9. F O T O M E T R I C K Á T I T R A C E 9.1. Standardizace 0,01M roztoku chelatonu III na navážku PbCl[2] Roztok PbCl[2] se titruje odměrným roztokem (Na[2]H[2]Y) na indikátor xylenolovou oranž. Chelát xylenolové oranže s Pb^2+ (PbInd) je tmavě červenofialový, absorpční křivka má maximum při vlnové délce 580 nm, zbarvení volného indikátoru (Ind^2-) je za podmínek titrace jasně citrónově žluté s maximem absorbance při vlnové délce 430 nm. Titrace probíhá při pH = 5 - 6 (tlumivý roztok urotropinu). PbInd + H[2]Y^2^- ® PbY^2^- + 2H^+ + Ind^2- λ = 580nm PbCl[2] + H[2]Y^2- ® PbY^2- + 2 H^+ + 2 Cl- M(PbCl2) = 278,10 g/mol 9.1.1. Příprava roztoku standardu Na analytických vahách odvážit s přesností na jednu desetinu mg přibližně 70 mg chloridu olovnatého. Navážku kvantitativně převést do kádinky o objemu 100 ml, doplnit destilovanou vodou asi na 50 ml a okyselit 2–3 kapkami 2 M HNO[3]. Takto připravený roztok zahřát (nevařit!), po rozpuštění PbCl[2] kvantitativně převést do odměrné baňky o objemu 200 ml a doplnit destilovanou vodou po rysku. 9.1.2. Výpočet předpokládané teoretické spotřeby: kde: m je hmotnost navážky PbCl[2] v mg, M je molární hmotnost PbCl[2], c je koncentrace Chelatonu III (0,01 mol.l^-1). Číslo 20 ve zlomku představuje faktor zředění, protože budeme titrovat vždy 10 ml připraveného roztoku standardu, tj. 1/20 z 200 ml. 9.1.3. Orientační titrace s vizuální indikací Účelem této titrace je seznámení s obsluhou mikrobyrety a určení oblasti, kde dochází k barevnému přechodu. Návod k obsluze mikrobyrety PK2500 je uveden v kapitole Přístroje a přístrojové vybavení. Pokud není k dispozici mikrobyreta, může být nahrazena mikropipetou. Příprava roztoku k orientační titraci Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml roztoku standardu, 10 ml destilované vody, špachtlí přidat malé množství směsi xylenolové oranže s KNO[3] tak, aby roztok byl zřetelně slabě fialový. Kyvetu s roztokem promíchat mírnými otáčkami na magnetické míchačce, poté přidat 3 kapky 10% roztoku urotropinu (tlumivý roztok). K míchačce přistavit stojan s naplněnou mikrobyretou. Titrace Mikrobyretu o obsahu 2,5 ml naplnit odměrným roztokem Chelatonu III podle odstavce pro práci s mikrobyretou PK2500 v kapitole Přístroje a přístrojové vybavení. Z mikrobyrety přidávat odměrný roztok po 0,1 ml a za stálého míchání vizuálně pozorovat roztok až do přechodu barvy z fialové do čistě žluté. Nadávkovaný objem odečíst na stupnici mikrobyrety. 9.1.4. Fotometrická titrace Příprava roztoku k fotometrické titraci Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml roztoku standardu, 10 ml destilované vody, špachtlí přidat malé množství směsi xylenolové oranže s KNO[3] tak, aby roztok byl zřetelně slabě fialový. Kyvetu s roztokem promíchat mírnými otáčkami na magnetické míchačce, poté přidat 3 kapky 10% roztoku urotropinu (tlumivý roztok). Po přidání správné množství indikátoru je absorbance roztoku před započetím titrace při λ = 580 nm v rozmezí 0,6 až 0,9 (roztok je zřetelně světle fialový s přechodem do žlutého zbarvení). Titrace Při vlastní titraci je třeba přidávat odměrný roztok nejprve po 0,2 ml a zaznamenávat absorbanci. Po přiblížení k předpokládanému bodu ekvivalence na ±0,1 ml, je třeba snížit objem přidávaného činidla dle potřeby až na 0,005 ml (nejmenší objem, který lze dávkovat mikrobyretou ), příp. 0,01 ml (nejmenší objem, který lze dávkovat mikropipetou 10 – 100 µl). Titraci opakovat třikrát. 9.1.5 Zpracování výsledků Pro každou titraci sestrojit grafickou závislost absorbance titrovaného roztoku na objemu přidávaného činidla, kde : · na vodorovnou osu vynést objem přidávaného odměrného činidla v ml · na svislou osu odpovídající hodnoty absorbance titrovaného roztoku Graficky zjistit spotřebu odměrného činidla v bodě ekvivalence proložením jedné přímku několika body těsně před koncovým zlomem křivky a druhé přímky několika body za koncovým zlomem křivky. Z průsečíku těchto přímek spustit kolmici k vodorovné ose a odečíst spotřebu odměrného činidla. Při zjišťování bodu ekvivalence se vychází z principu, že od okamžiku dosažení ekvivalence se zbarvení roztoku nemění, proto je třeba zjistit okamžik vymizení barvy indikátorového komplexu. Výpočet přesné koncentrace (titru) odměrného činidla Pro každou hodnotu graficky získaného objemu titračního činidla v bodě ekvivalence spočítat přesnou koncentraci odměrného činidla v mol.l^-1 : kde: m[PbCl2] je navážka PbCl[2] v mg, V[ekv][ ] objem odměrného činidla v bodě ekvivalence v ml, M[PbCl2] je molární hmotnost PbCl[2] v g.mol^-1 (M = 278,10 g.mol^-1) Statistické zpracování výsledků Ze získaných hodnot sestavit do protokolu následující tabulku: λ = 580 nm poř. číslo titrace 1 2 3 V[ekv ][ml] c[ChelIII] [mol.l^-1] průměr c[ChelIII] [mol.l^-1] s(c[ChelIII]) [mol.l^-1] rel.směr.odchylka c[ChelIII] Výpočet směrodatné odchylky s provést podle Deana a Dixona z rozpětí (viz text na konci úlohy). Pro další výpočty používat přesnou koncentraci se čtyřmi platnými ciframi. 9.2 Titračně fotometrické chelatometrické stanovení kationtu Cu^2+ v neznámém vzorku 9.2.1. Fotometrická titrace neznámého vzorku obsahujícího Cu^2+ Reakce probíhá při mírně zásaditém pH nepřekračujícím hodnotu 8. Tohoto pH lze dosáhnout přídavkem amoniakálního tlumiče. Měď tvoří s murexidem chelát žluté barvy (CuInd). Při titraci roztokem Chelatonu III se nejprve na Chelaton III vážou volné ionty Cu^2+, chelát CuY^2- je modrý. V okolí bodu ekvivalence dojde k barevné změně způsobené reakcí Volný indikátor má při daném pH modrofialovou barvu. 1 mol Na[2]H[2]Y » 1 mol Cu^2+ M(Cu) = 63,546 g.mol^-1 Příprava vzorku Neznámý vzorek ve 100 ml odměrné baňce doplnit po značku destilovanou vodou a dobře promíchat. Orientační titrace s vizuálním pozorováním barevné změny Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml destilované vody, špachtlí přidat indikátor murexid, promíchat na magnetické míchačce (roztok se zbarví do středně syté oranžové barvy) a poté přidat 10 ml roztoku vzorku s neznámým obsahem mědi. Připravený roztok by měl být zbarven žlutozeleně až žlutooranžově. K míchačce přistavit stojan s mikrobyretou naplněnou roztokem odměrného činidla. Z mikrobyrety přidávat odměrný roztok po 0,1 ml a pozorovat za stálého míchání zbarvení roztoku. Těsně před předpokládaným bodem ekvivalence přidat 1 kapku amoniakálního tlumiče a titrovat až do přechodu do čistě fialového zbarvení. Nadávkovaný objem odečíst na stupnici mikrobyrety. Nastavení fotometru Před každou titrací je potřeba provést pro určenou vlnovou délku nastavení fotometru při vložené srovnávací kyvetě s destilovanou vodou. Příprava roztoku k fotometrické titraci Do kyvety fotometru o objemu 30 ml s míchadlem napipetovat 10 ml destilované vody, špachtlí přidat indikátor murexid, promíchat na magnetické míchačce a poté přidat 10 ml roztoku vzorku s neznámým obsahem mědi. Připravený roztok bude žlutozelený až žlutooranžový. Po přidání správné množství indikátoru je absorbance roztoku před započetím titrace při λ = 460 nm v rozmezí 0,4 až 0,6. Titrace Při vlastní titraci je třeba přidávat z mikrobyrety odměrný roztok nejprve po 0,1 ml a zaznamenávat absorbanci. Po přiblížení k předpokládanému bodu ekvivalence na ±0,1 ml, je třeba snížit objem přidávaného činidla dle potřeby až na 0,005 ml, současně je třeba těsně před předpokládaným bodem ekvivalence přidat 1 kapku amoniakálního tlumiče a poté titrovat až do přechodu do čistě fialového zbarvení. Nadávkovaný objem odečíst na stupnici mikrobyrety. Titraci opakovat třikrát. 9.2.2 Zpracování výsledků Pro každou titraci sestrojit grafickou závislost absorbance titrovaného roztoku na objemu přidávaného činidla, kde : · na vodorovnou osu vynést objem přidávaného odměrného činidla v ml · na svislou osu odpovídající hodnoty absorbance titrovaného roztoku Graficky zjistit spotřebu odměrného činidla v bodě ekvivalence proložením jedné přímku několika body těsně před koncovým zlomem křivky a druhé přímky několika body za koncovým zlomem křivky. Z průsečíku těchto přímek spustit kolmici k vodorovné ose a odečíst spotřebu odměrného činidla. Při zjišťování bodu ekvivalence se vychází z principu, že od okamžiku dosažení ekvivalence se zbarvení roztoku nemění, měří se buď konstantní zbarvení volné formy indikátoru nebo vymizení barvy indikátorového komplexu. Příklady titračních křivek při fotometrickém stanovení Cu^2+ jsou na obr. 9.1 a 9.2. Obr. 9.1: Fotometrická titrace Cu^2+ na murexid při 460 nm Obr. 9.2: Fotometrická titrace Cu^2+ na murexid při 550 nm Výpočet hmotnosti mědi v neznámém vzorku Dosazením do vzorce vypočítat hmotnost mědi ve vzorku: kde: V[ekv] je průměrná spotřeba odměrného činidla (ml), c[H2Y] je přesná koncentrace 0,01 M odměrného roztoku Chelatonu III, M[Cu] je molární hmotnost mědi (63,546 g.mol^-1), V[0] je objem odměrné baňky s neznámým vzorkem, V[pip] je objem roztoku pipetovaného do kyvety (10 ml). Statistické zpracování výsledků Zvlášť pro každou vlnovou délku zpracovat výsledky do následující tabulky do protokolu. Výpočet směrodatné odchylky s provést podle Deana a Dixona z rozpětí. λ = 460 nm poř. číslo titrace 1 2 3 V[ekv ][ml] m[Cu] [mg] průměr m[Cu] [mg] s(m[Cu]) [mg] rel.směr.odchylka 9.3. Postup měření na spektrofotometru UVVIS 1240 mini 1. Na ploše PC spustit program Fotometrická titrace. Po spuštění programu je třeba ho aktivovat kliknutím na ikonku „Continuous run“. 2. V záložce „Předpokládané objemy“ zvolte typ titrace: a) „orientační titrace“ - vyplnit kolonku „Navážená hmotnost chloridu olovnatého“ → po stlačení tlačítka „SPOČÍTAT“ se vypočítá předpokládaná spotřeba roztoku Chelatonu III. b) „přesná titrace“ vyplnit kolonku „Ekvivalenční objem z orientační titrace“ → po stlačení tlačítka „SPOČÍTAT“ se aktivuje tabulka s možností zadávání dávkování roztoku Chelatonu III (v tabulce v kolonce „Fotometrická titracce“ jsou již předdefinovanédoporučené objemy od 0 do 2,4 ml doplněné krokem 0,2 ml. 3. Nastavení spektrofotometru: Na hlavním panelu spektrofotometru pomocí tlačítka „RETURN“ se dostaneme na úvodní obrazovku na displeji. Po stlačení tlačítka „F4“ (PC Ctrl) se přepne kontrola ovládání spektrofotometru na připojený PC. 4. Nastavení programu - záložka „Fotometrická titrace“: Pro správnou funkci programu je nutné zvolit správný port, přes který je připojený spektrofotometr k PC. Z rolovací nabídky „VISA resource name“ je třeba vybrat port COM2. Po zvolení správného portu se kontrolka „Měření ukončeno“ rozsvítí zeleně a v poli „Absorbance text“ se zobrazí aktuální hodnota absorbance. 5. Na posuvníku „Pipetovaný objem“ nastavit objem přídavku roztoku Chelatonu III. Zpočátku přidávat po 0,2 ml, v oblasti bodu ekvivalence po co nejmenších objemech. 6. Po stlačení tlačítka „MĚŘIT“ se do tabulky naměřených hodnot přidá nový řádek s přidaným objemem Chelatonu III a danou naměřenou absorbancí. Celkový přidaný objem se zobrazí i v kolonce „Napipetováno celkem“. 7. Postup přidávání Chelatonu III pro požadovaný graf se zobrazuje v pravé části okna. 8. Po ukončení titrace otevřít záložku „Vyhodnocení titrace“: 9. Pro vyhodnocení titrace je nutné proložit grafem dvě přímky: a) pro proložení přímky, která prochází strmou částí grafu před bodem ekvivalence je nutné vyplnit hodnoty v levé části záložky b) pro proložení přímky, která prochází vodorovnou částí grafu za bodem ekvivalence je nutné vyplnit hodnoty v pravé části záložky Pořadová čísla jednotlivých titrací můžeme vyčíst z pole „Výstup měření“. Po stlačení tlačítka „VYHODNOTIT“ se přímky proloží grafem a určí se jejich průsečík, který lze vyčíst z pole „Ekvivalenční objem“. 10. Po provedení tří opakujících se titraci otevřít záložku „Statistické vyhodnocení analýzy“: 11. Po zadaní 3 ekvivalenčních objemů vybrat z rolovací nabídky „Typ vyhodnocení“: a) „Výpočet přesné koncentrace odměrného činidla“ pro výpočet přesné koncentrace odměrného roztoku Chelatonu III b) „Výpočet množství mědi v neznámém vzorku“ pro výpočet obsahu mědi ve vzorku. Výsledek statistického zpracování dat se zobrazí v poli „Statistické vyhodnocení“. 12. Záložka „Uložení“ slouží k uložení naměřených a vyhodnocených dat. Je třeba předběžně si vytvořit cestu pro jejich uložení (vytvořit si složku a zkopírovat sdresu): 9.4. Statistické vyhodnocení výsledků analýzy Pro statistické vyhodnocení výsledků analýzy použít matematicko-statistického postupu dle Dean-Dixona, který se používá pro zpracování malých souborů paralelních výsledků, jež jsou obvykle k dispozici při analýzách praktických vzorků. 1. Výsledky m[i] seřadit podle rostoucí velikosti. 2. Vypočítat rozpětí souboru R = m[3] -[ ]m[1]. 3. Zjistit, zda některý z výsledků m[i] není zatížen hrubou chybou, tj. zda se statisticky významně s určitou pravděpodobností neliší od ostatních paralelních výsledků stanovení. Použít Q-testu, vypočítat hodnoty Q[3] a Q[1] dle rovnic , a porovnat je s kritickou hodnotou Q(3, a) z tabulce statistických konstant (tab. III). Je-li Q[3] nebo Q[1] větší než Q(3; 0,05), znamená to, že příslušná hodnota je zatížena hrubou chybou a musí být ze souboru vyřazena. 4. Vypočítat průměrnou hodnotu m[x] jako hodnotu nejbližší správnému výsledku Vyhodnotit variabilitu paralelních výsledků, jako míru přesnosti stanovení vypočítat směrodatnou odchylku s (jako chybu jednotlivých měření) podle Dean-Dixona z rozpětí R s pomocí tabelované konstanty k[i],[ ]která je pro daný počet paralelních stanovení i uvedena v tabulce statistických konstant[ ](tab. 9.1) 5. Přesnost měření charakterizovat také směrodatnou odchylkou průměru s[x] 6. Protože se směrodatná odchylka vztahuje k určitému definovanému provedení analýzy a obvykle závisí i na obsahu stanovované složky, vyjadřit přesnost ve vztahu ke stanovovanému množství jako relativní směrodatnou odchylku s[r] 7. Pokud je známa směrodatnou odchylku s a průměr m[x], lze jako výsledek analýzy definovat interval (v jednotkách výsledku), v němž s určenou pravděpodobností leží správný výsledek (jde o definici intervalu spolehlivosti) m[x] ± K[i] × R Konstantu K[i] odečíst z tabulky statistických konstant (tab. 9.1) pro daný počet stanovení. Tab. 9.1: Statistické konstanty dle Dean-Dixona (pro a = 0,05) počet měření i k[i] K[i] Q 2 0.086 0,71 6,4 3 0,591 0,58 1,3 0,941 4 0,486 0,50 0,72 0,765 5 0,430 0,45 0,51 0,642 6 0,395 0,41 0,40 0,560 7 0,370 0,38 0,33 0,507 8 0,351 0,35 0,29 9.4. Vyhodnocení fotometrické titrace Při vyhodnocení stanovení Cu^2+ v neznámém vzorku v protokolu uvést: 1. Hodnoty nalezených koncentrací Chelatonu III a hmotností Cu^2+ v neznámém vzorku zaokrouhlené na platný počet míst, vyplněné tabulky a vyhodnocené grafy. 2. Statistické vyhodnocení výsledku analýz. 3. Zdůvodnění možného chybného stanovení.