Úvod do luminiscenční spektrometrie Petr Táborský v=3 v=2 v=1 v=0 S0 S2 S1 T1 ______ radiační přechody (s účastí fotonu) ............ neradiační přechody (bez účastí fotonu) absorpce absorpce vibrační relaxace fosforescence přechod mezi systémyvnitřní konverze fluorescence Jablonského diagram převzato z www.biophysic.com (25.7. 2014) Zpožděná fluorescence T1 S1 S0 fluorescence zpožděná fluorescence fosforescence ΔE (teplo, srážky, atd.) absorpce Absorpce Fluorescence 1 – rovnovážná konfigurace v základním stavu 2 – nerovnovážná konfigurace v excitovaném stavu (Franckův-Condonův stav) 3 – rovnovážná konfigurace v excitovaném stavu 4 – nerovnovážná konfigurace v základním stavu (Franckův-Condonův stav 1 2 3 4 Typy přechodů E σ π n π * σ * hladiny energií molekulových orbitalů Luminiscence molekuly je charakterizována: emisní spektrum (emisní maximum), excitační spektrum (excitační maximum), Stokesův posun, kvantový výtěžek, čas vyhasínání luminiscence Emisní a excitační spektra emisní spektrum (fluorescenční resp. fosforescenční spektrum): závislost intenzity luminiscence na vlnové délce. Měří se při konstantní lex. excitační (aktivační, „absorpční“) spektrum: závislost absorpce luminoforu (fluoroforu) na vlnové délce. Měří se při konstantní lem. 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 450 500 550 600 650 λ [nm] IF Emise Excitace λex, max λem, max Stokesův posun 3D luminiscenční spektra • emisní vs. excitační spektra • emise (resp. excitace) vs. Čas • synchronní sken Časově rozlišená luminiscence I = I0 exp -(t/) t I0 - 1 e excitační puls fluorescence IF • Doba života (luminescence lifetime):  = 1/ kF - kvalitativní a strukturní analýza, studium polohy fluoroforu Základní vztahy A = c l ε = log (Φo/Φ) (Lambert-Beerův zákon) A – absorbance, c – koncentrace, ε – absorbční koeficient, l – tloušťka kyvety, Φo - záření vyslané na vzorek, Φ - záření prošlé vzorkem F = k φ Φo (1-10-clε) F – fluorescenční signál (fotony/s), k – podíl emitovaných fotonů, které dorazí na detektor, φ – výtěžek luminiscence F = k φ Φo 2.3 c l ε zjednodušený vztah pro nízké koncentrace Schema měření fluorescence excitační zdroj výběr excitační l vzorek výběr emisní l detektor • obecná definice: φ = kf / (kf + ki + kx) kf rychlost emisního procesu (fluorescence) ki rychlost nezářivých přechodů (teplo, relaxace...) kx rychlost mezisystémových přechodů - jestliže rychlost deaktivačních procesů je pomalá ve srovnání s kf potom kvantový výtěžek je vysoký • kvantový výtěžek: φk = Nem/Nabs = Iem/Iabs = Iem/(I0-I) • energitcký výtěžek: φe = Eem/Eabs = hνem/hνex Výtěžek luminiscence φeφk (Stokesův posun) Excited molecule Photon emission (fluorescence) Intersystem crossing Delayed fluorescence Phosphrescence Excitation Internal conversion Intramolecular charge transfer Conforamtional change Electron transfer Energy transfer Proton transfer Photochemical transformation Formation of excimer (or exciplex) Possible de-excitation pathways of excited molecules Zhášení luminiscence (luminescence quenching) • luminiscenci konkuruje jiný děj, který vede k poklesu intenzity luminiscence • všechny možné procesy zhášení ještě nejsou zcela vysvětleny • dynamické (někdy též kolizní) a statické zhášení Dynamické zhášení luminiscence • k interakci mezi zhášečem a potenciálním fluoroforem dojde po excitaci, kdy excitovaná molekula vytvoří „komplex“ s jinou částicí (molekulou, „species“), který nefluoreskuje – dojde k vytvoření nových hladin a dojde k deexcitaci vnitřní konverzí. Typická je např. tvorba komplexu s kyslíkem rozpuštěným v rozpouštědle (oxidace), I-, Cs+, akrylamidem, atd. F0/F = 1 + KSV [Q] • Stern-Volmerova rovnice: F0 je intenzita fluorescence bez zhášedla, F je intenzita fluorescence se zhášedlem, KSV je Stern-Volmerova zhášecí konstanta, Q je koncentrace zhášedla • dynamické zhášení snižuje τ Dynamické zhášení Zhášení fluorescence fluoresceinu za přítomnosti I- Statické zhášení luminiscence • statické zhášení: ke „komplexaci“ dochází v základním stavu (vytvoří se nefluoreskující komplex). Luminiscence jsou pak schopny jen disociované molekuly, ale rychlost disociace je malá ve srovnání s se zářivými přechody (zářivé přechody jsou neefektivní). Typický příklad – komplexace těžkým kovem (snížení fluorescence kys. salicylové po komplexaci Fe(III).) F0/F = 1 + Ka[Q] Luminiscenční analýza Kvantitativní analýza: F = k φ Φo 2.3 c l ε Vysoká citlivost metody: • použití laserů • odezva na relativně malé změny v okolí Rozdělení luminiscence podle zdroje excitace • fotoluminiscence - absorpce energie ve formě světla • chemiluminiscence a bioluminiscence - zdrojem energie je chemická, nebo biochemická reakce • elektroluminiscence –zdrojem je el. proud • thermoluminiscence – zdrojem je tepelná energie • radioluminiscence – zdrojem je radioaktivní záření • triboluminiscence – zdrojem je mechanická energie • krystaloluminiscence – krystalizace je doprovázena luminiscencí • další zdroje (sonoluminiscence, atd.) Fotoluminiscence 0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00 4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00 270 290 310 330 350 370 390 410 430 450 470 l [nm] IF[a.u.] Trp Tyr Phe 0 7.0 Absorpce Fluorescence Aminokyselina Vln.délka (nm) Abs. koeficient Vln.délka (nm) Kvantový výtěžek Tryptofán (Trp) 280 5,600 348 0.20 Tyrosin (Tyr) 274 1,400 303 0.14 Fenylalanin (Phe) 257 200 282 0.04 1. P. Pekárková, Bakalářská práce, 2005 2. www.biotek.com Chinin emisní maximum: 446 nm excitační maximum: 349 nm Stokesův posun: 97 nm Deriváty fluoresceinu excitační maximum: 494 nm emisní maximum: 520 nm Deriváty rhodaminu 0 1 2 3 4 5 550 600 650 700 750 Vlnová délka [nm] IF Fluorofory s emisním maximem v oblasti kolem 600nm Fluorescenční sondy Fluorescenční sondy • vnější fluorofory, které se ke sledovaným molekulám, iontům, atd. váží nekovalentní vazbou • změna fluorescenční vlastností (intenzita emise, posun emisního maxima, změna času vyhasínání) • Princip: různý vliv na Franck-Condonův excitovaný stav Fluorescenční sondy pro využití v analytické chemii, medicíně a biologii • kromě měření emisních spekter se využívá zejména fluorescenční mikroskopie, zhášení (emise i času vyhasínání) • fluorescenční indikátory: sondy citlivé na určitou látku (většinou anion, či kation) • sondy pro polaritu prostředí • membránové sondy • fluorescenční sondy pro nukleové kys. • další • www.molecularprobes.com Fluorescenční značky Fluorescenční značky jsou nevlastní fluorofory, které se ke sledovaným biomolekulám (proteinům, peptidům, ligandům, oligonukleotidům a jiným) vážou kovalentní vazbou. Nejčastěji se používají k fluorescenčnímu značení proteinů, kdy se kovalentně vážou na jejich aminové, sulfhydrylové nebo histidinové boční řetězce, thiolové skupiny atd. Použití luminiscenčních značek: • analytické stanovení (např. v kombinaci se sep. metodou) • fluorescenční mikroskopie • FRET – měření vzdálenosti funkčních skupin • flow cytometry • fluorescenční in situ hybridizace (FISH) • značení buňek a tkání • fluorescenční „imunoassays“, klinická diagnostika Fluorescenční značky – vazebná místa amino-reaktivní značky sukcinimidyl estery (Rh6GSE) sulfonyl chloridy isothiokyanáty (FITC, RBITC) Chemiluminiscence Příklad chemiluminiscenční reakce – oxidace luminolu kyslíkem Chemiluminiscenční reakce • reakce luminolu v zásaditém prostředí s kyslíkem (peroxid, vzdušný kyslík) → modře fluoreskující roztok • jestliže jsou v roztoku obsažen také Fe2+, nebo Cu2+ (katalýza reakce) dochází k zvýšení intenzity luminiscence http://people.howstuffworks.com/luminol.htm Instrumentace pro chemiluminiscenční analýzu Ref: H. Sklenářová, Škola molekulové spektrometrie (2013) Bioluminiscence Bioluminiscence • celkem je známo asi 550 druhů organismů, které produkují luminiscenční světlo (suchozemští a mořští živočichové, houby) • v roce 1887 profesor Raphael Duboise izoloval ze světlušek dvě látky: luciferin a luciferázu • na zemi světélkují zejména brouci z čeledi Lampyriade (světlušky) a někteří kovaříci (např. Pyrophorus noctilucus) • v moři bylo zatím objeveno přibližně světélkujících 250 druhů: medusy, chobotnice, krakatice, ryby, paryby, atd. Zatím nebyl objeven žádný sladkovodní živočich jevící bioluminiscenci… • bioluminiscence živočichů je z evolučního hlediska vysvětlována různými důvody: hledání partnera (světlušky), lákání kořisti (např. ryba zubatka, některé druhy světlušek), maskování (žraloček brazilský), zastrašení nepřátel (ryba stříbrnáč, medusy z čeledi klanonožců) • bioluminiscence hub (např. některé druhy václavek, „Jack-O-Lantern“, helmovky) Bioluminiscenční houby - známo je asi 70 druhů hub jevících bioluminiscenci - některé rostou i v ČR (václavky a helmovky) - nejčastěji dřevokazné houby - někdy není jasné jaký má produkce světla pro houbu význam… Struktura GFP • GFP byl objeven Shimamurou v 60. letech • V roce 2008 byla udělena Nobelova cena „za objev a výzkum zeleně fluoreskujícího proteinu“ (Osamu Shimomura, Martin Chalfie, Roger Y. Tsien) • GFP obsahuje běžné aminokyseliny, ale ve slunečním světle jeví lehce nazelenalou fluorescenci (kolem 500 nm), stejně jako živá Aequorea Victoria v moři... • Klíčová sekvence (Ser-Tyr-Gly) se nachází „uvnitř plechovky“ • Protein má celkem 238 aminokyselin (26,9 kDa) Struktura GFP • GFP vzniká cyklizací, dehydratací a oxidací vzdušným kyslíkem sekvence proteinu obsahujícím Ser-Tyr-Gly Tsien Y. R., Annu. Rev. Biochem. 1998. 67:509–44. GFK – Green Fluorescent Králík Použití GFP v chemii a biologii • nejde o bioluminiscenci (chemiluminiscenci), ale o fotoluminiscenci (excitace lampou, nebo laserem) • obecně lepší rozlišení při sledování mikroskopem • sledování genové exprese • medicína a biologie: sledování metastáze tumoru Triboluminiscence Triboluminiscence • při škrábání, drcení, nebo tření může dojít k přerušení asymetrických vazeb krystalu (cukr, diamant) • náboj je po přerušení asymetrických vazeb nerovnoměrně rozložen • při vyrovnání nábojů v krystalu dochází k luminiscenci FRET • FRET je Fluorescence Resonance Energy Transfer – Fluorescenční rezonanční energetický transfér • podle objevitele Főrster nazýván také Förster Resonance Energy Transfer • přenos energie mezi dvěma fluorofory vzdálenými 10-100 Å Dexter electron transfer - theoretically proposed by D. L. Dexter in 1951 - NOT that DEXTER from TV series! - so called Dexter energy transfer - is a (fluorescence) quenching mechanism in which an excited electron is transffered from one molecule (a donor D) to a second molecule (an acceptor A) via non radiative way pat - wavefunction overlap between acceptor and donor is required - only short distances (typically within 10 Å) - Rate of ET is proportional to J spectral overlap - r is the separation of D from A - L is sum of Van der Waals radii of the D and the A Förster resonance energy transfer - so called fluorescence resonance energy transfer (FRET) - Theodor Förster was german physical chemist - ET between two chromophores (donor D and acceptor A) with appropriate spectral properties - D may transfer energy to an A through nonradiative dipole-dipole coupling - efficiency of this ET is inversely proportional to the sixth power of the distance between donor and acceptor - The method (FRET) is often used in analytical chemistry and biochemistry 1. první fluorofor (donor) je excitován specifickou vlnovou délkou 2. místo fluorescence je energie přenesena na druhý fluorofor (akceptor) 3. Akceptor vyzáří přijatou energii ve formě světla Podmínky: a) vzdálenost mezi molekulami je menší, než 100 Å b) emisní spektrum donoru se překrývá se absorpčním (excitačním) spektrem akceptoru c) molekuly mají stejně orientovány dipólové momenty FRET: schéma M 1 M 2 molekula 1 F1 F2 F1 F2molekula 2 F2 FRET Aplikace • sledování strukturních a konformačních změn (dvě molekuly (případně dvě části molekuly) jsou označeny donorem a akceptorem a sledujeme zda dochází k výměně energie • sledujeme: studium struktury proteinů, polynukleotidů, DNA, protein-protein interakce, DNA-protein interakce, atd. • analytické aplikace Sledováni změn konformace molekuly • např. sledování změn struktury proteinu, případně jiných biopolymerů • nevýhoda: ovlivnění struktury navázáním fluoroforů F1F1 F1 F1 FRET KONFORMACE 1 KONFORMACE 2