1 Luminiscence a její praktické využití 2 2 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie BRET l lBioluminescence Resonance Energy Transfer l •energie je přenášena z luciferázy (donor) na fluorofor (akceptor), pokud se nachází v dostatečné blízkosti (< 10 nm) •excitace fluoroforu > emise (a detekce) světla 3 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně světlo světlo YFP YFP luc luc lTechnologie BRET l lnapř.: •žlutý fluorescenční protein •luciferáza Renilla reniformis 4 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie BRET l lBRET index = emiseAKCEPTOR / emiseDONOR protein A protein B tag protein luciferáza + substrát fluorofor signál vlnová délka (nm) donor akceptor 5 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie BRET l •měření proteinových interakcí za fyziologických podmínek (v živých buňkách) •robustnost (nízká variabilita a vysoká reprodukovatelnost) •vysoká senzitivita •nevyžaduje žádnou další normalizaci (počet buněk, koncentrace proteinů) 6 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie BRET l lVyužití: •epigenetické proteinové interakce •interakce signálních proteinů •interakce kináz •interakce transkripčních faktorů •interakce membránových proteinů •interakce proteinů s RNA 7 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie BRET l lPříklad: interakce b-arestinu s receptorem pro vazopresin vazopresin čas (sec) vazopresin (nM) 8 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie BRET l lPracovní postup Transfekce konjugovaných konstruktů do živých buněk Přidání substrátu, měření emise donoru a akceptoru, výpočet BRET indexu Přidání ligandu 9 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie NanoBiT (Binary Technology) l •podjednotky luciferázy jsou konjugovány se zájmovými proteiny •interakce proteinů vede k sestavení funkční luciferázy protein A protein B LgBiT SmBiT funkční luciferáza 10 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie NanoBiT l lVyužití virové infekce degradace a stabilizace proteinů exprese proteinů sekrece proteinů recyklace internalizace biologie receptorů 11 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie NanoBiT l lPříklad využití: vazba b-arestinu na GPCR agonista internalizace 12 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně lTechnologie NanoBiT l lPříklad využití: inhibice interakce p53/MDM2 inhibitor Koncentrace inhibitoru (mM) 13 Luminometrické aplikace v biologii a medicíně forskolin propranolol isoproterenol GPCR GPCR cAMP Inaktivní PKA regulační podjednotka PKA aktivní katalytická podjednotka PKA lTechnologie NanoBiT l lPříklad využití: lasociace a disociace PKA