární proces excitace se využívá v elektronové spektroskopii (Electron Energy Loss
Spectroscopy - EELS). Různé typy deexcitace, příkladem RTG emise, emise Augerových
elektronů, katodoluminiscence, umožňují spojit, strukturní informace vzorku s informacemi o
jejím složení nebo elektronových charakteristikách.
Obr. 11 – Schématické znázornění principu Transmisní elektronové mikroskopie9
.
10
Pro zobrazení vzorkem prošlých elektronů je třeba převést elektrony do oblasti viditelného
světla. K tomuto účelu slouží stínítko (pokryto ZnS), které, v závislosti na intenzitě
dopadajících elektronů, převádí signál na viditelné světlo (nejčastěji okolo 550 nm). Snímky
jsou následně získány pomocí CCD kamery9
.
11
Experimentální část
1. PBS pufr:10mM Na2HPO4 1,78 g; 1,8 mM KH2PO4 0,245 g; 2,7 mM KCl 0,20 g;
137mM NaCl 8,01 g v 1 litru H2O.
2. BSA: 10 mg proteinu do 1 ml PBS
Příprava liposomů metodou hydratace lipidního filmu
1) Postupně, do dvou jednotlivých zábrusových baněk s kulatým dnem bude naváženo
dané množství jednotlivých lipidů dle kompozice EPC (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3ethylphosphocholine)
/Cholesterol v molárním poměru 75/25, které bude následně
rozpuštěno v chloroformu tak, aby výsledná koncentrace v každé baňce činila 1 mg/ml
celkového lipidu.
2) Pomocí vakuové odparky, za stálého otáčení a zvýšené teploty opařeno rozpouštědlo za
vzniku lipidního filmu
3) Takto vzniknou dva lipidní filmy, které budou následně hydratovány:
a. Do baňky bude napipetován 1 ml pufru PBS, za stálého míchní dojde k uvolnění
lipidního filmu
b. Do druhé baňky bude napipetován 1 ml roztoku hovězího albuminu v PBS o
koncentrace 10 mg/ml, po uvolnění lipidního filmu bude směs opakovaně
zamražena a rozmražena v tekutém dusíku v počtu 5 cyklů.
4) Jednotlivé vzorky budou dále opakovaně extrudovány přes polykarbonátovou
membránu, 200 nm.
Příprava liposomů metodou mikrofluidního směšování
1) Dle požadované kompozice bude naváženo požadované množství jednotlivých lipidů,
tak, aby výsledná koncentrace po rozpuštění v etanolu byla 4 mg/ml. Takto bude
připravena organická fáze. Jako vodná fáze bude sloužit Milli-Q voda.
2) Jednolité roztoky budou nasáty do plastových injekčních stříkaček a umístěny do
mikrofluidního čipu.
3) Procesní parametry na přístroji Benchtop: TFR 7 ml/min, FRR 3:1.
Charakterizace pomocí DLS
1) Pipetou bude přeneseno cca 70 µl suspenze liposomů do čisté křemenné kyvety
2) Vzorky budou postupně proměřeny za konstantní teploty 25 °C v duplikátu pod úhlem
173°, back scatter, 90° side scatter a 12,3° forward scatter.
Charakterizace pomocí TEM
1) Kapka suspenze liposomů bude umístěna na mřížku
2) Asi po jedné minutě bude pomocí filtračního papíru z mřížky odstraněn zbylý roztok
3) Vzorek bude barven 2% roztokem kyseliny fosfowolframové či molybdenanem
amonným.
4) Přebytek kyseliny bude vysušen filtračním papírem.
5) Vzorky budou pozorovány při zvětšení 7 500 × a zrychlovacím napětí 80 kV.
12
Literatura
1. Lasic, D. D. Liposomes in gene delivery. (CRC Press, 1997).
2. Van Swaay, D. & Demello, A. Microfluidic methods for forming liposomes. Lab Chip
13, 752–767 (2013).
3. Bangham, A. D., Hill, M. W. & Miller, N. G. A. Methods in Membrane Biology. (Plenum
Press, 1974). doi:10.1007/978-1-4615-8960-0.
4. Malvern Panalytical Ltd. Dynamic Light Scattering: An Introduction in 30 Minutes. 1–
8 (2000).
5. Kaszuba, M. Dynamic and Electrophoretic Light Scattering Overview. 1–11 (2017).
6. Malvern Instruments. Dynamic Light Scattering. Technical note 15
https://www.malvernpanalytical.com/en/support (2014).
7. Cummins, P. G. & Staples, E. J. Particle size distributions determined by a
&quot;multiangle&quot; analysis of photon correlation spectroscopy data. Langmuir 3,
1109–1113 (1987).
8. Malvern Panalytical Ltd. Improved component resolution with Multi- Angle DLS (
MADLS ). 1–14 (2018).
9. Atomic World - Transmission electron microscope(TEM) - Principle of TEM.
http://www.hk-phy.org/atomic_world/tem/tem02_e.html.
13
Vyhodnocení a ukázka dat
Výsledky měření DLS/MADLS
Obr. 12 – MADLS Data, Intensity distribution: Liposomy hydratované PBS, po extruzi
Obr. 13 – MADLS Data, Intensity distribution: Liposomy hydratované PBS, po extruzi a
opakovaném rozmražení/ zamražení v tekutím dusíku.
Obr. 14 – MADLS Data, Intensity distribution: Liposomy hydratované roztokem 10 mg/ml
BSA v PBS, po extruzi a opakovaném rozmražení/ zamražení v tekutím dusíku.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00
Intensity(Percent)
Size (d,nm)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00
Intensity(Percent)
Size (d,nm)
Intensity (Percent) -PBS, mražení
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00
Intensity(Percent)
Size (d,nm)
Intensity (Percent) - PBS + BSA 10mg/ml, mražení
14
Obr. 15 – MADLS Data, Number distribuce: Liposomy hydratované PBS bez mražení,
Liposomy hydratované PBS opakovaně zamražené v N2, Liposomy hydratované 10 mg/ml BSA
s opakovaným cyklem zamražení v N2.
Tabulka 1 – souhrnná tabulka DLS měření,
z-average
(d.nm)
PdI
Total Number Concentration
(particles/ml)
Liposomy - PBS 193 0,231 4,28E+10
Liposomy - PBS, mražení 188 0,260 8,46E+10
Liposomy - PBS + BSA 10mg/ml, mražení 178 0,313 9,90E+10
Výsledky obrazové analýzy TEM
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
1,00 10,00 100,00 1000,00 10000,00
Intensity(Percent) Size (d,nm)
Number (Percent) - PBS
Number (Percent) - PBS, mražení
Number (Percent) - PBS + BSA 10mg/ml, mražení
Obr. 16 – TEM snímky liposomů bez úpravy rozmražením v tekutém dusíku
15
Obr. 17 – TEM snímky liposomů po opakovaném rozmrazování/zamrazování v N2