PCR metody Princip PCR Princip PCR • https://www.youtube.com/watch?v=a5jmdh9AnS4&ab_channel=Am oebaSisters • https://www.youtube.com/watch?v=hO3mTqrEeq8&ab_channel=2Mi nuteClassroom • https://www.youtube.com/watch?v=wBrNbbAIAFo&ab_channel=AM BOSS%3AMedicalKnowledgeDistilled Aplikace PCR • identifikace a charakterizace infekčních agens • přímá detekce mikroorganismů ve vzorcích pacientů • identifikace mikroorganismů pěstovaných v kultuře • detekce antimikrobiální rezistence • zkoumání kmenové příbuznosti patogenu zájmu • genetický fingerprinting (forenzní aplikace/testování otcovství) • detekce mutace (vyšetřování genetických chorob) • klonování genů • PCR sekvenování Real time PCR (qPCR) • Sledování amplifikace úseku DNA v reálném čase • Metody kvantifikace • Nespecifické fluorescenční barviva interagující s dsDNA • Sekvenčně specifické fluorescenčně značené DNA sondy Reverse-transcriptase PCR (RT-PCR) • Využití reverzní transkriptázy k přepsání RNA do cDNA • Následná amplifikace PCR • Může probíhat jedno až dvoukrokově • Možno spojit s qPCR Multiplex PCR • Amplifikace několika DNA sekvencí naráz za použití specifických primerů pro každou sekvenci • Hybridizace primerů s cílovou sekvencí při stejné teplotě • Rozeznání rozdílných amplikonů • Rozdílná délka • Použití značených primerů Nested PCR • Modifikace PCR pro zvýšení přesnosti a specificity • Dva PCR běhy s dvěma sety primerů • První set primerů ohraničuje ten druhý High fidelity PCR •PCR s nízkou mírou chybovosti •Přesná polymeráza schopná oprav za pomoci 3’-5’ exonukleázové aktivity •Vhodné pro aplikace vyžadující velmi přesnou amplifikaci genu Fast PCR •rychlost PCR závisí na řadě faktorů •Taq DNA Polymerase ~ 1 kb/min •enzymy schopné provádět fast PCR 2-6 kb/min •nemá vliv na výtěžek Hot Start PCR • snižuje přítomnost nežádoucích produktů a dimerů primerů • ovlivnění DNA polymerázy, použití modifikovaných dNTP, fyzické přidání 1 z činidel po denaturaci • zvýšení citlivosti detekce pomocí PCR GC-Rich PCR • Taq DNA polymeráza + Tgo DNA polymeráza • umožňuje velmi efektivně amplifikovat obtížné templáty, jako jsou cíle bohaté na GC • doporučeno TA klonování • semikvantitativní analýza, genotypizace a vyhledávání a klonování sekvence kandidátního genu s vysokým obsahem GC Long-range PCR •amplifikace délek DNA, které nelze typicky amplifikovat pomocí rutinních PCR metod nebo činidel •30 kb a více •usnadňuje amplifikaci delších fragmentů DNA a také oblastí bohatých na GC Arbitrary Primed PCR • využití primerů, jejichž nukleotidová sekvence je libovolně zvolena • DNA fingerprinting Děkujeme za pozornost.