Protokol ELISA


Metodika se sestává ze čtyř částí: 1. Stanovení koncentrace antigenu

                                                       2. Navazování antigenu na destičku

                                                       3. Optimalizace metody ELISA – jsmše
nedělali

                                                       4. Vyšetření vzorků ELISA

1.Stanovení koncentrace antigenu

            Stanovení koncentrace antigenu pomocí kalibrační křivky za použití různého ředění
albuminu. Ke stanovení koncentrace antigenu je nutné:
 1. Přichystat 5 různých koncentrací albuminu: 2 mg/ml; 1,5 mg/ml; 1 mg/ml; 0,5 mg/ml; 0,1 mg/ml.
 2. Na mikrotitrační destičce smíchat v triplikátech 5 ml vzorku s 25 μl roztoku činidel A  a 200
ml činidla B. Po cca 20 min. se změří absorbance při 700 nm.

3.      Vytvořit z hodnot albuminu kalibrační křivku a dopočítat koncentraci proteinů.


průměrné koncentrace (mg/ml)

SS

A

G

                                                                                           1,139989

                                                                                           0,484945

                                                                                           0,727945


Koncentrace antigenů kmenů B. b. sensu stricto je 1,139989 mg/ml, B. afzelii je 0,484945 mg/ml a B.
garinii je 0,727945mg/ml.

2. Postup navazování antigenu na destičku

            Po zjištění koncentrace antigenu se postupuje dalším krokem - navazováním antigenu na
destičku. S destičkou je po celou dobu nutno pracovat velmi opatrně a je nedotýkat se spodní strany
jamek.

1.       Do každé jamky mikrotitrační destičky se napipetuje 200 ml etanolu (70%). Poté je destička
přikryta víčkem a nechá se stát v klidu na vodorovné ploše při laboratorní teplotě cca 2 hodiny.

2.       Po uplynutí stanovené doby se etanol odsaje a jamky se 3x promyjí destilovanou vodou (200
ml na každou jamku). Zbytky kapaliny z jamek je třeba odstranit mírnými údery do čistého
filtračního papíru.

3.       Nyní je potřeba zředit antigen na koncentraci 2-3 mg/ml ve vazebným roztoku. Do každé
jamky se napipetuje po 100 ml takto zředěného antigenu.

4.       Takto připravená destička je v této fázi zakryta víčkem a ponechána přes noc v lednici
(při 4 °C). Nezbytné je opět zachovat její vodorovnou polohu.

5.       Druhý den je třeba odpipetovat obsah jamek a opět 3x promýt promývacím roztokem (200 ml na
jamku), oklepat a nechat oschnout.

6.       Nyní zbývá vysytit zbylou plochu na plastu, kde není navázán antigen. Do každé jamky se
napipetuje po 100 ml vazebného roztoku s rozpuštěným 3% kaseinem. (Pufr musí mít teplotu
laboratoře, aby se kasein v roztoku dokonale rozpustil.) Nyní se destička nechá stát při
laboratorní teplotě cca 2 hodiny.

7.       Odsát obsah jamek a 3x promýt 200 ml promývacího roztoku, poté je potřeba destičku opět
oklepat a nechat oschnout.

8.       Nyní jsou destičky připraveny k provedení ELISA testu. V této fázi také mohou být destičky
uloženy v lednici po dobu 2 měsíců (důležité je zabránit přístupu vlhkosti).


3. Pracovní postup ELISA

1.       Nejprve je nutné naředit vyšetřovaná séra na optimální koncentraci blokovacím roztokem.
Zředěná séra (100x) se pipetují v množství 100 ml na jamku. Je třeba mít na destičce v duplikátech:
blank (blokovací roztok), pozitivní sérum a vyšetřované vzorky zvláš´t pro IgM a zvlášť pro IgG. To
vše je třeba předem rozvrhnut na papírový vzor destičky, .

2.       Destička s naředěnými séry a dobře těsnícím víčkem se nyní vloží do termostatu a inkubuje
se při 37 °C 1 hodinu.

3.       Po uplynutí stanovené doby se destička vyjme z termostatu, roztoky v jamkách se odsají a
jednotlivé jamky se promyjí nejméně 3x promývacím roztokem (200 ml na jamku). Mírným poklepem se
odstraní zbytky kapaliny z destičky do čistého filtračního papíru.

4.       Do všech jamek se nanese po 100 ml konjugátu připraveného zvlášť pro IgM, zvlášť pro IgG
naředěného blokovacím roztokem a celá destička se nechá inkubovat při 37 °C 1 hodinu.

5.       Po inkubaci v termostatu se obsahy jamek odsají, opět nejméně 3x promyjí promývacím
roztokem (200 ml na každou jamku) a celá destička se oklepe.

6.       Nyní je potřeba připravit si substrátový roztok s chromogenem a substrátem v množství 100
ml na každou jamku, a to tak, že smícháme 15 ml substrátového roztoku se 7,5 mg OPD a 7,5 ml
H[2]O[2].

7.       Destičku i s víčkem přemístíme do temna a necháme ve vodorovné pozici inkubovat při
laboratorní teplotě cca 20 min.. Během této doby se vyvíjí barva v jamkách a větší množství
především ultrafialového záření tuto barevnou reakci zintenzivňuje.

8.       Po uplynutí stanovené doby je reakce zastavena přidáním 1–2M H[2]SO[4] (50 ml na jamku).
Nejlépe ihned provádíme měření při 492 nm na ELISA-readeru.

 Výsledky ELISA – měření vzorků:

            Na každou měřenou destičku byly napipetovány v duplikátech: blank, negativní kontrola
(NK), pozitivní kontrola (PK) a konkrétní vzorky jednotlivých sér.  Pro účely grafického znázornění
výstupů z ELISA, byl od absolutní hodnoty změřené absorbance každého vzorku odečten blank (A-B).

Je třeba vytvořit tabulku výsledků a grafy:

Grafické znázornění přepočítaných hodnot absorbance pro IgM a IgG séra:



Závěr: Je třeba posoudit výsledky z hlediska pozitivity PK a dalších vzorků z destičky.