1 Luminiscence a její praktické využití 1 2 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lNa principu luminofory zesíleného chemiluminiscenčního stanovení reaktivních kyslíkových metabolitů (RKM) je založeno měření oxidativního vzplanutí fagocytů a antioxidační kapacity biologických tekutin. l lDalší skupinu tvoří metody založené na reakci ATP s luciferinem katalyzované luciferázou. l lMikroorganismy produkující světlo jako součást svého základního metabolismu jsou využívány v toxikologii. 3 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lAplikace CL metod l lHematologická a imunologická vyšetření –Fagocytóza (oxidativní vzplanutí, chemotaxe, exprese povrchových receptorů, opsonizace) –Antioxidační aktivita tělních tekutin –Blastická transformace lymfocytù –Imunodiagnostika - použití luminiscenčně značených protilátek lHygienický monitoring (mikrobiologická kontaminace) lToxikologické testy lMolekulární biologie (reporterové geny) 4 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lLuminometrické metody založené na stanovení RKM l lPrincip metody lluminol + oxidant ¾® a - aminoftalát + N2 + světlo (425 nm) l lVyužití metody lstudium fagocytózy lměření antioxidačních vlastností (tělních) tekutin 5 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně NADPH oxidáza NADP+ (O2-·, H2O2, OH·) O2- · O2 NADPH + H+ luminol + oxidant a-aminoftalát + N2 + světlo (425 nm) 6 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lStudium fagocytózy pomocí chemiluminiscence l lChemiluminiscenční analýza je senzitivní technika, která měří produkci volných kyslíkových radikálů v malých objemech krve (mikrolitry). Použití různých luminoforů umožňuje odlišit jednotlivé radikály, jejich intracelulární a extracelulární tvorbu. Použitím různých aktivátorů a inhibitorů lze sledovat defekty procesu opsonizace a chemotaxe, funkčnost NADPH oxidázy a ostatních enzymů spojených s oxidativním vzplanutím, expresi a funkčnost různých buněčných receptorů. 7 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 8 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně SOD/CAT 9 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 10 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lStudium fagocytózy pomocí chemiluminiscence l lMateriál lplná krev lplasma obohacená o leukocyty (tzv. buffy coat) lizolované PMNL l lIndikace limunologie (chronická granulomatóza, nedostatečnost komplementu, defekty chemotaxe) lhematologie a biochemie (neutropenie, aktivita myeloperoxidázy) lfyziologie (poruchy opsonizace) lmikrobiologie (vliv bakteriálních peptidů, buněčných stěn, endotoxinu) lfarmakologie a toxikologie (účinek léčiv a toxickýxh látek) 11 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lMěření antioxidační kapacity biologických tekutin l lReaktivní kyslíkové metabolity jsou tvořeny při tepelném rozkladu vybraných sloučenin. Po přidání vzorku obsahujícího antioxidanty CL signál vymizí, přičemž doba vymizení CL signálu je přímo úměrná antioxidační aktivitě vzorku. 12 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně 50% peak CL Čas Přidání vzorku 13 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lMěření antioxidační kapacity biologických tekutin l lMateriál lplasma lsérum lsliny lsemenná tekutina l lIndikace lriziko oxidativního poškození tkání lriziko odvržení štěpu po transplantaci 14 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lLuminometrické metody založené na měření ATP l lPrincip metody: l luciferasa lATP + luciferin + O2 ¾® oxyluciferin + AMP + PPi + CO2 + světlo (562 nm) l lTouto metodou se stanovuje buď přímo množství ATP ve zkoumaném vzorku nebo aktivita enzymů nebo substrátů, které jsou spřaženy s tvorbou nebo spotřebou ATP (např. stanovení β-podjednotky kreatin kinázy používané v diagnostice akutního infarktu myokardu) 15 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lLuminometrické metody založené na měření ATP l lVyužití metody: lstanovení buněčné proliferace a cytotoxicity (např. sledování sensitivity bakterií k antibiotikům, sledování cytotoxicity protinádorových léčiv apod.) lmonitorování hygieny pracovního prostředí (např. potravinářství) lměření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích a fermentorech lměření ATP v bakteriálních, rostlinných a živočišných buňkách lreporter gene assay (např. luciferáza) 16 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lMonitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů pomocí bioluminiscence ATP l lVýhody oproti konvenčním mikrobiologickým postupům: rychlost a jednoduchost, vysoká sensitivita a přesnost, stanovení celkové biologické kontaminace (ta může pocházet z reziduí výrobků, z kontaktu s lidskou pokožkou nebo z mikroorganismů). 17 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lMonitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů pomocí bioluminiscence ATP l lMateriál lstěr ze zkoumané plochy l lIndikace lmikrobiální znečištění pracovního prostředí 18 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lMonitorování hygieny pracovního prostředí a účinnosti čistících postupů pomocí bioluminiscence ATP l l 19 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lMěření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích lPomocí CL metody za využití luciferázy se stanovuje ATP, které je obsažené ve všech živých buňkách. l lMateriál lvodné roztoky l lIndikace lmikrobiální znečištění pitných a užitkových vod lmikrobiální znečištění potravinářských výrobků 20 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lMěření biomasy mikroorganismů ve vodných roztocích l 21 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lStanovení blastické transformace lymfocytů a buněčné proliferace l lStanovení na základě měření obsahu ATP ve vzorku. Rychlá a sensitivní alternativa k metodám využívajícím radioktivně značené prekursory tvorby DNA (např. 3H-tymidin). l lMateriál lextrakty lymfocytárních kultur l lIndikace lporuchy specifické buněčné imunity 22 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lReporter gene assay l lTato metoda představuje vysoce účinný nástroj v molekulární biologii. Její princip spočívá ve využití kódující sekvence luciferázy jako reporterového genu pro monitorování aktivity promotorů v kontrole genové exprese. Konstrukt DNA obsahující kódovací oblast pro luciferázu kombinovanou se sekvencí s testovanou schopností genové regulace se vnese do studovaných buněk. Po inkubaci se měří výsledek exprese daného reporterového genu jako ukazatel účinnosti testovaného promotoru. 23 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lReporter gene assay l Promotor Reportérový gen mRNA reportérového genu Reportérový protein Substrát Signál Transkripční faktory Signální dráhy Receptor Zkoumaná látka 24 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lReporter gene assay l Transkripční regulace např. měření aktivity promotoru Post-transkripční regulace např. sestřih Post-transkripční/translační regulace např. měření RNA interference Post-translační regulace např. měření proteinové stability cílová sekvence zájmový protein intron luciferáza testovana sekvence promotor promotor promotor promotor luciferáza luciferáza luciferáza luciferáza 25 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lReporter gene assay l 550–570 nm 480 nm luciferáza (Photinus pyralis) luciferáza (Renilla reniformis) 26 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lReporter gene assay l lMateriál lbuněčné extrakty l lIndikace lúčinnost promotorů v genové regulaci 27 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lLuminiscenční metody založené na přirozené bioluminiscenci organismů l lStanovení toxicity lMateriál lsladké vody (povrchové i podzemní) lslané a brakické vody lvodovodní vody lodpadní vody lvodné roztoky a výluhy lIndikace lmonitorování environmentálních toxinů 28 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lImunodiagnostika l lVyužití chemiluminiscenčních značek (např. acridinium ester), schopných spontánně se vázat na bílkoviny, k přípravě CL značených protilátek.