Fotodermatologie Kůže, interakce světla s kůží, molekulární mechanismy efektu záření na buňky Lukáš Kubala i Kůže • Největší orgán lidského těla • Vrstvy kůže - Pokožka (epidermis) - Škára (dermis) - Podkožní vazivo Funkce kůže • Ochrana organismu před poškozením - Mechanickým - Chemickým • Příjem informací z vnějšího prostředí - Receptory pro vnímání Resorpce látek Vylučování odpadních látek Udržení tělesné teploty Skladování tuků a vody Syntéza vitaminu D The Skin Capillaries Sweat Gland Sebaceous Gland /Sensory Nerve Ending s Nerve Dermis - Subcutaneous Tissue Arteriole Fat, Collagen, Fibroblasts Epich Typy buněk - Keratinocyty, melanocyty, Langerhansovy buňky, Merkelovy buňky, Epidermis je neustále se obnovující vícevrstevný orgán, jehož buňky jsou v konstantní diferenciaci Proces rohovatění, odumírání a odlupovaní buněk - kornifikace Vrstvy keratinocytů - vrstva bazálni (keratin 5,14) - Vrstva spinózní (keratin 1,10, involucrin) - Vrstva granulami (filagrin, loricrin) - Stratům corneum (zrohovatělé mrtvé buňky - korneocyty na povrchu ceramidy) rmis Barevný vzhled kůže - Pigmentace • geneticky (geneticky určená konštituční melaninová pigmentace) a vnějším prostředím (intenzitou a četností expozice k sluneční záření). • Důležitá je aktivita melanocytů (syntéza a distribuce melaninu). • Další faktory ovlivňující barvu kůže — Tok krve blízko povrchu kůže závislá např. na okolních podmínkách Melanocyty Ve spodních vrstvách melanocyty produkují pigment melanin, který udává barvu kůže Funkce melaninu - Ochrana před poškozením UV Syntéza melaninu - Hydroxylace tyrosinu tyrosinásou na 3,4-dihydroxyphenylalanine (L-DOPA) probíhající v specializovaných organelách melanosomech - přenos melanosomů z melanocytů do bazálních keratinocytů Stimulace tvorby melaninu - UV záření Následek zhnědnutí kůže Tyrosine sinasc r Tyrosinase 5,6-Dihydro^y indole DOPAquirane I Cy Steiny I0OPA Clulalh ion* I / cysteine UOPA::ln wilt:- DCT lndole-5,6 quinone 5.6-Oihy d roxyindole-2-carboKylic acid TVFP1 lndote-5.6'quinone Cärboxy ľ ac ú UV záření neionizující záření typy: UV A (A. = 315 - 400 nm) UVB(A = 280-315 nm) UVC(A = 100-280 nm) ve slunečním světle: UV A - až 5,1 %, UV B - až 0,5 % UV C zcela pohlceno ve stratosféře UVC se ale používá při velké části in vitro pokusů (i nízké dávky působí mutagenně) Zdroje U V • Sluneční záření Umělé zdroje-Lampy • Fluorescenční • Germicidní • Rtuťové (xenónové) arc • Laserové Příklad vlnové charakteristiky Arc rtuťové lampy 10D0 1100. Wavelength (nm) Iradiace - intensita radiace mW/cm2 Dávka - integrál iradiace za čas J/cm2. Spektrum a intenzita UV v přírodě • Spektrum a intenzita závisí na — Čase během dne — Dnu v roce — Geografické umístění • Zvýšená intenzita UV — V poledne — V astronomickém létě (více v květnu než srpnu!) — Blízko rovníku — Ve vyšších nadmořských výškách — Odrazem ze země, písku, sněhu, vody Interakce záření a kůže Při hodnocení interakce záření a kůže je nutno zvažovat jednak parametry záření (spektrum záření, výkon zdroje - intenzitu záření, dávku záření), dále velikost ozářené plochy, dobu expozice a optické vlastnosti ozařované tkáně. Optická fáze Rozptyl • Rozptyl světla v kůži a jeho zpětný odraz k povrchu Absopce • Chromofory - konjugované systémy (mimo melanin také nukleové kyseliny, aromatické aminokyseliny, kyselina urokánová, hemoglobin, beta karoten, bilirubin) Fotochemické a fototermické reakce Absorbované fotony dodávají aktivační energii pro reakce • Fotochemické (fotoionizace, fotoexcitace) • Fototermické (vznik tepla) 9 Hlavní buněčné chromofory • chromofory = látky nebo části molekul schopné absorbovat energii z fotonů a přeměnit ji na biochemický signál • buněčné chromofory: - otevřené a uzavřené pyroly: porfyrin (hem), bilirubin - molekuly s n orbitaly (aromatické látky či látky se systémem nenasycených vazeb): DNA, aromatické aminokyseliny, kyselina uronová Epidermis: Melanin, nukleové kyseliny, aromatické aminokyseliny Dermis: hemoglobin, ß-karoten, bilirubin Efekty UV záření na buňky • Tvorba reaktivních metabolitů kyslíku • Poškození DNA a dalších biomolekul spojených s indukcí mutací a případnou změnou fenotypu • Poškození struktury proteinů a lipidů spojených s narušením funkce mitochondrií, aktivaci signálních drah • Indukce apoptózy Poškození DNA UV zářením • Dochází ke vzniku tzv. fotoléze • Hlavní mechanismy poškození DNA UV zářením: 1. Absorpce UV záření přímo nukleotidy 2. Poškození zprostředkované fotosenzitizátory 3. Působení reaktivních kyslíkových radikálů Typy fotolézí Dimerizace mezi sousedními pyrimidiny v důsledku absorpce UV záření Vznik vozeb mezi 5' - 6' uhlíky Vznik cyklobutanových pyrimidinových dimerů (CPD) nejčastěji typu TT (méně TC a CC) o o hn 3 5 2 . 6 cr n 5 5 6' _ 2 n h hv hn R R1 o 3 5 ct n R 5, 4' 3>nh 6' 2' n o R1 Další nečastější jsou 6' - 4' foto produkty nejčastěji mezi TC (méně CC a TT) 6-4 photoproduct Typy fotolézí • monomerní poškození pyrimidinových bazí — vznik cytosin hydrátu, 8-hydroxydeoxyguanidinu či thyminového glykolu — indukují zlomy v DNA, křížové vazby 8-oxo-guanine Typy fotolézí Na relativní podíl vzniku různých typů DNA fotoproduktů se podílí - UV spektru, sekvenci bází, sekundární struktury DNA a interakce DNA s proteiny Např. cytosin absorbuje delší vlnové délky UV záření efektivněji než thymin, a proto CPDs obsahující cytosin jsou po UVB ozáření tvořeny častěji. Fotoléze indukované fotosenzitizací • fotosenzitizátor - látka (chromofor), která je schopná absorbovat foton UV záření a stává se reaktivní • DNA je poškozená tzv. fotocykloadicí • např. furokumaríny - vytváří mono- či bi-adukty s DNA (poruchy replikace) Mutagenní účinky UV záření • UV indukované mutace vznikají při nesprávné reparaci fotolézí • nejčastěji skryté mutace • ale i s rizikem patologického projevu na úrovni buňky či celého organismu Mutagenní účinky UV záření Normal c— c— Normál c— c— U V light DNA replication ■A c—- DNA replicatjon CC to TT mutation 1 Vznik mutace při replikaci DNAsCPD: - při replikaci může dojít kvůli CPD ke změně páru GC na AC - při další replikaci pak vznikne jedno dceřinné vlákno nesoucí pár AT - ve výsledku: mutace GC -> AT Reparace fotolézí Fotoreaktivace u nižších živočichů, hub a bakterií enzym fotoIváza s vysokou afinitou kCPD po absorpci fotonu z viditelné části spektra dochází k rozrušení kovalentních vazeb mezi CPD a reparaci fotoléze T T « f. I r UVBght I I I T*' I I A A 1 Visible ligM T T A ft I I Reparace fotolézí U vyšších živočichů: EXCIZNÍ REPARACE 1- je rozpoznáno poškozené místo 2- chybná báze (bázová excizní reparace) nebo poškozená část řetězce DNA (nukleotidová excizní reparace -NER) se odstraní 3- opravené místo se do syntetizuje polymerázou 4- opravené místo je spojeno ligázou Damaged base i I I j_i_L J Glycosyla AP site J_I_L J AP endoiuidease 5' dRP 3' OH Long Patch Polymerase / i i i i i i i ľ i I I I I i I I i I Flap endonudeas-ij i I I ľ I i I I t .......' ■ -l Short Patch ^5' dRP lyase OH P helix distorting lesion rli^tortion recognition DNA bending Damage Detection t)XFC-HR23B XPC helix unwinding damage verification Damage Verification complex assembly ■_. 3)xpg damage verification M- RPA XPA J_l Polymerase I (nondisplacing syntli * Ligase t---r j_L Ligase ^ I 1 I I I I i 1 I IjIIIIIII Damage Removal dna repair Synthesis 5i RFC PCNA Pol a 7TT,m=r. 1 i_l.t H!Uiiiti>-' Replacement Reparace fotolézí x a DoiibLe-stca nH break Homologní rekombinace oprava dvoj řetězcových zlomů, ■ ■* ' ' End reseí lion které nevznikají přímo následkem =— UV záření, ale po NER ~~ fotoproduktu na obou řetězcích sdílí většinu enzymatického aparátu s meiotickým crossing- b overem dna^mi,™ LlQullOľl homologní rekombinace využívá ==jj^"~ ^ k obnově genetické informace : ztracené v místě zlomu jako _ 1HJ~ homologní templát sesterskou "1I„ttz chromatidu NůncrůiMV*r Oř probíhá v S-fázi, kdy se DNA --- replikuje 1 l Strand displacement Anntaling DNA synthesis qation Non-crossover Copyright © 2C-0G Nature Publishing Group Nature Review i | Molecular Cel! Bio-logy Poruchy reparace fotolézí Celá řada závažných onemocnění Xeroderma pigmentosum Autosomálně recesivní onemocnění Mutace genů podílejících se na NER Velká citlivost na poškození DNA UV zářením - vysoká incidence rakoviny kůže (melanomu i bazocelulárního karcinomu) Reparace fotolézí U pacientů s XP byly identifikovány mutace v 8 genech 7 je zapojeno do excizní opravě nukleotidů (XPA - XPG) 1 (varianta XP) se podílí na replikaci poškozené DNA Mutace v některém z genů XPA až XPG snižují schopnosti buněk opravit CPD, [6-4] fotoproduktů a jiných objemných aduktů. Table 2. DNA repair genes associated with XP, CS and TTD Gene Disease Chromosome site Protein (ea) Function XPA XP 9q34 273 Photoproduct binding XPB XP, CS 2q21 782 3'-5' helicase, TFIIH member XPC XP 3p25 940 Photoproduct binding XPD XP, CS. TTD 19q13 760 5"-33 helicase, TFIIH member XPE XP 11pl2-p11 1140 Photoproduct binding XPF XP 16p13 905 5s incision XPG XP, CS 13q32 1186 3' incision ERCC1 COFS 19q13.2-q13.3 297 5' incision XPV XP 6p21 713 Bypass polymerase (Pol tj) CSA CS, UV3 5q21 396 RNA Pol II cofactor CSB CS, COFS, UV5 10q11 1493 RNA Pol 11 cofactor UVSSA UV3 4p16.3 709 RNA Pol II cofactor GTF2H5 TTD Bq25.3 71 TFIIH member TTDN1 TTD 7p14.1 179 TTD but not UVB sensitive Vliv UV na další biomolekuly • proteiny - absorpce UV aromatickými aminokyselinami, narušení sulfidických můstků (narušení terciární struktury proteinů) • lipidy - UV poškozuje dvojné vazby v lipidech -narušení biologických membrán Mitochondrie a UV •mitochondrie jsou hlavními producenty energie v eukaryotické buňce, které mají vysoké nároky na spotřebu kyslíku - vznik velkého množství ROS •UV záření generuje další ROS a následné poškození mtDNA, vznik mutací, peroxidaci membránových lipidů a oxidaci proteinů •nejčastější fotolézí v mtDNA je 8-oxo-7,8-dihydro-20-deoxyguanosine (8-oxodGuo), který je vysoce mutagenní, protože dochází k transverzi GC^AT •velmi časté jsou v mitochondriích vystavených UV záření i delece •poškození mitochondrií spouští produkci ROS a mitochondriálního NO •velké poškození spouští apoptotickou kaskádu vylitím cytochromu c • Další účinky UV na buňky kůže — UV vyvolává klastrování a internalizaci řady receptoru, např. EGFR, receptoru pro TNF-a a IL-1 — UV spouští apoptózu klastrováním a následnou aktivací CD95 — spouští produkci IL-6 aktivací receptoru pro TNF-a — UVC přímo aktivuje cytoplazmatické transkripční faktory NFkB a AP-1 (nezávislé na poškození DNA) — UVC snižuje defosforylaci EGF receptoru, tím dochází k jeho aktivaci a spuštění signální kaskády zahrnující c-fos, c-jun a Ras, Raf a MAP kinázy (ve výsledku vliv na produkci prostaglandinů) Apoptóza indukovaná UV Apoptóza vyvolaná poškozením DNA: - hlavní úlohu hraje tumor supresor p53 Buňky s fotolézí zůstávají v Gl fázi buněčného cyklu a p53 spouští reparaci DNA před vstupem do S fáze, je-li poškození DNA příliš rozsáhlé je spuštěn proces apoptózy UV-induced DNA damage j p53t g MdmZt ,1 b i 1 Cell-cycle arrest _l_ f + ßax T Fas/FasL T DNA repair dl Severe DNA damage I Apoptosia 71 Errors in DNA repair {p53 mutation etc.) \ Abnormal cell proliferation The central role of p53 in cell-cycle arrest DNA repair and apoptosis following UV irradiation Expert Reviews in Molecular Mediane®2002 Cambridge University Pfe&s Apoptóza vyvolaná poškozením - hlavní úlohu hrají tzv death receptory z rodiny receptoru pro TN F (TNF-receptor-1, TRAIL-receptor-1, TRAIL-receptor-2 and deathreceptor-3 (DR-3) a CD95 (Fas or Apo-1)) - UV C i UV B upreguluje expresi CD95 i jeho ligandu u keratinocytů - UV A upreguluje CD95L i u pomocných T buněk - tato upregulace není pravdepodobne přímá, ale skrze singletový kyslík generovaný UV zářením - vazba ligandu na CD95 způsobuje trimerizaci receptoru a spuštění apoptotické dráhy Účinek UV záření na intracelulární procesy shrnutí Signalizace a regulace genů • Aktivace receptoru pro epidermální růstový faktor, IL-1 a TNF na povrchu keratinocytů • Aktivace transkripčního faktoru AP-1 • Aktivace genů pro matrixové metaloproteázy, inhibice genu pro prokolagen • Rozklad kolagenu a dalších proteinů Reakce buněk • Zastavení růstu • Reparace poškození DNA, mutací • Nedokonalá reparace • Apoptosa buněk (sunburn cel Dsrnul Matríx Breakdown I Imperfect Repair —^ Photoaging G. J. Fisher, S. Kanjj. J. Varani, Z. Bata-Csorgo, Y. Wan, S. Dana, J. J. Voorhees: Mechanisms o f photoa