Koncepce předmětu spec. imunolog. metody Bi 9250C, zimní semestr 2021 Časový rozpis blokového cvičení z předmětu Speciální cvičení z imunologie 9 studentů, 2h/2kredity Pomůcky s sebou: přezůvky a plášť, protokoly, mobil na focení, flešku, svačinu V praktickém cvičení se budeme zabývat testy následujícími metodami aktivity IS a) bezobratlých b) obratlovců Použité metody: odběr a zpracování krve (krevní diferenciál), odběr hemolymfy; ELISA (imunoenzymová analýza)– 1. stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. (Borrelia afzelii, garinii, sensu stricto), 2. stanovení přítomnosti protilátek proti COVID-19; test aktivity a cytotoxicity lymfocytů; rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Ag nebo Ab; test stanovení aktivity jaterního enzymu ALT; pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu); test aktivity fagocytózy pomocí fagocytovaných částic u hemocytů hmyzu; příprava preparátu roztěrem střev klíštěte; průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka – nepřímá hemaglutinace (metoda HIT). Termín: út.-pá. 8. – 11.2. od 8.30hod do cca 15-16hod út 8:30 Instruktáž: ke cvičení toho dne 1. krevní roztěr, barvení a příprava séra 2. příprava destiček na ELISA, chystání antigenu na destičky 3. stanovení jaterního enzymu ALT 4. imunochromatografický test HIV, losování na další imunografické testy. Dětailně: postupný odběr krve z prstu, ELISA - Et OH, promývání destiček, zjišťování konc. antigen u, ředění Ag, kalibrační křivka a napipetování na destičku; v mezičase barvení roztěrů a krevní di ferenciál; stanovení ALT, losování na imunochromatický test, zpracování krve na sérum Pomůcky: ELISA: připravené A volné destičky, Ag už sonifikovaný, albumin, činidla na kalibraci, vazebný rozt ok, lednička, et-OH Předání pokynů a protokolů na imunochromatografický test- ruleta ALT: sérum, ELISA reader s filtrem 340 nm, epiny, destičku Odběr krve: rukavice, stojánek, skla na roztěr, desinfekce, jehly, souprava na barvení-Leukodif, pi pety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, papírky na losování st 8:30 Instruktáž: 1. imunochromatografické testy 2. test aktivity a cytotoxicity lymfocytů, ATP test 3. o dběr hemolymfy z larev zavíječe voskového Detailněji: 1. imunochromatografické testy 2. test aktivity a cytotoxicity lymfocytů, ATP test 3. o dběr hemolymfy z larev zavíječe voskového, kultivace se škrobovými částicemi a sledování fagocytárn ích schopností hemolymfy, barvení skel a prohlížení hemocytů pod mikrokopem, počítání FI a % F, kre vní diferenciál; 4. příprava preparátu ze střev klíštěte 5. úprava destiček na ELISA -pokračování: odstranění Ag a promytí, napipetování vazebného roztoku s kaseinem, inkubace s kaseinem, promytí de stiček; Pomůcky: Fagocytóza: Leukodif, roztok škrobových zrn, larvy, sklíčka na roztěry, termostat, malé epiny, pinzety, nůžky, stříkačky a jehly, pipety, špičky, odpadní nádoba, stojánky, ependorfky, teplotní lázeň, malý termostat. ELISA: blokovací-vazebný roztok s kaseinem, promývací roztok, koloidní stříbro 50 ppm, promývačka, kit na měření aktivity a cytotoxicity lymfocytů - ATP test Čt: 8.30 Instruktáž – metoda HIT Detailněji: metoda HIT - průkaz přítomnosti antigenů krevního systému AB0 ve slinách člověka Pomůcky: Komerční diagnostika (EXBIO Olomouc) anti-A (IgM) monoklonální, anti-B (IgM) monoklonální, anti-H monoklonální; náplav diagnostických erytrocytů A, B, 0; bromelin, pufrovaný fyziologický roztok 0,85% (0,15 mmol/l) NaCl, destičky na odečítání výsledků, vodní lázeň na 100 C°, centrifuga, zkumavky, stojánky na zkumavky, pipety, špičky, rukavice!, roztok ajatinu, nádobky na odpad, fixy. Pá 8:30 Instruktáž: 1. samotná ELISA ředění sér, rozložení vzorků na destičku, příprava zředěných sér: inkubace destičky se séry (naředit konjugát), promytí destičky, nanesení konjugátu, inkubace s konjugátem (nachystat substrátový roztok s OPD), promytí a nanesení substrátového roztoku, inkubace se substrátem, zastavení reakce pomocí H[2]SO4, měření na ELISA-readeru, v mezičase: krevní diferenciál, FI, % fagocytózy. Dokončování metod, kontrola výsledků Pomůcky: ELISA: blokovací roztok, promývací roztok, promývačka, konjugát, substrátový roztok, substrát, H[2]SO4, ELISA-reader na 492 nm Pipety, špičky, stojánky, ependorfky Přehled metodik - podrobně: Odběr a zpracování krve, příprava séra, stanovení krevního diferenciálu ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti B.b.s.l. ELISA - stanovení přítomnosti protilátek proti COVID-19 Tudbidimetrické stanovení přítomnosti enzymu ALT neboli test aktivity jaterních buněk, ALT test Test aktivity a cytotoxicity lymfocytů, ATP test Pozorování buněk hemolymfy (hemocyty hmyzu), barvení buněk Test aktivity fagocytózy pomocí škrobových zrn u fagocytů hmyzu, barvení buněk Příprava preparátu ze střev klíštěte Průkaz přítomnosti antigenů erytrocytů ve slinách člověka (HIT) Rychlý kvalitativní test pro stanovení přítomnosti HIV viru Dále výběr z dalších testů Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti hemoglobinu ve stolici - individuální stanovení Rychlá imunochromatografická metoda stanovení přítomnosti Helicobacter pylori ve stolici Rychlý test pro stanovení Streptococcus A (pyogenes) ve stěru hrdla Rychlý test pro stanovení Streptococcus pneumoniae v moči