Elektroforéza Rozdělení proteinů na základě pohyblivosti v el. poli K realizaci je nutné mít: • Stejnosměrný el. proud • Speciální elektroforetické vany • Vhodný pufr a nosič (dříve papír, acetátcelulóza, agar) nyní agaróza polyakrylamidový gel Elektroforéza v imunologii molekuly s (–) nábojem ® k anodě (+) (+) nábojem ® ke katodě (–) proti zrychlení působí odpor prostředí pohyblivost molekul je dána: 1. velikostí povrchového náboje - elektrochemicky se uplatňují pouze skupiny na povrchu globulární ~ KONFORMAČNÍ STRUKTURA - velmi silně se mění vlastnosti při denaturaci ~ na povrch se dostanou další skupiny ® mění se elektrochemické vlastnosti 2.velikostí molekul - větší se pohybují pomaleji ~ odpor prostředí - záleží i na velikosti síta nosiče 3. tvaru molekul - kulovité se pohybují rychleji 4. podmínkami prostředí * typ nosiče ~ agaróza, polyakrylový gel * hodnota pH tlumivého prostředí /pufru/ * iontové složení prostředí • 2 způsoby elektroforézy: · volná ~ volný elektrolyt, elektrody volně v roztoku - po vypnutí proudu molekuly difundují zpět ® nákladné a nepřesné · zónová ~ zvýšení viskozity prostředí, ve kterém se elektroforéza provádí ( např. ve vodě větší rychlost difuze než ve škrobu ) - vytváří se tedy pórovité gely - škrob, acetylcelulóza, agar, polyakrylamid, agaróza Postup: - směs bílkovin se nanese do míst startu, pustí se el. proud ® bílkoviny se detekují Imunoelektroforetické metody - kombinace metod elektroforetických a imunodifúzních • Bílkoviny se dělí v závislosti na molekulové váze a elektrickém náboji jednotlivých molekul v přítomnosti vhodného pufru a na vhodném nosiči. • Dělení séra - jednotlivé obloučky znamenají jednotlivé bílkoviny ® detekce až 35 sérových proteinů Imunoelektroforetické metody • imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA • RAKETOVÁ imunoelektroforéza • PROTISMĚRNÁ imunoelektroforéza • DVOJROZMĚRNÁ imunoelektroforéza Imunoelektroforéza podle WILLIAMSE a GRABARA: • - 1953 Williams a Grabar • - 2 stupně: 1. nalití destičky ( agarózní gel s pufrem ) vytvoření 2 žlábků a nanesení Ag mezi ně • po rozdělení elektroforézou se do žlábků 2. napipetují protilátky • inkubace 48 hodin v lednici ® dochází k DIFUZI • ® v místě ekvivalence se vytváří PRECIPITAČNÍ obloučky Raketová • - Laurell 1966 • - kombinace jednoduché radiální imunodifúze s elektroforézou • - monospecifická Ab + jeden Ag /či směs Ag/ PROTISMĚRNÁ imunoelektroforéza • obměna jednosměrné dvojité imunodifúze, kdy je pohyb urychlován el. proudem DVOJROZMĚRNÁ imunoelektroforéza • vypracována nezávisle na sobě : 1965 Laurell a Laurellová 1966 Clair a Frieman - postup: · nalití čistého gelu + Ag – elektroforéza, rozřeže se Imunoelektroforetické metody • Využití: Imunoelfo séra se v současné době používá výhradně k průkazu monoklonálního imunoglobulinu v lidském séru – paraproteinu – monoklonální gamapatie. Je vždy produkován klonem buněk vycházející z jedné plazmatické b., mající genetickou informaci pro tvorbu jedné variabilní oblasti lehkých a těžkých řetězců a jedné třídy Ig molekuly. Na rozdíl od imunoglobulinů běžného séra s velkým mn. různých variabilních oblastí Ig molekul. Využití imunoelfo séra • Při podezdření na monokl. gamapatii se stanovuje mn. mono,-bi,-nebo oligoklonálních protilátek, které jsou produkty jednoho nebo několika málo patologicky zmnožených kmenů B lymfocytů • Paraprotein se nachází. 1. u nemocných s myelomem (nádor vycházející z plazmatických buněk) 2. při jiných malignitách lymfatického systému, 3. při chronických zánětech 4. ve vyšších věk. skupinách Imunofixace I. • Výsledek: • TSP levé patologické, vpravo normální nález • Levá ELFO patologická v paraproteinu IgG, řetězec kappa • Vpravo ELFO normální • Vzniká neobvyklý pruh při klasické elfo séra, neboť paraprotein se pohybuje uniformně (stejný náboj a Mr). V určitém místě elektroforetického pruhu způsobí vysokou koncentraci Ig příslušné třídy. Při následné precipitaci s přidaným antisérem je v oblasti, kam paraprotein doputoval, výrazně více antigenu, precipitační linie je deformovaná a posunuta blíže ke žlábku s antisérem Imunoelektroforéza Výsledek: • TSP levé patologické, vpravo normální nález • Levá ELFO patologická v paraproteinu IgG, řetězec kappa • Vpravo ELFO normální Imunofixace II. Imunofixace-výsledek