CVIČENÍ Z ANALYTICKÉ CYTOMETRIE 2021/2022 17. – 20. 1. 2022, BFÚ Vyučující: Mgr. Barbora Kvokačková, Mgr. Markéta Pícková, Mgr. Ondřej Vacek, Ing. Michaela Chorvátová, Mgr. Radek Fedr, Mgr. Karel Souček PhD. Skupina A Briediková, Kristína, učo 445297 [FYZIO] Janská, Libuše, učo 528115 [IMUNO] Kopecký, Martin, učo 478193 [IMUNO] Krchová, Michaela, učo 423226 [FYZIO] Machů, Michaela, učo 484116 [IMUNO] Skupina B Maljarová, Eliška, učo 484310 [FYZIO] Mokráčková, Nina, učo 528111 [VYBIO] Nepovímová, Lucie, učo 528100 [IMUNO] Pospíchalová, Kateřina, učo 481519 [IMUNO] Raptová, Petra, učo 451811 [FIVBZ] Skupina C Seifertová, Petra, učo 486749 [VYBIO] Šošolíková, Tereza, učo 528103 [IMUNO] Tokár, Filip, učo 478457 [IMUNO] Tomášiková, Zuzana, učo 484175 [VYBIO] Voňková, Adéla, učo 484364 [VYBIO] Zelenák, Štefan, učo 410571 [FYZIO] Den 1 (17.1.) A) B) C) 9 - 12 hod § Úvod, Hela 8 Fucci - cytometer § MLN-4924 treatment 13- 16 hod § Úvod, Hela 8 Fucci - cytometer § MLN-4924 treatment Den 2 (18.1.) A) B) C) 9 – 12 hod § Proliferace a bun. cyklus § Úvod § Imunofenotypizace 12-15 hod § Hela 8 Fucci - mikroskop § Hela 8 Fucci - mikroskop 15-18 hod § Proliferace a bunkový cyklus Den 3 (19.1.) A) B) C) 9 – 13 hod § Imunofenotypizace § Hela 8 Fucci- cytometer § MLN-4924 treatment 13 – 17 hod § Imunofenotypizace Den 4 (20.1.) A) B) C) 9 – 15 hod § Hela 8 Fucci – mikroskop § Proliferace a bunkový cyklus Protokol 1 Fucci 8 buňky - sběr, měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů, analýza na konfokálnim mikroskopu Protokol 2 Detekce proliferace, buněčného cyklu a buněčné životnosti po ovlivnění buněk DU-145 inhibitorem neddylace Protokol 3 Imunofenotypizace lidské krve Protokol 1 Model HeLa 8 Fucci cells – měření a analýza buněčného cyklu pomocí fluorescenčních proteinů Cíl - cílem experimentu je seznámit se s modelovou buněčnou linií HeLa 8 Fucci, která umožňuje analýzu buněčného cyklu na živých buňkách bez potřeby fixace a značení - měření proběhne na přístroji BD FACS Verse - ukázka vyhodnocení dat bude provedena pomocí programu FlowJo - analýza buněk na konfokálním mikroskopu po ovlivnění různými látkami Teorie Buněčná linie HeLa 8 Fucci - buněčná linie HeLa – lidská permanentní buněčná linie odvozená z karcinomu děložního čípku - nejstarší a jedna z nejčastěji používaných lidských buněčných linií - Fucci próba (fluorescent ubiquitination-based cell cycle indicator) – umožňuje vizualizovat progresi buněčného cyklu u živých buněk - buňky s Fucci ve fázi G1 emitují červené světlo, ve fázi S/G2/M zelené světlo - více – viz pdf. souboru uložené ve studijních materiálech (Sakaue-Sawano et al., 2008; viz studijní materiály) 1) ANALÝZA NA PRŮTOKOVÉM CYTOMETRU Materiál - připravená buněčná line HeLa 8 Fucci - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová). EDTA je chelatační činidlo, které mimo jiné vychytává Ca^2+ ionty, čímž rozrušuje mezibuněčné spoje - trypsin - pankreatický enzym (serinová proteáza), štěpí amidové a esterové vazby argininu a lysinu. Působení trypsinu uvolňuje adherentní buňky od kultivačního povrchu - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - PBS – oplach buněčné suspenze Postup: Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 2 ml PBS+EDTA – 1-2 minuty nechat působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 1-2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - misku opláchnout 1 ml PBS, přenést do zkumavky k buněčné suspenzi - stočit 200g 5 minut - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 1 ml PBS - stočit 200g 5 min - odsát supernatant - pelet rozsuspendovat v 300 ml PBS a měřit Výsledky Popište postup měření buněčného cyklu u této linie + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo 2) ANALÝZA NA KONFOKÁLNÍM MIKROSKOPU Postup: den 1: Výsev buněk HeLa 8 Fucci na mikroskopickou analýzu den 2: Ovlivnění látkami MLN-4924 (zásobní koncentrace 10 mM, výsledná koncentrace 1 µM) TRAIL (100 ug/ml zásobní koncentrace, 50 ng/ml výsledná koncentrace) Mitomycin (zásobní koncentrace 1 mg/ml, výsledná koncentrace 1 µg/ml) Doplňte poznámky k látkám TRAIL a Mitomycin (co to je za látky, co způsobují a k čemu se používají), viz poznámky u MLN-4924 v protokolu č. 2) Dopočtěte množství látek, které se bude k buňkám přidávat (V celk.= 300uL) den 3: Analýza buněk na mikroskopu Popište postup analýzy na mikroskopu a změny, které jste pozorovali u buněk ovlivněných látkami Protokol 2 Detekce proliferace, buněčného cyklu a buněčné životnosti po ovlivnění buněk DU-145 inhibitorem neddylace Cíle - cílem experimentu je ovlivnit buněčnou linii DU-145 inhibitorem neddylace (MLN-4924 – 0,11uM) a vyšetřit účinky jeho působení - působení MLN-4924 po dobu 24 hodin vede k deregulaci buněčného cyklu - měření proběhne na přístroji Attune Flow Cytometer Teorie MLN-4924 * ATP kompetitivní inhibitor * I. fáze klinického testování pro lymfom, mnohočetný myelom, AML, ALL, melanom a další nehematologické nádory * Tvoří velmi stabilní adukt mezi NEDD8 a MLN-4924 vede k zastavení dráhy neddylace (viz obrázek). Dráha nedylace je nezbytná pro aktivitu ubikvitin ligázy Skp2^SCF, která se účastní regulace různých buněčných pochodů. Mezi její významné substráty patří proteiny řídící procesy, jako jsou buněčný cyklus (p27^Kip1, p21^cip1), buněčné replikace (Cdt1) a další. Struktura inhibitoru MLN-4924 (Soucy et al., 2009): Působení inhibitoru MLN-4924 na zastavení dráhy neddylace (Soucy et al., 2010): MĚŘENÍ PROLIFERACE A BUNĚČNÉHO CYKLU Materiál - buněčná linie DU-145 (kontrola a ovlivněné buňky) - roztok PBS+EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová) - trypsin - nesterilní médium se sérem – inaktivace trypsinu - nesterilní FACS zkumavky, špičky, pipety - PBS + 1% BSA - Live Dead Fixable stain kit Red - Edu click-iT AF488 kit - PO-PRO-1 Postup 1. Sběr a příprava vzorků - odsát médium z buněk - přidat 3 ml PBS+EDTA – nechat 2 minuty působit - odsát PBS+EDTA - přidat 0,5 ml trypsinu – nechat inkubovat v termostatu (37^oC) dokud se buňky neuvolní (cca 2 minuty) - přidat 2,5 ml média se sérem (inaktivace trypsinu) - stočit 200g 5 minut, odsát supernatant 2. Značení viability – LD Green/LD Yellow - naředit značku pro viabilitu v PBS (1:1000) - přidat 100 µl/vzorek, inkubovat 15 min, 4°C - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 3. Fixace - rozsuspendovat buňky ve 100 µl 4% PFA - inkubovat 15 min, RT - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 4. Permeabilizace - rozsuspendovat buňky ve 100 µl 0,15% Tritonu X-100 - inkubovat 15 min, RT - přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 5. Click-iT reakce - rozdělit vzorky do dvou zkumavek, do jedné přidat pouze PBS + 1% BSA, do druhé připravenou click-iT reakční směs - připravit click-iT reakční směs dle rozpisu - přidat 125 µl směsi/vzorek - inkubovat 30 min, RT ve tmě - do obou zkumavek přidat 1 ml PBS + 1% BSA, stočit (200g, 5 min), odsát supernatant 1 reakce PBS 109,5 μl CuSO4 2,5 μl Fluorescent dye azide 0,625 μl Reaction buffer additive (diluted 10x) 12,5 μl Total reaction volume 125 μl 6. Značení buněčného cyklu - naředit značku PO-PRO-1 (s.s. 1mM) v PBS (1:10 000) - přidat 500 µl/vzorek - inkubovat 30 min, RT ve tmě Výsledky Popište postup měření a vyhodnocování buněk na průtokovém cytometru + přiložte výsledky měření získané vyhodnocením v programu FlowJo Protokol 3 Imunofenotypizace lidské krve Cíl - Cílem experimentu je stanovit zastoupení jednotlivých populací buněk v krvi na základě exprese, pro tyto buňky typických, povrchových markerů. - Dále u neutrofilních granulocytů bude stanovena míra aktivace po stimulaci s G-CSF (granulocyte colony stimulating factor), prozánětlivých cytokinem, který aktivuje buňky myeloidní řady. - Měření proběhne na průtokovém cytometru SONY SP6800 s následným vyhodnocení ve FlowJo. Teorie - Pojem imunofenotypizace představuje stanovení jednotlivých subpopulací buněk (primárně leukocytů) na základě exprese vybraných povrchových CD antigenů (markerů), a to s použitím fluorescenčně značených monoklonálních protilátek proti daným antigenům. - Na základě rozptylu světla jsou populace rozděleny dle velikosti a granularity (Obr. 1). - CD antigeny jsou povrchové molekuly buněk, které mají stejný epitop, identifikovatelný stejnou protilátkou umožňující rozpoznávání buněčných populací při imunofenotypizaci. Většinou jsou to receptory nezbytné pro funkci dané buňky. Obr. 1: FS a SS leukocytů získaných z plné krve po lyzaci erytrocytů Postup - krev zdravého dobrovolníka bude odebrána zdravotní sestrou do antikoagulačního činidla (40 μl heparinu/1 ml krve) - krev rozdělit na dva vzorky, přičemž jeden vzorek otreatovat s G-CSF na 120 min - připravit si mix protilátek – viz Tab. 1 - po uplynulé době ze suspenze přidat do každé flow zkumavky po 100 μl (1. zkumavka nebarvená + 2. izotyp + 3. barvená) - buňky ve zkumavce zafixovat 3,2% formaldehydem 1:1 na 15 min, RT - následně zlyzovat erytrocyty s [d]H[2]0 5 min, RT - takto připravené suspenze stočit (400g, RT, 7 min) a resuspendovat ve 120 μl PBS s 0,1 % BSA - přidat mix protilátek do zkumavek 2 a 3 a inkubovat 15-20 min, led - přidat 4 ml PBS na přemytí - stočit (400g, RT, 7 min) a resuspendovat ve 120 PBS μl, led - analýza na FC Tab. 1: Použité protilátky pro FC zkumavka č. CD marker fluorochrom populace buňek řědění excitace/emise (nm) 1 nebarvená ctrl --- --- --- --- 2 Izotyp PerCP --- 1:40 482/675 Izotyp PE --- 1:40 496/578 Izotyp PE/Cy7 --- 1:40 496/785 Izotyp APC/Cy7 --- 1:40 650/785 Izotyp APC --- 1:40 650/660 3 CD11b PerCP Neutrofil - aktivace 1:40 482/675 CD3 PE T-lymfocyt 1:40 496/578 CD4 PE/Cy7 Pomocný T lymfocyt 1:40 496/785 CD8 APC/Cy7 Cytotoxický T lymfocyt 1:40 650/785 CD19 APC B-lymfocyt 1:40 650/660 Výsledky Popište postup měření a „gatování“ jednotlivých populací + přiložte výsledky měření vyhodnoceny pomocí programu FlowJo.