Vítězslav Bryja Buněčná migrace a buněčná polarita v embryonálním vývoji Osnova * Asymetrická segregace determinant ve vajíčku/zygotě * Planární buněčná polarita * Buněčné procesy a principy při kolektivní migraci * „Migrace“ částí buněk * Společný sub-buněčný základ určení polarity a migrace Segregace cytoplazmatických determinant ve vajíčku * Gene_Expression Vznik asymetrie – C. elegans Notch celegans Asymmetric divisions segregating P granules into the founder cell of the C. elegans germ line. The micrographs in the upper row show the pattern of cell divisions, with cell nuclei stained blue with a DNA-specific fluorescent dye; below are the same cells stained with an antibody against P granules. These small granules (0.5–1 μm in diameter) are distributed randomly throughout the cytoplasm in the unfertilized egg (not shown). After fertilization, at each cell division up to the 16-cell stage, both they and the intracellular machinery that localizes them asymmetrically are segregated into a single daughter cell. (Courtesy of Susan Strome.) Model: První buněčná dělení na modelu háďátka (Caenorhabditis elegans) Segregace P granul a vznik asymetrie Princip fázové separace Notch ce schema notchsigfig1 Notch ce schema I symetrické dělení vede ke vzniku asymetrických dceřiných buněk (role Notch) Notch a vznik asymetrie •legenda k obrázku: Asymmetric localization of polarity mediators and cell fate determinants in the early embryo. P granules: black discs; cytoplasmic POS-1, MEX-1, and cytoplasmic and nuclear PIE-1: blue; nuclear PAL-1: hatched; MEX-5 and MEX-3: peach; plasma membrane localized GLP-1: black; membrane localized APX-1: green; membrane localized MES-1: red. Although shown discreetly localized for simplicity, the cytoplasmic proteins are present at low levels in the opposite domain before division, and in the sister cell after division. In addition, MEX-5, MEX-3, MEX-1, POS-1 and PIE-1 are also present on P granules. (A) MEX-5, MEX -3, MEX-1, PIE-1, POS-1 and P granules are uniformly present in the cytoplasm just after fertilization, but become asymmetrically localized during the one-cell stage. (B) The anterior and posterior determinants are differentially segregated to AB and P1 as a result of the first asymmetric division. GLP-1 protein first appears in AB at the two-cell stage, and PIE-1 protein enters the nucleus in addition to being cytoplasmic. As the cell cycle proceeds (not shown), posterior determinants become restricted to the posterior half of P1, while MEX-5 appears in the anterior half of P1. (C) In the four-cell embryo, GLP-1 is expressed on membranes of both AB cells, but only ABp is in contact with the P2 cell expressing APX-1. MES-1 is enriched at the cell contact between P2 and EMS; MES-1/SRC-1 signaling in conjunction with Wnt signaling polarizes the EMS cell, such that it will divide asymmetrically. As the cell cycle proceeds, posterior determinants within P2 become asymmetrically localized as in previous P cells. MEX-5 disappears from the AB cells, but is still present in the anterior daughters of each P division. Embryonální vývoj Drosophila melanogaster * vaječná buňka * syncytiální blastoderm * buněčný blastoderm * gastrulace a segmentace • • •Zúčastněné geny •g. maternálního účinku •g. řídící článkování těla •g. zodpovědné za identitu článků – homeotické geny •g. řídící tvorbu kompletních orgánů > Maternální geny * Transkripce ve vaječníku, translace až po fertilizaci * a)Určujíci anterior-posterior polaritu: např. nanos, bicoid, oskar, gurken b) b)Určující dorso-ventrální polaritu: dorsal, toll * Maternální geny bicoid wt vajíčko wt larva mutant bicoid http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DB_Ch05/fig5_4.jpg oskar oskar mRNA zárodečné buňky http://www.nature.com/ncb/journal/v4/n5/images/ncb0502-e117-f1.jpg Důvody lokalizace mRNA 1.lokalizace mRNA zabraňuje nežádoucí expresi jinde než v místě potřeby * př. cytoplazmatické determinanty v embryu D. melanogaster – oskar, nanos; změna lokalizace vede k vývojovým abnormalitám * 2.rychlejší reakce na lokální požadavek proteinu * důležité především u velkých, polarizovaných buněk (např. neurony) Mechanismy lokalizace mRNA •1) místně specifická syntéza (vzácná) * gurken mRNA u Drosophily melanogaster * •2) lokální ochrana před degradací * degradace nesprávně lokalizovaných transkriptů * vyžaduje dva odlišné cis-elementy v 3´UTR oblasti (degradační a protekční) * evolučně konzervované * •3) difúze a ukotvení * pasivní difúze cytoplazmou až do zachycení vazeb. proteinem * nanos, cyklin B, gcl – posterior oocytu Drosophila * •4) aktivní transport * řízený cytoplazmatický transport za účasti cytoskeletu (myosiny, dyneiny, kinesiny + organely a další struktury) •Sekvenční elementy zajišťující lokalizaci mRNA • • Př. bicoid mRNA • - >600 nukleotidů bicoid mRNA smycka Tvorba mRNA tělísek (fázová separace) * 30 mRNA molekul * shluknutí do transportních částic * * oskar mRNA – putuje na jiných oskar mRNA molekulách * bicoid mRNA – tvorba dimerů Regulace translace * mRNA není translatována dokud se nedostane do svého cílového místa * * Proteiny interagující s 5´-UTR: * stabilizátory mRNA a inhibitory translace * zesilovače translace (enhancery) * * Proteiny interagující s 3´-UTR: * stabilita a lokalizace mRNA * význam polyadenylace mRNA -> vyšší stabilita mRNA • Nekanonická Wnt dráha (dráha planární buněčné polarity – PCP) •ustavení proximo-distální polarity v epitelu • •konvergentní extenze • •regulace morfogeneze Limb Development Wnts (Wingless/Int) Planární buněčná polarita v křídle octomilky Distální: Dsh – Dishevelled (DVL) Fz – Frizzled (FZD) Proximální: Stbm (Strabismus) – VANGL Pk – Prickle Stabilizující: Fmi (Flamingo) - CELSR Drosophila – planární buněčná polarita (planar cell polarity, PCP) PCP scheme drosophila wing Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 Molekulární mechanismus ustavení PCP Seifert and Mlodzik, Nature Reviews in Genetics, 2007 - legenda k obrázku: PCP v epitelu u savců: vnitřní ucho Orientace stereocilií vláskových buněk ve vnitřním uchu Actin Qian et al., 2007, Dev. Biol. inner_ear_hair_cells ear%20cutout Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců Poruchy v nekanonické signální dráze Wnt u savců Wnt/PCP dráha a konvergentní extenze frogs-gastrulation Ortology „klíčových“ genů zapojených do PCP signalizace vykazují u obratlovců typické fenotypy související s prodlužováním tělní osy - Konvergentní extenze (CE) - video Konvergentní extenze (CE) - video Konvergentní extenze (CE) - video Konvergentní extenze - video PCP dráha při konvergentní extenzi Buněčný princip konvergentní extenze Konvergentní extenze – migrace buněk směrem ke středu těla – vede k prodlužování tělní osy Možnosti studia CE - Kellerovy explantáty (Xenopus) Možnosti studia CE - Kellerovy explantáty (Xenopus) XLRP5MO control control XLRP5 MO LRP5MO+mLRP5 XLRP5 MO + mLrp5 Změny tvaru buněk při CE PCP proteiny aktivují během CE aktino-myosinový cytoskelet exencephaly Důsledky narušené konvergentní extenze (CE) Exencefalie Hamblet et al., 2002, Development Syndromy rozštěpu páteře Wnt/PCP dráha při morfogenezi Kinesin superfamily protein Kif26b links Wnt5a-Ror signaling to the control of cell and tissue behaviors in vertebrates | eLife Klíčové molekuly: Wnt5a (ligand) ROR1 a ROR2 (receptory) DVL (dishevelled) – cytoplazmatický protein Wnt5a knockout embryo E 18.5 +/+ -/- Yamaguchi et al., 1999 Determining the Role of Wnt5a Signaling in Embryonic Limb Outgrowth via Clonal Analysis - defekty v morfogenezi struktur vystupujících z těla (outgrowth) jako jsou končetiny, ocas, hlavové struktury nebo genitálie Wnt/PCP ovlivňuje morfogenezi díky kontrole buněčné orientace a asymetrického dělení RRS Provided by S. Stricker Mutace v ROR2 (a také WNT5A a DVL3) způsobují Robinowův syndrom Robinowův syndrom – soubor příznaků autozomálně dominantně dědičné dyschondroplazie. Trpasličí vzrůst je disproporcionální, přítomna je brachymelie, vystouplé čelo s hypertelorismem, hypoplazie dolní čelisti s četnými anomáliemi zubů, hypoplazie skrota a penisu, kryptorchismus. Plodnost a duševní vývoj je v normě Podobná mutace v DVL2 jako je pozorována u pacientů s RS podmiňuje specifický fenotyp buldoků a buldočků Whole genome variant association across 100 dogs identifies a frame shift mutation in DISHEVELLED 2 which contributes to Robinow-like syndrome in Bulldogs and related screw tail dog breeds Fig 1. Phenotype of screw tail breeds. (A) Photographs of typical representatives of breeds: 1. Boxer (brachycephalic and normal but docked tail), 2. Bulldog (brachycephalic and screw tail), 3. French Bulldog (brachycephalic and screw tail), and 4. Boston Terrier (brachycephalic and screw tail) (photographs courtesy of Nestle Purina PetCare).(B) 3D computed tomography reconstructions of 1) Boxer thoracic vertebrae, ventrodorsal view, 2) French Bulldog thoraco-lumbar vertebrae, ventrodorsal 3) French Bulldog thoraco-lumbar vertebrae lateral view. Pronounced kyphosis of the French Bulldog vertebral column is associated with multiple vertebral abnormalities including shortened vertebrae, hemivertebrae and butterfly vertebrae. 4) Lateral vertebral column radiograph of a Bulldog demonstrating the breed typical "screw tail" associated with multiple caudal vertebral malformations and truncation. (C) Computed tomography images of canine skulls showing the variation of skull morphologies: 1) German Shepherd (dolichocephalic), 2) Boxer 3) Bulldog 4) French Bulldog 5) Boston Terrier 6) Pug. White scale bar is 2 cm for each orientation. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1007850.g001 Migrace buněk neurální lišty Přehled hlavních migračních proudů NC – předozadní pohled Dorsolaterální a ventromediální migrace NC a hlavní molekulární regulátory Základní principy kontrolující migraci (nejen) buněk neurální lišty Základní principy kontrolující migraci (nejen) buněk neurální lišty Omezení trasy (confinement) Kolektivní migrace buněk je regulována prostorovým omezením (např. díky molekulám extracelulární matrix jako je proteoglykan versican), které působí jako fyzikálně-chemická bariéra a podporuje vznik organizované migrace v oddělených proudech. Kontaktní inhibice lokomoce Contact inhibition of locomotion Kontaktní inhibice lokomoce (CIL) je proces, při kterém se buňky, které přicházejí do vzájemného fyzického kontaktu, zastaví migraci v původním směru. Po kontaktu reagují repolarizací a migrací v opačném směru. Autokrinní chemotaxe (co-attraction) Autokrinní chemotaxe (co-attraction) mezi hromadně migrujícími buňkami je proces, při kterém buňky stejného typu vylučují chemoatraktant (např. součást komplementu C3a v buňkách neurální lišty), který stimuluje další buňky ve skupině, které mají receptory na tento chemoatraktant. Buňky reagují na stimulaci pohybem k sobě navzájem a udržují tak vysokou hustotu buněk. Kolektivní chemotaxe Kolektivní chemotaxe je proces, při kterém jsou buňky schopny účinnější chemotaxe v případě, že jsou ve skupině/společném kontaktu. Typický příklad u buněk NC je chemotaxe směrem k CXCL12 (SDF1) Axon guidance Navádění axonů (axon guidance) – proces(y), kterým je vznikající axon naváděn k cílovým neuronům, se kterými pak navazuje synaptická spojení Navádění axonů – růstový konus axon guidance Molekuly regulující axon guidance * Slit/Robo * ephriny * semaphoriny * klasické morfogeny (Wnt, BMPs, FGFs...) Eph/ephrin komplex ephb4 •ephrin – jsou membránově vázané ligandy (podobně jako ligandy Notch dráhy) •ephriny A – na membráně upevněny pomocí tzv. GPI kotvy •ephriny B – transmembránové ligandy, které samy jsou schopny signálovat do buňky •Eph/ephrin systém je zapojen zejména do „navigace“ buněk (např. buněk cév) či jejich částí (např. navádění axonů v nervové soustavě), a do „contact-mediated cell sorting“ ve vyvíjejícím se embryu. Jde o obecný mechanismus regulující migraci buněk. Eph/ephrin komplex Supporting Information Movie 2. Ephrin-B2 induces extremely rapid growth cone collapse and axon retraction in VT RGCs. Movie depicts VT growth cones treated with ephrin-B2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). Supporting Information Movie 4. Inhibiting Rho kinase strongly diminishes axon retraction but does not affect growth cone collapse. Movie depicts VT growth cones pre-treated the Rho kinase inhibitor Y-27632 for 1 hour, followed by treatment with ephrin-B2. Frames were captured at 30-second intervals for 45 minutes, replayed at 15 frames per second. 0.5 μg/ml pre-clustered ephrin-B2 was added after 15 minutes (2 second interval in movie). videa z Petros et al., Dev. Neurobiol. 2010 Semaphorin/plexin systém - semaphorin (Sema4D) je membránově vázaný ligand, který se váže na svůj receptor (plexin nebo neuropilin, Nrp1) - aktivace vede k aktivaci malých GTPáz (např. RhoA), přestavbě cytoskeletu a změně ve směru navádění Molekuly regulující axon guidance * Slit/Robo * ephriny * semaphoriny * klasické morfogeny (Wnt, BMPs, FGFs...) semaphorin Neurogeneze SC-sympathetic ganglion LMC-Lateral Motor Column (m-medial;l-lateral) Tran et al., 2007 Možnosti studia migrace – attractant/repelent assays Attractant/repelent Wnt repulsion Wnt Repulsion 2 Syntéza a připomenutí Všechny procesy diskutované v dnešní přednášce mají společného jmenovatele na buněčné úrovni: Dynamické procesy na úrovni cytoskeletu – pojďme si to připomenout. Slidy z Biologie živočišné buňky Pohyb buňky po substrátu figure_16_75.jpg Pohyb buňky po substrátu figure_16_84.jpg figure_16_84.jpg Klidová buňka Filopodia Stresová vlákna Lamelipodia fimbrin Arp2/3 filamin non-muscle Myosin II α-actinin Aktinová síť v lamelipodiu – klíčová role Arp2/3 figure_16_80.jpg Pohyb buňky po substrátu – klíčová role integrinů figure_16_82.jpg figure_16_82.jpg figure_16_84.jpg Malé GTPázy z Rho rodiny jsou klíčové regulátory cytoskeletu Výsledek obrázku pro small gtpases rho family figure_16_84.jpg figure_16_84.jpg Malé GTPázy z Rho rodiny jsou klíčové regulátory cytoskeletu Malé GTPázy z Rho rodiny jsou klíčové regulátory cytoskeletu figure_16_85a.jpg Pohyb buňky po substrátu figure_16_85b.jpg Pohyb buňky po substrátu – primární určení polarity figure_16_86b.jpg Rac1-RhoA v migraci (nejen) buněk neurální lišty *