MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE GENY SIRNÉHO METABOLISMU V BIOOXIDACI PYRITU Diplomová práce Alena Šustová VEDOUCÍ PRÁCE: DOC. ING. MARTIN MANDL, CSC. BRNO 2015 Bibliografický záznam Autor: Bc. Alena Šustová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Název práce: Geny sirného metabolismu v biooxidaci pyritu Studijní program: Biochemie Studijní obor: Biochemie Vedoucí práce: doc. Ing. Martin Mandl, CSc. Akademický rok: 2014/2015 Počet stran: 53 Klíčová slova: Acidithiobacillus ferrooxidans; tetrathionanhydrolasa; thiosírandehydrogenasa; oxidace pyritu; proteinová purifikace; genová exprese Bibliographic Entry Author Bc. Alena Šustová Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Title of Thesis: Genes of sulfur metabolism in the biooxidation of pyrite Degree programme: Biochemistry Field of Study: Biochemistry Supervisor: doc. Ing. Martin Mandl, CSc. Academic Year: 2014/2015 Number of Pages: 53 Keywords: Acidithiobacillus ferrooxidans; tetrathionate hydrolase; thiosulfate dehydrogenase; pyrite oxidation; protein purification; gene expression Abstrakt Tato diplomová práce se zabývá identifikací genů kódujících proteiny, které se účastní oxidace elementární síry a redukovaných anorganických sirných sloučenin u bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans a jejich exprese při oxidaci pyritu. V teoretické části jsou shrnuty současné poznatky o buněčné stavbě bakterie At. ferrooxidans a předpokládané metabolické dráhy oxidace železa(II) a zejména sirných látek. Dále se tato část zaměřuje na metody molekulární analýzy na úrovni transkripce. V experimentální části byla optimalizována kultivace bakterií At. ferrooxidans na pyritu a následná separace planktonických a adherovaných buněk. Byly purifikovány proteiny tetrathionanhydrolasa a thiosírandehydrogenasa účastnící se metabolismu sirných látek, u nichž byly identifikovány jejich geny. Dále byla sledována exprese těchto a dalších vybraných genů sirného metabolismu v kulturách At. ferrooxidans rostoucích na pyritu. Abstract This thesis is focused on the identification of genes encoding proteins that are involved in the oxidation of elemental sulfur and reduced inorganic sulfur compounds and their expression in Acidithiobacillus ferrooxidans grown on pyrite. The theoretical part summarizes the current knowledge about cellular structure of At. ferrooxidans and proposed pathways of iron oxidation and especially oxidation of sulfur compounds. Furthermore, this section focuses on methods of molecular analysis used at a transcription level. In the experimental part were optimized cultivation of At. ferrooxidans on pyrite and separation of planktonic and sessile cells. The proteins tetrathionate hydrolase and thiosulfate dehydrogenase involved in the metabolism of sulfur compounds were purified and their genes have been identified. The expression profiles of identified genes and some other genes supposed to be involved in sulfur metabolism in At. ferrooxidans grown on pyrite were examined. Poděkování Ráda bych poděkovala vedoucímu své diplomové práce, doc. Ing. Martinu Mandlovi, Csc. za přátelský přístup a Mgr. Jiřímu Kučerovi, Ph.D za vstřícnost, odborné vedení a cenné rady, které mi poskytl v průběhu zpracování této práce. Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány. Brno 5. měsíce 2015 ……………………………… Bc. Alena Šustová 8 Obsah 1. ÚVOD ............................................................................................................................. 10 2. TEORETICKÁ ČÁST........................................................................................................ 11 2.1. Acidithiobacillus ferrooxidans ...................................................................................... 11 2.1.1. Bakterie adherované a planktonické .................................................................. 12 2.1.2. Extracelulární polymerní vrstva......................................................................... 12 2.1.3. Pily ..................................................................................................................... 13 2.1.4. Metabolismus železa .......................................................................................... 13 2.1.5. Metabolismus síry .............................................................................................. 15 2.2. Thiosírandehydrogenasa................................................................................................ 16 2.2.1. Gen pro thiosírandehydrogenasu........................................................................ 16 2.3. Tetrathionanhydrolasa................................................................................................... 17 2.3.1. Gen pro tetrathionanhydrolasu........................................................................... 18 2.4. Pyrit ............................................................................................................................... 19 2.5. Bioloužení ..................................................................................................................... 19 2.5.1. Thiosíranový mechanismus................................................................................ 20 2.5.2. Polysulfidový mechanismus............................................................................... 20 2.5.3. Využití při těžbě mědi........................................................................................ 21 2.6. Molekulární analýza RNA ............................................................................................ 23 3. CÍLE PRÁCE................................................................................................................... 24 4. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST................................................................................................ 25 4.1. Materiál a metody.......................................................................................................... 25 4.1.1. Mikroorganismus a kultivační podmínky .......................................................... 25 4.1.2. Média.................................................................................................................. 25 4.1.2.1. Kultivace bakterií rostoucích na Fe2+ ......................................................... 25 4.1.2.2. Kultivace bakterií rostoucích na tetrathionanu ........................................... 26 4.1.2.3. Kultivace bakterií rostoucích na pyritu....................................................... 27 4.1.3. Sběr a zpracování bakterií rostoucích na pyritu................................................. 28 4.1.3.1. Sběr frakce planktonických bakterií ........................................................... 28 4.1.3.2. Sběr frakce bakterií adherovaných na pyritu .............................................. 28 4.1.4. Příprava buněčného cytosolu ............................................................................. 29 4.1.5. Kinetická měření ................................................................................................ 29 4.1.5.1. Stanovení pH............................................................................................... 29 4.1.5.2. Stanovení koncentrace Fe3+ iontů ............................................................... 29 4.1.5.3. Stanovení počtu bakterií ve vzorku............................................................. 30 4.1.6. Stanovení enzymové aktivity ............................................................................. 30 4.1.6.1. Stanovení aktivity tetrathionanhydrolasy ................................................... 30 4.1.6.2. Stanovení aktivity thiosírandehydrogenasy................................................ 30 4.1.7. Purifikace proteinů............................................................................................. 30 4.1.7.1. Afinitní chromatografie (AC) ..................................................................... 30 4.1.7.2. Ionexová chromatografie (IEC).................................................................. 31 4.1.8. Ultrafiltrace vzorku ............................................................................................ 31 9 4.1.9. SDS-PAGE......................................................................................................... 31 4.1.10. LC-MS/MS analýza............................................................................................ 32 4.1.11. Manipulace s RNA............................................................................................. 32 4.1.12. Reverzní transkripce a real-time PCR................................................................ 33 4.2. Výsledky........................................................................................................................ 35 4.2.1. Optimalizace sběru adherovaných bakterií pomocí oscilace ............................. 35 4.2.2. Optimalizace sběru adherovaných bakterií pomocí ultrasonikace..................... 35 4.2.3. Poměr planktonických a adherovaných bakterií během kultivace na pyritu...... 36 4.2.4. Purifikace a identifikace tetrathionanhydrolasy................................................. 36 4.2.4.1. Ionexová chromatografie pro tetrathionanhydrolasu.................................. 37 4.2.4.2. SDS-PAGE pro tetrathionanhydrolasu ....................................................... 38 4.2.4.3. LC-MS/MS analýza pro tetrathionanhydrolasu.......................................... 38 4.2.5. Purifikace a identifikace thiosírandehydrogenasy.............................................. 39 4.2.5.1. Ionexová chromatografie pro thiosírandehydrogenasu............................... 39 4.2.5.2. SDS-PAGE pro thiosírandehydrogenasu.................................................... 40 4.2.5.3. LC-MS/MS analýza pro thiosírandehydrogenasu....................................... 41 4.2.6. Analýza genové exprese pomocí RT-qPCR....................................................... 42 4.3. Diskuse.......................................................................................................................... 46 5. ZÁVĚR ........................................................................................................................... 49 6. SEZNAM ZKRATEK ........................................................................................................ 50 7. SEZNAM LITERATURY ................................................................................................... 51 10 1. Úvod Studium bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans a dalších acidofilních mikroorganismů má nejen aplikační potenciál v biotěžbě kovů, případně v řešení okyselování podzemních vod, ale tyto bakterie jsou velmi zajímavé i jako představitelé extremofilních organismů. Žijí ve velmi kyselém prostředí a využívají anorganické látky jako síru nebo sulfidy kovů jako zdroj energie. V teoretické části se práce majoritně zabývá studiem metabolismu síry a železa(II) u bakterie At. ferrooxidans a v experimentální části práce jsou purifikovány enzymy účastnící se metabolických procesů sirných sloučenin. Studuje se exprese vybraných genů, u kterých se předpokládá, že jsou zapojeny v sirném metabolismu této bakterie. Cílem experimentální práce je přinést další aspekty ve stávajících teoretických modelech sirného metabolismu bakterie At. ferrooxidans. 11 2. Teoretická část 2.1. Acidithiobacillus ferrooxidans Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans je chemolitoautotrofní, Gram-negativní, nesporulující mikroorganismus, který je schopen růstu při extrémních hodnotách pH < 3. Optimální teplotní škála pro růst této bakterie se pohybuje mezi 10 – 37 °C. Na jejím povrchu se vyskytuje slizovité pouzdro a krátké filamentární struktury, tzv. pily. Její přirozený výskyt je hlavně v důlních vodách, jedná se často o depozita rudy nebo uhlí. 1 Tabulka 1. Taxonomické zařazení bakterie At. ferrooxidans 2 Říše Bacteria Kmen Proteobacteria Třída Acidithiobacillia Řád Acidithiobacillales Čeleď Acidithiobacillaceae Rod Acidithiobacillus Druh Acidithiobacillus ferrooxidans Bakterie At. ferrooxidans má širokou metabolickou kapacitu. Kromě toho, že získává energii oxidací železnatých iontů (Fe2+ ) a redukovaných anorganických sirných sloučenin (RISC), dokáže také oxidovat molekulární vodík, kyselinu mravenčí a další kovové ionty. Využívá neobvykle širokou škálu elektronových akceptorů, v jejím genomu bylo identifikováno více než 11 různých cytochromů typu c. 3 Tento organismus je také výjimečný svým významným zastoupením v oblastech těžebních ložisek, v depozitech kovů a všude tam, kde je jako zdroj energie přítomen pyrit (FeS2) nebo další sulfidy kovů. Ukázalo se, že bakterie At. ferrooxidans preferuje jako zdroj energie pyrit před chalkopyritem (CuFeS2), sfaleritem (ZnS) a galenitem (PbS). 1 Bakterie At. ferrooxidans získává energii potřebnou pro růst z oxidace železnatých iontů na železité a RISC sloučenin až na kyselinu sírovou. Oxidace železnatých iontů a RISC sloučenin poskytuje elektrony potřebné k redukci kyslíku na vodu, a tím i energii pro tvorbu ATP, ale také k redukci NAD(P)+ na NAD(P)H, jenž se účastní dalších anabolických procesů. 4 12 2.1.1. Bakterie adherované a planktonické Bakterie At. ferrooxidans se mohou v přítomnosti pyritu nacházet ve dvou stavech. V jednom z těchto stavů jsou bakterie fyzicky adherované přímo na pyritu, kterých je nižší procento než planktonických, tzn. nacházející se volně v roztoku. 5 Adherované bakterie na pyritu vykazují vyšší hydrofobicitu než planktonické bakterie, díky čemuž se snižuje povrchové napětí mezi bakterií a povrchem pyritu a tím dochází i k efektivní adhezi buněk na povrchu minerálu. Na adhezi mají podíl van der Waalsovy interakce. 6 Planktonické bakterie jsou na základě nedávné transkripční analýzy spíše přizpůsobené k oxidaci Fe2+ na Fe3+ , kdežto bakterie adherované jsou genově uzpůsobené pro oxidaci sirných sloučenin. 5 Byly pozorovány různé hladiny exprese genů u adherovaných bakterií oproti bakteriím planktonickým. Zvýšená exprese byla pozorována například u sulfidchinonreduktasy a tetrathionanhydrolasy u adherovaných buněk. U planktonických buněk byla zvýšená exprese u oxidoreduktasy SdrA2, cytochromu CycA1, Rieskeho proteinu a cytochromu Cyc2. Porozumění těmto rozdílům by mohlo zlepšit biotěžbu umělým převedením bakterií ze stavu planktonického do stavu adherovaného a naopak. 5 Planktonické a adherované bakterie se také liší v produkci EPS vrstvy, na povrchu planktonických bakterií se nachází tenčí EPS vrstva než na povrchu adherovaných bakterií na pyritu. 6 2.1.2. Extracelulární polymerní vrstva Klíčovou funkci v přichycení se bakterie na minerální povrch má extracelulární polymerní vrstva (EPS), která je složena hlavně z polysacharidů (42 %), hexahydrátů Fe3+ (54 %), kyseliny glukuronové (0,5 %) a dalších složek (3,5 %). Na vnější membráně působí elektrostaticky nebo jinými typy interakcí pomocí proteinů bohatých na polární skupiny. 7 Pokud bakterie At. ferrooxidans rostou na pyritu, inkorporují do své EPS vrstvy kyselinu močovou a Fe3+ , na rozdíl od bakterií rostoucích na síře. Byly provedeny pokusy, kdy pomocí kombinací ultrazvuku a centrifugace byla z bakterií odstraněna EPS vrstva. Takto upravené bakterie poté téměř nebyly schopny adherovat se na minerální povrch. Jakmile byly ale smíchány s EPS suspenzí, jejich schopnost přilnout k minerálnímu povrchu byla znovu obnovena. Maximální adheze bakterií na minerální povrch nastala, když k bakteriím bez EPS 13 vrstvy byla přidána EPS suspenze spolu s Fe3+ ionty, zatímco pokud byly spolu s EPS suspenzí přidány Fe2+ ionty, byla pozorována jen slabá adheze bakterií na povrch minerálu. 8 Fe3+ ionty zakotvené v EPS jí dávají pozitivní náboj, který umožňuje elektrochemickou interakci s negativně nabitým povrchem minerálu. 9 2.1.3. Pily Kromě toho, že se EPS vrstva významně podílí na přichycení se bakterie na minerální povrch, má také podíl na shlukování bakterií a jejich následné soudržnosti. Také tvoří skelet filamentárních útvarů zvaných pily na povrchu bakterie, které jsou schopné kontrakcí takovým způsobem, aby bakterii umožnily pohyb. Počet těchto útvarů na povrchu je závislý na době kultivace. Bakterie At. ferrooxidans obsahuje celou řadu genů, které jsou zapojené v jejich biosyntéze. 10 2.1.4. Metabolismus železa I když je bakterie At. ferrooxidans modelovým organismem, oxidace železa je zkoumána již několik let i u dalších acidofilních organismů. V současné době známe více možných variant modelů respiračních řetězců v závislosti na daném organismu. Nicméně všeobecně přijímaný model u bakterie At. ferrooxidans je založen na průkazných genetických a biochemických skutečnostech, které jsou dále potvrzovány. Ukázalo se, že elektrony z Fe2+ můžou být transportovány v přímém nebo nepřímém (reverzním) elektronovém toku. Většina (asi 90 %) elektronů je transportována přímým elektronovým tokem z Fe2+ na kyslík, jež vede k syntéze ATP. Zbytek elektronů je transportován nepřímým elektronovým tokem z Fe2+ na NAD(P)+ , jehož redukovaná forma je využívána k anabolickým aktivitám jako fixace CO2 a N2. 11 Kvůli vysokému redoxnímu potenciálu Fe2+ /Fe3+ (+0,77 V při pH = 2) může být železo použito jako donor elektronu jenom v přítomnosti elektronového akceptoru s vyšším redoxním potenciálem, což je například O2/H2O (+1,12 V při pH = 2). 11 Při metabolismu železa je u této bakterie vysoce exprimován operon rus, který kóduje geny hlavního přímého elektronového toku respiračního řetězce a jsou to geny cyc2 (membránový cytochrom c), cyc1 (cytochrom c552), coxB (aa3 cytochrom c oxidasa II), coxA (aa3 cytochrom 14 c oxidasa I), coxC (aa3 cytochrom c oxidasa III) a geny rus a acoP kódující rusticyanin a AcoP. Rusticyanin je periplazmatický modrý Cu protein, který patří mezi tzv. cupredoxiny a je důležitou komponentou respiračního řetězce, kde se podílí na transportu elektronů. Rusticyanin je též větvící bod přímého a nepřímého elektronového toku v respiračním řetězci. AcoP je periplazmatický zelený Cu protein také z rodiny cupredoxinů s vysokým redoxním potenciálem, u nějž se předpokládá funkce ve stabilizaci a ochrany CuA centra komplexu aa3 cytochrom c oxidasy před kyselým prostředím (viz Obr. 1). Dále je exprimován petI operon, který kóduje geny podílející se na reverzním elektronovém toku, a to cycA1 (cytochrom c4) a geny tvořící cytochrom bc1 komplex I, což jsou petA1 (ubichinoncytochrom c reduktasa, tzv. Rieskeho protein), petB1 (cytochrom b) a petC1 (cytochrom c1). Reverzní elektronový tok naráží na bioenergetický problém standardního redukčního potenciálu, takže elektrony jsou v reverzním elektronovém toku přenášeny proti redoxnímu gradientu. Tento problém je řešen proton-motivní silou, která se přirozeně vyskytuje na membráně (pH vnější = 2, pH vnitřní = 7). 4,12,13 Obr. 1. Předpokládaný model oxidace železa. Cytochrom Cyc2 na vnější membráně, přenáší elektrony z Fe2+ na periplazmatický rusticyanin, který je předává v přímé dráze membránově vázanému cytochromu Cyc1 a odsud na cytochrom c oxidasu CoxBACD, kde je kyslík redukován na vodu. Všechny tyto proteiny jsou kódovány rus operonem. Reverzní dráha vede přes cytochrom bc1 komplex I a chinonový pool na NAD(P)+. Cytochrom bc1 komplex I a cytochrom CycA1 jsou kódovány petI operonem. 4 15 2.1.5. Metabolismus síry Ve srovnání s metabolismem železa, které se vyskytuje jen ve dvou oxidačních stavech (+II a +III), síra existuje v oxidačních stavech od -II do +VI, což komplikuje identifikaci meziproduktů a enzymů v oxidaci síry. Některé sirné sloučeniny jsou oxidovány abioticky, což také ztěžuje odlišení enzymatických kroků od ryze chemických. 13 Na metabolismu RISC se podílí celá škála různých enzymových komplexů a elektronových přenašečů lokalizovaných v různých buněčných kompartmentech. Oxidaci sulfidu HSzajišťuje sulfidchinonreduktasa, která je kódovaná genem sqr. Produktem oxidace elementární síry je siřičitan, který je dále pravděpodobně zpracováván síranadenylyltransferasou, která je kódovaná genem sat. V sirném metabolismu se dále vyskytuje operon hdr kódující heterodisulfidreduktasový komplex, tusA a drsE geny, jejichž funkce ještě nebyla zcela objasněna, ale pravděpodobně se účastní oxidace aktivované síry pomocí glutathionu (GSSH, GSSG) na siřičitan. 14 V sirném metabolismu se více exprimují geny operonů cyd, cyo, dox a petII. Operon cyd kóduje geny cydA a cydAB pro bd ubichinonoxidasu. Operon cyo kóduje geny cyoABCD pro bo3 ubichinonoxidasu. Operon dox obsahující doxDA gen pravděpodobně kóduje thiosírandehydrogenasu. Operon petII kóduje geny cycA2 (cytochrom c4), hip (HiPIP – FeS protein s vysokým redoxním potenciálem) a geny cytochrom bc1 komplexu II jako petA2 (Rieskeho protein), petB2 (cytochrom b), petC2 (cytochrom c1) (viz Obr. 2). 4 Obr. 2. Předpokládaný model oxidace síry. Cytochrom bc1 komplex II je v tomto případě kódován operonem petII a získává elektrony z ubichinonu. Ty pak přenáší na membránově vázaný cytochrom CycA2 nebo na periplazmatický HiPIP, které je dále přenášejí na terminální oxidasu, kde se redukuje kyslík na vodu. Nerozpustná síra je přeměňována na glutathion disulfid (GSSG). Následuje kaskáda enzymových transferas a elektrony jsou předávány až na terminální oxidasu. (TQR – thiosíranchinonreduktasa, SQR – sulfidchinonreduktasa) 4 16 2.2. Thiosírandehydrogenasa Thiosírandehydrogenasa TDH (také thiosíranchinonoxidoreduktasa, TQO) je enzym, pravděpodobně tetramer, sestávající ze čtyř identických podjednotek o molekulové hmotnosti 45 000 Da. Optimální pH pro aktivitu thiosírandehydrogenasy je 3,0. 15 Její enzymová aktivita byla detekována v bakteriích At. ferrooxidans ATCC 19859, rostoucích na síře i na železe. U bakterií rostoucích na síře, však byla aktivita přibližně 20x vyšší než u bakterií rostoucích na železe, což indikuje, že exprese tohoto enzymu je regulována substrátem, na kterém kultura roste. 16 Aktivita thiosírandehydrogenasy byla také nalezena v membráně termoacidofilní archebakterie Acidianus ambivalens. Elektronovými přenašeči zde byly ferrikyanid a decyl ubichinon. Enzymová aktivita thiosírandehydrogenasy byla inhibována siřičitanem. Holoenzym byl složen ze dvou podjednotek o velikosti 28 kDa a 16 kDa. Ukázalo se, že větší podjednotka je identická s proteinem DoxA a menší s proteinem DoxD, obě tyto podjednotky byly dříve popsány jako součást komplexu cytochromu aa3. 17 Thiosíran je sirná sloučenina, která se v metabolismu RISC může oxidovat přes tetrathionan a další sirné sloučeniny až na síran, jako finální produkt těchto oxidací. Thiosírandehydrogenasa katalyzuje oxidaci thiosíranu na tetrathionan. Tato reakce probíhá v periplazmatickém prostoru bakterie. 15 2.2.1. Gen pro thiosírandehydrogenasu V mikroorganismech byly nalezeny nejméně čtyři metabolické cesty oxidace thiosíranu. První z nich byl popsán u bakterie Thiobacillus versutus (nyní známá jako Paracoccus versutus), která využívá k oxidaci thiosíranu multi-enzymový Sox komplex. Geny kódující Sox komplex byly nalezeny např. u bakterií Acidithiobacillus caldus a Acidithiobacillus thiooxidans, ale u bakterie At. ferrooxidans prokázány nebyly. Druhá metabolická cesta byla prokázána u bakterie Starkeya novella, která také má Sox komplex, i když neúplný a k oxidaci thiosíranu navíc využívá další membránově vázaný multienzymový komplex. Třetí metabolickou cestu využívají bakterie At. ferrooxidans, Thermithiobacillus, Halothiobacillus, Acidiphilium a Tetrathiobacter. Tyto bakterie oxidují thiosíran přes tetrathionan pomocí thiosírandehydrogenasy, nicméně tyto geny nebyly dosud popsány. Prvním z identifikovaných genů pro thiosírandehydrogenasu byl tsdA gen popsán u bakterie 17 Allochromatium vinosum. Tento gen nebyl nalezen u žádné z bakterií z rodu Acidithiobacillus. Čtvrtá metabolická cesta byla nalezena u bakterie Acidianus ambivalens, kde je thiosíran metabolizován membránově vázaným enzymem thiosíranchinonoxidoreduktasou (TQO). Geny, které pravděpodobně kódují TQO byly nalezeny u bakteriíí At. ferrooxidans, At. caldus, At. thiooxidans a At. ferrivorans, ale biochemická funkce TQO ještě nebyla úplně objasněna. 18,19 Gen pro TDH byl identifikován na lokusu AFE_0042 u bakterie At. ferrooxidans ATCC 23270. Je to gen o velikosti 810 bp a kóduje protein o 270 aminokyselinách a velikosti 25 kDa. Prvních 37 aminokyselin tvoří signální peptid. Ukázalo se, že exprese genu na lokusu AFE_0042 je výrazně zvýšená u bakterií rostoucích na síře nebo na thiosíranu oproti bakteriím rostoucím na železe. 18 Odpovídající gen byl původně anotován jako gen kódující protein s doménou vyskytujících se u proteinů, jež jsou součástí twin-arginin translokační dráhy. 19 2.3. Tetrathionanhydrolasa Tetrathionanhydrolasa (TTH) je pravděpodobně dimer sestávající ze dvou identických podjednotek o molekulové hmotnosti přibližně 52 kDa. Optimální hodnota pH pro aktivitu enzymu je 3,0 stejně jako u thiosírandehydrogenasy. Podílí se na oxidaci redukovaných sirných sloučenin rozkladem tetrathionanu způsobem, který nebyl zatím jednoznačně stanoven. 20 Tento enzym má rozdílnou lokalizaci v závislosti na bakteriálním druhu, ve kterém se vyskytuje. U bakteriálních druhů At. caldus KU ATCC 51756, At. thiooxidans ON 107, Ap. acidophilum DSM 700 a At. ferrooxidans ATCC 19859 byl lokalizován v periplazmě, kdežto u bakteriálních druhů At. ferrooxidans Funis 2-1 a At. ferrooxidans ATCC 23270 byl popsán jako membránově vázaný enzym. 21 Výslednými sloučeninami této metabolické cesty jsou S2O3 2, SO4 2a S0 . Možným intermediátem je velmi reaktivní kyselina disulfan-monosulfanová (HS2SO3 - ) nebo polythionany, které jsou však velmi reaktivní a ihned se rozpadají. 20 Některé studie naznačují, že aktivita tetrathionanhydrolasy je zodpovědná za produkci nápadných extracelulárních sirných globulárních útvarů, které byly pozorovány při aerobní i mikroaerobní kultivaci bakterie At. ferrooxidans na thiosíranu. U těchto kultivací byla zaznamenána extra pro tato extracelulární depozita elementární síry. také identifikován i v globulárních útvarů u bakterií oxid (viz Obr. Obr. At. ferrooxidans 2.3.1. Gen pro tetrathionanhyd Gen pro TTH 23270, 32 aminokyselin. Protein bez si za protein vázaný na Tetrathionan jako hlavní zdroje energie. To naznačuje, že tetrathionan jsou meziprodukty Tetrathionan syntetizoval zaznamenána extra pro tato extracelulární depozita elementární síry. identifikován i v globulárních útvarů u bakterií oxid br. 3). 22 3. Předpokládaný model produkce extracelulárníc ferrooxidans. 22 Gen pro tetrathionanhyd Gen pro TTH (tetH 23270, o celkové velikosti 449 aminokyselin. Protein bez si protein vázaný na Tetrathionanhydrolasa byla detek hlavní zdroje energie. To naznačuje, že tetrathionan jsou meziprodukty Tetrathionanhydrolasa syntetizoval pouze v zaznamenána extracelulární aktivita tetrathionan pro tato extracelulární depozita elementární síry. identifikován i v extracelulární frakci. globulárních útvarů u bakterií oxid Předpokládaný model produkce extracelulárníc 22 Gen pro tetrathionanhyd tetH) se nachází n vé velikosti 449 aminokyselin. Protein bez si protein vázaný na vnější membráně zapojený do sirného metabolismu. hydrolasa byla detek hlavní zdroje energie. To naznačuje, že tetrathionan jsou meziprodukty sirného metabolismu hydrolasa byla heterologně pouze v inaktivní celulární aktivita tetrathionan pro tato extracelulární depozita elementární síry. extracelulární frakci. globulárních útvarů u bakterií oxidujících sirné sloučeniny, nebyl Předpokládaný model produkce extracelulárníc Gen pro tetrathionanhydrolasu ) se nachází na lokusu AF vé velikosti 449 aminokyselin aminokyselin. Protein bez signálního peptidu má velikost 49 vnější membráně zapojený do sirného metabolismu. hydrolasa byla detekována u bakterií rostoucích na hlavní zdroje energie. To naznačuje, že tetrathionan metabolismu bakterie a heterologně inaktivní formě inkluzních tělísek. 18 celulární aktivita tetrathionanhydrolasy, která by mohla být vysvětlením pro tato extracelulární depozita elementární síry. Samotný enzym byl extracelulární frakci. Nicméně mechanismus produkce těchto sirných ujících sirné sloučeniny, nebyl Předpokládaný model produkce extracelulárníc a lokusu AFE_0029 aminokyselin obsahující signální peptid o velikosti gnálního peptidu má velikost 49 vnější membráně zapojený do sirného metabolismu. ována u bakterií rostoucích na hlavní zdroje energie. To naznačuje, že tetrathionan bakterie At. ferrooxidans exprimován formě inkluzních tělísek. hydrolasy, která by mohla být vysvětlením Samotný enzym byl Nicméně mechanismus produkce těchto sirných ujících sirné sloučeniny, nebyl Předpokládaný model produkce extracelulárních sirných globulár 0029 u bakterie obsahující signální peptid o velikosti gnálního peptidu má velikost 49 vnější membráně zapojený do sirného metabolismu. ována u bakterií rostoucích na hlavní zdroje energie. To naznačuje, že tetrathionan i produkt jeho hydrolýzy, thiosíran, At. ferrooxidans exprimována u bakterie formě inkluzních tělísek. 21 hydrolasy, která by mohla být vysvětlením Samotný enzym byl v extracelulární frakci Nicméně mechanismus produkce těchto sirných ujících sirné sloučeniny, nebyl dosud ještě objasněn h sirných globulárních útvarů u bakterie At. ferrooxidans obsahující signální peptid o velikosti gnálního peptidu má velikost 49 714 Da vnější membráně zapojený do sirného metabolismu. ována u bakterií rostoucích na síře, tetrathionanu i na pyritu i produkt jeho hydrolýzy, thiosíran, At. ferrooxidans. 21 u bakterie E. coli. Nicméně hydrolasy, která by mohla být vysvětlením extracelulární frakci Nicméně mechanismus produkce těchto sirných dosud ještě objasněn ních útvarů u bakterie At. ferrooxidans obsahující signální peptid o velikosti Da a je považován vnější membráně zapojený do sirného metabolismu. , tetrathionanu i na pyritu i produkt jeho hydrolýzy, thiosíran, . Nicméně protein se hydrolasy, která by mohla být vysvětlením extracelulární frakci Nicméně mechanismus produkce těchto sirných dosud ještě objasněn bakterie At. ferrooxidans ATCC obsahující signální peptid o velikosti a je považován vnější membráně zapojený do sirného metabolismu. , tetrathionanu i na pyritu i produkt jeho hydrolýzy, thiosíran, protein se 19 2.4. Pyrit Pyrit je minerál, který patří mezi sulfidy kovů a je nejrozšířenějším sulfidickým minerálem naší planety. Má chemický vzorec FeS2 a jeho Fe i S atomy jsou vázané v krystalické mřížce. Stejně jako podobné sulfidy MoS2 (molybdenit) a WS2 (tungstenit) se skládá ze dvou atomů síry, které tvoří nevazebné orbitaly. Vazby v pyritu můžou být přerušeny jen vícestupňovým elektronovým přenosem za pomoci silného oxidovadla, jako je například Fe3+ iont. U některých jiných sulfidů kovů může vazbu mezi S atomem a atomem kovu přerušit i proton odebráním elektronů z valenční vrstvy. Jsou to například CuFeS2 (chalkopyrit), FeS (troilit), ZnS (sfalerit), PbS (galenit) a další. Tyto sulfidy kovů jsou relativně rozpustné v kyselině, kdežto pyrit je v kyselině nerozpustný. 3 2.5. Bioloužení Bioloužení je proces získávání vzácných kovů z rud s nízkým obsahem těchto kovů pomocí mikroorganismů. K mikroorganismům, které jsou schopné převádět sulfidy kovů do rozpustné formy, patří jak acidofilní bakterie, tak archebakterie. Kromě kmene Proteobacteria (hlavně rody Acidithiobacillus, Acidiphilium, Acidiferrobacter, Ferrovum), se k bioloužícím organismům řadí dále bakteriální kmeny Nitrospirae (Leptospirillum), Firmicutes (Alicyclobacillus, Sulfobacillus) a Actinobacteria (Ferrimicrobium, Acidimicrobium, Ferrithrix). 3 Bioloužící bakterie se musí vypořádat s problémem nedostatku anorganického fosfátu (Pi), který je pro všechny živé organismy nezbytný. Tento nedostatek je způsoben srážením Pi v prostředí bohatém na Fe3+ ionty na ve vodě nerozpustný FePO4. Bylo zjištěno, že bakterie At. ferrooxidans a některé další bioloužící bakterie dokáží hromadit zásoby anorganických polyfosforečnanů a využívat je jako alternativní zdroj Pi. 3 Byl popsán přímý a nepřímý mechanismus bioloužení. Přímý mechanismus bioloužení znamená přímý přenos elektronu ze sulfidu kovu do buňky přisedlé na minerálním povrchu. Nepřímý mechanismus bioloužení zprostředkovávají Fe3+ ionty, které jsou produkovány jak planktonickými bakteriemi, tak i těmi adherovanými. 3 Oxidace sulfidů kovů byla popsána dvěma různými mechanismy – (a) thiosíranovým mechanismem, kterým se pravděpodobně oxiduje pyrit, a (b) polysulfidovým mechanismem, kterým dochází k oxidaci v kyselině rozpustných sulfidů. Tvorba meziproduktů sirných 20 sloučenin v těchto procesech záleží na složení daného sulfidu kovu a také na parametrech okolního prostředí, hlavně na hodnotách pH. Meziprodukty jsou nejprve tvořeny díky rozkladu sulfidů a následně jsou oxidovány metabolickou činností mikroorganismů, které oxidují ionty Fe2+ na Fe3+ . Acidofilní sirné mikroorganismy mohou katalyzovat oxidaci sirných meziproduktů až na kyselinu sírovou. 3 2.5.1. Thiosíranový mechanismus Pyrit je pomocí Fe3+ iontu oxidován na první rozpustný sirný meziprodukt, kterým je thiosíran (S2O3 2). Ten je téměř ihned oxidován na tetrathionan chemicky pomocí Fe3+ nebo enzymaticky za účasti thiosírandehydrogenasy. Tetrathionan je pak pomocí tetrathionanhydrolasy degradován na síran za vzniku dalších sirných sloučenin jako je elementární síra a thiosíran. Tyto sirné sloučeniny jsou dále biochemicky oxidovány na konečný produkt, síran (viz Obr. 4). Thiosíranový mechanismus se dá shrnout následujícími sumárními rovnicemi 1 – 2:3 ‫ܵ݁ܨ‬ଶ ൅ 6‫݁ܨ‬ଷା ൅ 3‫ܪ‬ଶܱ → ܵଶܱଷ ଶି ൅ 7‫݁ܨ‬ଶା ൅ 6‫ܪ‬ା (1) ܵଶܱଷ ଶି ൅ 8‫݁ܨ‬ଷା ൅ 5‫ܪ‬ଶܱ → 2ܱܵସ ଶି ൅ 8‫݁ܨ‬ଶା ൅ 10‫ܪ‬ା (2) 2.5.2. Polysulfidový mechanismus Ve srovnání s oxidací pyritu je u sulfidů, které jsou rozpustné v kyselině, nejprve přerušena vazba mezi kovem a sulfidem pomocí protonů z kyselého prostředí, a teprve poté dochází k oxidaci sirných sloučenin. Při nízkém pH se sirná část tohoto sulfidu oxiduje hlavně na elementární síru (S8). Ačkoliv je elementární síra chemicky inertní, v přírodních podmínkách dochází kvůli aktivitě mikroorganismů k její oxidaci na kyselinu sírovou. Polysulfidový mechanismus (viz Obr. 6) se dá shrnout následujícími sumárními rovnicemi 3 – 5:3 ‫ܵܯ‬ ൅ ‫݁ܨ‬ଷା ൅ ‫ܪ‬ା → ‫ܯ‬ଶା ൅ ܱ, 5 ‫ܪ‬ଶܵ௡ ൅ ‫݁ܨ‬ଶା ሺ݊ ൒ 2ሻ (3) 0,5 ‫ܪ‬ଶܵ௡ ൅ ‫݁ܨ‬ଷା → ܱ, 125 ଼ܵ ൅ ‫݁ܨ‬ଶା ൅ ‫ܪ‬ା (4) 0,125 ଼ܵ ൅ 1,5 ܱଶ ൅ ‫ܪ‬ଶܱ → ܱܵସ ଶି ൅ 2‫ܪ‬ା (5) 21 Obr. 4. Schémata bioloužení. A) thiosíranový mechanismus, B) polysulfidový mechanismus. 3 2.5.3. Využití při těžbě mědi Bakterie At. ferrooxidans je hojně využívána při biotěžbě nebo bioloužení především pro získávání mědi z chalkopyritu. Technologie bioloužení obecně využívá metabolické činnosti vhodného konsorcia bakterií pro získávání kovů z minerálů jejich převedením na rozpustnou formu. Dalšími kovy, které se takto získávají, jsou například zlato, stříbro, kobalt, nikl, zinek a uran. 3 Většina ze známých acidofilních bakterií oxidujících železo, je inhibována vysokými koncentracemi chloridových iontů, což ztěžuje biotěžbu v pouštních oblastech Chile nebo Austrálie, kde je nedostatek sladkovodních zdrojů. Nicméně právě v severní Chile byly objeveny halotolerantní, acidofilní bakterie, které jsou schopné aktivně oxidovat železo až do koncentrace 1 M NaCl. 3 Při získávání mědi biotěžbou nedochází k uvolňování oxidu siřičitého a arsenu, jako při klasické těžbě, ale musí se zabránit úniku kyseliny sírové, jež je během biotěžby bakteriálně produkována. Biotěžba zajišťuje 10 % světové produkce mědi a některé haldy mohou být značně rozsáhlé. Jedna z největších hald používající tuto technologii je zřízena v 22 dole Escondida v poušti Atacama v severní Chile. Bioloužící halda je 5 km dlouhá, 2 km široká a 126 m vysoká. 3 Drcená ruda s obsahem mědi se nashromáždí do haldy, je pokropena kyselinou sírovou a provzdušněna k iniciaci bakteriální oxidace sloučenin železa a síry. Prvním krokem procesu je oxidace Fe2+ na Fe3+ a druhým krokem je oxidace Cu+ na více rozpustnou Cu2+ za současné redukce Fe3+ zpět na Fe2+ . Současně dochází k produkci kyseliny sírové biologickou oxidací redukovaných sloučenin síry, což také přispívá ke zvyšování rozpustnosti mědi. Měď je potom z kyselého roztoku získávána pomocí fyzikálně-chemických technologií za použití rozpouštědel nebo elektrolyticky. 1 23 2.6. Molekulární analýza RNA Existuje více molekulárních metod pro analýzu transkriptomu – kompletní sady molekul RNA organismu. Nejvíce se používají metody RT-PCR a Northernův přenos, využívají se ale i DNA mikročipy a různé další modifikace těchto metod. Molekuly RNA jsou citlivé na degradaci RNasami, proto se musí zabránit kontaminaci vzorku těmito stabilními enzymy. 23 Reverzně transkripční PCR (RT-PCR) využívá enzymu reverzní transkriptasy, která katalyzuje syntézu řetězců cDNA komplementárních k mRNA templátům. Řetězce cDNA mohou být syntetizovány za použití oligo(dT) primerů, které nasedají na 3´-poly(A)konce všech mRNA nebo specifických oligonukleotidových primerů. PCR potom zahrnuje tři kroky, v prvním kroku je DNA obsahující sekvence, které mají být amplifikovány, denaturována zahřátím na 92 – 95 °C po dobu asi 30 sekund, ve druhém kroku je DNA hybridizována s nadbytkem specifických primerů při teplotě 50 – 60 °C po dobu asi 30 sekund a ve třetím kroku je použita DNA-polymeráza k replikaci úseku DNA mezi komplementárními místy ke specifickým primerům při teplotě 70 – 72 °C po dobu asi 90 sekund. V následujícím cyklu dojde k denaturaci produktů z předchozího cyklu a proces se opakuje, dokud není dosaženo potřebné amplifikace. 23 Northernův přenos se používá ke studiím genové exprese. Je to přenos molekul RNA separovaných pomocí gelové elektroforezy na membránu. Většina molekul RNA má sekundární strukturu a musí během elektroforézy zůstat denaturovaná, aby došlo k separaci na základě velikosti. Denaturace se provádí přídavkem formaldehydu nebo jiného denaturačního činidla do elektroforetického pufru. Po přenosu na membránu se RNA imobilizuje pomocí UV záření nebo vysušením a hybridizuje se značenými RNA nebo DNA sondami. 23 Pro analýzu celých genomů se využívají mikročipy. Nukleotidové sekvence specifické pro konkrétní gen se navážou na membránu ve specifickém uspořádání. Tyto matrice se potom hybridizují se značenými RNA nebo cDNA, jejichž množství se dále zjišťuje skenováním, kdy se měří množství radioaktivity nebo fluorescence, podle typu značení. Výsledky se analyzují na základě srovnání se signálem známých kontrolních sond. 23 24 3. Cíle práce 1. Purifikace vybraných proteinů metabolismu sirných látek a identifikace jejich genů 2. Optimalizace separace planktonických a adherovaných buněk At. ferrooxidans rostoucích na pyritu 3. Analýza exprese vybraných genů sirného metabolismu v kulturách At. ferrooxidans rostoucích na pyritu 25 4. Experimentální část 4.1. Materiál a metody 4.1.1. Mikroorganismus a kultivační podmínky Všechny experimenty byly prováděny s bakterií At. ferrooxidans CCM 4253 původem ze Zlatých Hor v Jeseníkách. Tento kmen je na základě sekvenace genu pro 16S rRNA (GenBank: EF465493) téměř 100% identický s kmenem bakterie At. ferrooxidans ATCC 23270. 4.1.2. Média 4.1.2.1. Kultivace bakterií rostoucích na Fe2+ Bakteriální kultura byla kultivována v 9K médiu (viz Tabulka 2) 24 . Každá složka byla sterilizována varem. Po vychladnutí na laboratorní teplotu se smíchaly složky A1 a A2 za vzniku složky A. Tato složka byla přidána ke složce B a za stálého míchání byly přidány 2 ml složky C. Kultivace probíhala na rotační třepačce při 28 °C a pH bylo udržováno pod 1,8 pomocí kyseliny sírové. Vyrostlá kultura (obvykle po 3 dnech) byla sklizena centrifugací (15 000 × g, 10 min, 4 °C) a získané buňky byly promyty médiem s obsahem základních solí (viz Tabulka 4). Takto připravené buňky byly použity jako inokulum pro následné kultivace na tetrathionanu a pyritu. 26 Tabulka 2. Složení 9K kultivačního média Složka Jednotlivé složky Množství na 1 l media A1 dH2O 600 ml (NH4)2SO4 3,0 g KCl 0,1 g MgSO4 · 7 H2O 0,5 g A2 dH2O 100 ml K2HPO4 0,5 g B dH2O 300 ml FeSO4 · 7 H2O 44,2 g C dH2O 100 ml Ca(NO3)2 · 4 H2O 0,71 g 4.1.2.2. Kultivace bakterií rostoucích na tetrathionanu Pro účely purifikace enzymů tetrathionanhydrolasy a thiosírandehydrogenasy byly bakteriální železité kultury adaptovány na tetrathionan a poté pěstovány v bioreaktoru o objemu 10 l v růstovém médiu se složením uvedeným v Tabulce 3. Jako substrát sloužil tetrathionan draselný ve složce B, která byla před přidáním do složky A sterilizována membránovou filtrací přes TM (0,22 µm). Jednotlivé složky byly sterilizovány varem. Tabulka 3. Složení tetrathionanového kultivačního média. Složka Jednotlivé složky Množství na 1 l média A dH2O 980 ml (NH4)2SO4 3,0 g KCl 0,1 g K2HPO4 0,5 g MgSO4 · 7 H2O 0,5 g Ca(NO3)2 0,01 g B dH2O 20 ml K2S4O6 2,0 g Kultivace probíhala na elektromagnetické míchačce (300 rpm) při 28 °C za nepřetržité aerace. Počáteční pH bylo okolo 4. Indikátorem růstu bakterií na tetrathionanu byl pokles pH k hodnotám 1 – 2 a vznik zákalu. Doba kultivace se pohybovala okolo 14 dnů. Vyrostlé bakteriální kultury byly asepticky sklizeny centrifugací při 15 000 × g po dobu 10 min a 4 °C. 27 Bakteriální pelet byl dále promyt v mediu s obsahem základních solí a uskladněn při teplotě -70 °C. 4.1.2.3. Kultivace bakterií rostoucích na pyritu Pro účely stanovení exprese vybraných genů sirného metabolismu u buněk rostoucích na pyritu byly železité buňky kultivovány v médiu s obsahem základních solí (viz Tabulka 4) a pyritu v koncentraci 10 g/l. Pyrit (separovaný přírodní materiál o průměru částic 40µm) byl před použitím sterilizován převařením ve vodě o pH = 1,3 a ponechán za stálého míchání 24 hodin. Kyselá voda z něj byla poté asepticky odsáta a tím i odstraněna značná část Fe3+ a jiných kovových kontaminantů, jež jsou při nízkém pH rozpustné. Každá složka media s obsahem základních solí byla sterilizována varem. Po vychladnutí na laboratorní teplotu se smíchaly složky A1 a A2 za vzniku složky A, ke které byly za stálého míchání přidány 2 ml složky B. Tabulka 4. Složení média s obsahem základních solí. Složka Jednotlivé složky Množství na 1l média A1 dH2O 900 ml KCl 0,1 g (NH4)2SO4 3,0 g MgSO4 · 7 H2O 0,5 g A2 dH2O 100 ml K2HPO4 0,5 g B dH2O 100 ml Ca(NO3)2 · 4 H2O 0,71 g Kultivace probíhala v 10 l bioreaktoru na elektromagnetické míchačce (400 rpm) při 28 °C za nepřetržité aerace. Kultivace trvaly zpravidla 14 dní, během kterých byly v pravidelných intervalech odebírány vzorky bakteriální populace, u nichž byly sledovány základní kinetické parametry kultury. Bylo testováno několik postupů zpracování pyritových bakteriálních kultur, které jsou popsány níže. 28 4.1.3. Sběr a zpracování bakterií rostoucích na pyritu Pro účely následujících molekulárně-biologických analýz byly bakteriální kultury rostoucí na pyritu homogenně odebírány každý třetí den v objemu 250 – 300 ml. 4.1.3.1. Sběr frakce planktonických bakterií Pyrit s frakcí adherovaných bakterií byl z média odstraněn papírovou filtrací. Filtrát, ve kterém se nacházely planktonické bakterie, byl centrifugován při 15 000 × g po dobu 10 min při 4 °C. Bakteriální pelet byl dále promyt (10 000 × g, 10 min, při 4 °C.) v médiu s obsahem základních solí a uskladněn při teplotě -70 °C. 4.1.3.2. Sběr frakce bakterií adherovaných na pyritu A) Dekantace pomocí oscilačního mlýnku Papírovou filtrací zachycený pyrit byl opatrně promyt médiem s obsahem základních solí, aby se odstranily případné zbylé planktonické bakterie. Poté byl pyrit smíchán s 8 ml média s obsahem základních solí a protřepáván na oscilačním mlýnku se skleněnými mikrokuličkami. Optimalizace této metody byla prováděna s variabilními průměry skleněných mikrokuliček, za použití různých frekvencí a času oscilace. Následně byla provedena další papírová filtrace, kde došlo k záchytu pyritu a skleněných perel. Filtrát byl centrifugován (10 000 × g po dobu 10 min, při 4 °C) a takto byla získána frakce adherovaných bakterií. Bakteriální pelet byl uskladněn při -70 °C. B) Dekantace pomocí ultrasonikace Papírovou filtrací zachycený pyrit byl opět opatrně promyt médiem s obsahem základních solí, aby došlo k odstranění možných zbylých planktonických bakterií. K takto promytému pyritu a na něm adherovaným bakteriím byly přidány 3 ml deionizované vody o pH = 1,5 a homogenní směs byla rozdělena do tří zkumavek. Vzorky byly vortexovány 5 s, a poté vloženy do ultrasonické lázně (Bransonic Ultrasonic Bath, M Series) při 4 °C a frekvenci 40 kHz po různé časové intervaly. Poté byly vzorky papírově filtrovány, filtráty uschovány a stejný postup byl opakován ještě jednou. Získané uvolněné bakterie z obou kroků byly smíchány a uskladněny při -70 °C. 29 4.1.4. Příprava buněčného cytosolu K mechanickému narušení bakteriální stěny se silnou vrstvou EPS byl využit cyklus ultrasonických vysokofrekvenčních pulzů v pravidelných krátkých intervalech při 4 °C, aby nedošlo k nadměrnému přehřívání buněk a denaturaci proteinů. Biomasa byla rozsuspendována v 50 mM Tris/HCl pufru o pH 3. Díky nízkému pH tohoto pufru bylo zajištěno srážení a oddělení proteinů, jež jsou nestabilní v kyselém pH. Tento krok byl primárním krokem purifikace cílových sirných enzymů. Pro sonikaci byl použit přístroj Sono plus HD 2200 s hrotem TT3. Dále byl vzorek umístěn do oscilačního mlýnku s 0,5 g skleněných mikrokuliček (balotina) o průměru 0,17 – 0,18 mm. Frekvence oscilace byla 30 Hz po dobu 20 min. Po rozrušení buněčných membrán byl vzorek centrifugován při 40 000 × g po dobu 40 min a teplotě 4 °C. Supernatant reprezentující celkový buněčný cytosol s proteiny byl uskladněn při -20 °C. 4.1.5. Kinetická měření 4.1.5.1. Stanovení pH Ke stanovení pH byla použita elektroda (Radiometer) a pH metr – PHM 93 (Radiometer Copenhagen) 4.1.5.2. Stanovení koncentrace Fe3+ iontů Stanovení koncentrace Fe3+ iontů probíhalo na spektrofotometru ULTRASPEC 2000, Pharmacia Biotech při vlnové délce 300 nm 25 . Jako slepý vzorek sloužila voda o pH = 0,5 (upraveno pomocí H2SO4), která se používala i na samotné ředění vzorku. Vzorek byl 100x ředěný. Koncentrace železitých iontů bez zahrnutí ředění vzorku byla vypočítána na základě lineární kalibrace metody podle vztahu: ‫݁ܨ‬ଷାሾ݉݃ ∙ ݈ିଵሿ ൌ 30 ∙ ‫ܣ‬ଷ଴଴ 1,13 30 4.1.5.3. Stanovení počtu bakterií ve vzorku Stanovení počtu bakterií bylo prováděno mikroskopicky pomocí optického mikroskopu BX50 (Olympus). Byla použita komůrka Cyrus II a výsledek byl získán pomocí vzorce: ‫݋݌‬č݁‫݊ݑܾ ݐ‬ě݇ 1 ݈݉ ൌ ∅ ‫݋݌‬č݁‫݊ݑܾ ݐ‬ě݇ ൈ ř݁݀ě݊í ൈ 2 ൈ 10଺ 4.1.6. Stanovení enzymové aktivity 4.1.6.1. Stanovení aktivity tetrathionanhydrolasy Aktivita tetrathionanhydrolasy byla spektrofotometricky stanovována jako nárůst absorbance za čas při vlnové délce 300 nm. Byla sledována tvorba síranu draselného po přidání enzymu projevující se jako bílá sraženina. Slepým vzorkem pro toto měření byla reakční směs bez přidaného enzymu. Reakční směs obsahovala 1 M síranový pufr o pH = 2,8 (upraveno H2SO4) a 10 mM K2S4O6. 4.1.6.2. Stanovení aktivity thiosírandehydrogenasy Aktivita thiosírandehydrogenasy byla spektrofotometricky stanovována jako pokles absorbance za čas při vlnové délce 420 nm. Pokles absorbance byl způsoben úbytkem hexakyanoželezitanu draselného po přidání enzymu projevující se jako postupné odbarvování se žluté reakční směsi. Slepým vzorkem byla reakční směs bez přidaného enzymu. Reakční směs obsahovala 50 mM acetátový pufr o pH = 5,0, 1 mM K3Fe(CN)6 a 5 mM Na2S2O3. 4.1.7. Purifikace proteinů 4.1.7.1. Afinitní chromatografie (AC) K afinitní chromatografii na systému Pharmacia LKB FPLC byla použita kolona naplněná sorbentem Sepharose CL-4B s imobilizovaným cytochromem c, která byla již dříve připravena a použita pro purifikaci thiosírandehydrogenasy. 26 Nejprve byl systém promyt 50 mM Tris/HCl pufrem o pH = 7,0 s přídavkem 2 M NaCl. Vysoká iontová síla zajistila důkladné promytí kolony od případných předešlých navázaných kontaminantů. Poté se kolona promyla Tris/HCl pufrem pro odstranění veškeré soli. Vzorek 31 buněčného cytosolu, ve kterém byla předem spektrofotometricky zjištěna tetrathionanhydrolasová a thiosírandehydrogenasová aktivita, byl aplikován v objemu 10 ml (4 ml cytosolu + 6 ml Tris/HCl pufru) a nechal se opakovaně protékat kolonou při nízkém průtoku tak, aby se požadované proteiny byly schopny zachytit na koloně. Eluce navázaných proteinů byla poté provedena jednorázovým přídavkem 50 mM Tris/HCl pufru s 2 M NaCl, kdy došlo k uvolnění proteinů z kolony. U výsledného vzorku byla spektrofotometricky ověřena aktivita požadovaných enzymů. 4.1.7.2. Ionexová chromatografie (IEC) K ionexové chromatografii byla použita katexová kolona Mono S HR 5/5. Systém byl ekvilibrován 50 mM citrátovým pufrem o pH = 3,0 a do systému byl aplikován vzorek. Na koloně docházelo k zachytávání částic s kladným nábojem, včetně enzymů tetrathionanhydrolasa a thiosírandehydrogenasa, které v daném pH mají celkově kladný náboj. Poté byly proteiny postupně eluovány v lineárním gradientu 0-2 M NaCl v 50 mM citrátovém pufru o pH = 3,0. TTH a TDH aktivita byla u frakcí ověřována spektrofotometricky. 4.1.8. Ultrafiltrace vzorku Pro další práci se vzorkem bylo třeba jej odsolit a zahustit. Pro tyto účely byla použita nízkoobjemová ultrafiltrační cela Amicon s membránou ULTRACEL propustnou pouze pro molekuly o velikosti menší než 3 kDa. Ve vzorku byla poté spektrofotometricky ověřena TTH a TDH aktivita. 4.1.9. SDS-PAGE Pro SDS-PAGE byly vytvořeny 5% koncentrační gel (celkový objem 5 ml) a 10% separační gel (celkový objem 10 ml) o složení uvedeném v Tabulce 5. 32 Tabulka 5. Složení koncentračního a separačního gelu pro SDS-PAGE 5% koncentrační gel 10% separační gel Látka/roztok Objem (ml) Látka/roztok Objem (ml) 30% akrylamid + BIS 0,85 30% akrylamid + BIS 3,35 1 M Tris/HCl, pH = 6,8 0,625 1,5 M Tris/HCl pH = 8,8 2,5 10% persíran amonný 0,05 10% persíran amonný 0,1 10% SDS 0,05 10% SDS 0,100 TEMED 0,005 TEMED 0,005 H2O 3,4 H2O 3,95 Elektroforetická aparatura (Bio-Rad Mini-Protean®) byla připojena ke zdroji stejnosměrného napětí a byl nastaven konstantní proud 30 mA. Elektroforéza probíhala tak dlouho, dokud zóna bromfenolové modři nedoputovala až ke spodnímu okraji gelu. Gel byl poté obarven pomocí Coomassie Brilliant Blue R250 a skenován na denzitometru Bio-Rad GS-800TM . Vybrané bandy byly vyřezány skalpelem. 4.1.10. LC-MS/MS analýza Pro přípravu vzorku byla použita in-gel digesce s trypsinem (2h, 40 °C, c = 5 ng/µl v hydrogenuhličitan amonném pufru). Analýza proběhla na RSLCnano + Impact II (Bruker Daltonics), data z hmotnostní spektrometrie byla zaznamenána hmotnostním spektrometrem Qq-Time-Of-Flight (QqTOF) s rozlišením přes 50 000. MS/MS data byla kalibrována (podle měrného náboje 1222 m/z) a byla srovnána s databází UniProt_AF_ATCC23270_final. 4.1.11. Manipulace s RNA Celková RNA byla izolována pomocí komerčního kitu TRI Reagent® (Sigma) s následnou purifikací na kolonkách Direct-zol™ RNA MiniPrep (Zymogene Research) dle pokynů výrobce. Odstranění zbytkové DNA bylo provedeno v mezikroku purifikace na kolonkách použitím DNasy I (Thermo Scientific) podle pokynů výrobce. 33 Stanovení koncentrace a čistoty RNA bylo provedeno na přístroji NanoPhotometer. Z koncentrace RNA bylo vypočteno takové ředění, aby výsledná koncentrace vzorků byla u všech stejná, a to 0,1 µg/µl. Vzorky byly naředěny formamidem. 4.1.12. Reverzní transkripce a real-time PCR Relativní exprese genů byla analyzována reverzně-transkripční kvantitativní PCR (RT-qPCR) s použitím fluorescenčního interkalačního barviva SYBR Green v Light Cycler 480 (Roche). Reverzní transkripce byla provedena pomocí kitu ImProm-II Reverse Transcription System (Promega). cDNA byla amplifikována pomocí qPCR s použitím specifických primerů (Tabulka 6) a GoTaq qPCR Master Mixu (Promega) podle pokynů výrobce. Amplifikace probíhala v následujících cyklech: 35 cyklů DNA denaturace při 95 °C po dobu 20 min a nasednutí primerů a prodlužování při teplotě 60 °C po dobu 40 s. Každá analýza probíhala vždy v triplikách. Míra relativní exprese každého genu v daném dni kultivace byla vztažena k vnitřní kontrole, tzv. normalizačnímu faktoru a poté k nultému dni kultivace. Normalizační faktor byl vypočten ze tří konstitutivně se exprimujících genů (rrs, map, alaS). Takto byla zajištěna kvantifikace genové exprese vztahující se k vnitřní kontrole pomocí metody ∆∆CT. 27,28 Jako signifikantní změna byla považována taková změna, která způsobila dvojnásobný nárůst nebo pokles transkriptu, což znamená mimo interval -0,3 až +0,3 na logaritmické škále. 34 Tabulka 6. Seznam specifických primerů použitých při RT-qPCR Gen Lokus Sekvence (5´→ 3´) Reverzní sekvence (5´→ 3´) Referenční geny rrs GTTAGGTCTGTCGTGAAATCCC CTAATCCTGTTTGCTCCCCAC alaS AFE_0934 ACGGTTTACGAGGAGGATGAT TCCAGAAGTTGTCCTTTTCGC map AFE_0925 GTTACCACCGATGAACTGGAC GAATGCCGTGACAGATCACAT RISC geny tetH AFE_0029 CCGTTCGGGAGTAAGACCTAT ATCATCGCTTTCCGCATAGAC sqrA AFE_1792 CGAAGCGTACACGAACTGTAA GGCAGAACCATCTCCTTGATG sqrB AFE_0267 ACCCAAGTGACCATTATCGGC AAGAAACGGTCCAGGGGAATC sat AFE_0539 ATTCCATCGGTTCATGTGCTG TCAGACGCATATCCTGTAGCA hdr operon sdhC AFE_2550 GAGACGGAGTTCGGCATCAA TTGGCGGCAAGAAGATCCAT hdrC1 AFE_2551 TTTACGCATCAGTGCATCGAA ACACCACATTCATGCCCATTT orf AFE_2552 CGATATCATCCTGGCCTACCA TTCTACGCCCAGCAATTTACG hdrA AFE_2553 TTCTCCGAGTACCGATGTGTT GCCTTGACGAACTTGGTTTTG hdrB1 AFE_2554 TACTCCACCTGGTATGACTGC CGACCTTGATCTTGCGATTCA hdrC2 AFE_2555 ATGCAGTCGGCTAAAGATGTG CGGAATGGCTTTACGCAGTAT dsrE AFE_2556 GCAAAATGAAGGCAAAGGGTG AAAGATCAACGGTCATCTGGC tusA AFE_2557 AGAAGACAAAGTACTCGACGC GTTCCAACAGGGGATTCTTGG p11 AFE_2558 ATGGATAAATCGCAACCGCTC GATTCCGCCACGCAAATTAAG hdrB2 AFE_2586 ATGTGGGAACTGGAGAAGGAA GGTTGTTGGTGGGGATCTTTT dox operon p14.3 AFE_0046 TCAAAGAAGCAACCTGTCAGC CTGATTATCCACCAGTGCGTC p21 AFE_0045 CTTTGCGGATCAGAAACCCTT AAATCGTGATAGGTTGGCGTC doxDA AFE_0044 CGGATCATCTGGTCGCTTTTT CGGGTATACAAGCCGACAATC psb AFE_0043 CGTCGCCAGACAGATCAAAAT AAGATCGCTTCCGATTTCCAC tat AFE_0042 ACCAAAGGTAAATGGAAGGCG GCCCTTGGAATGTAAACCCAT tdt AFE_0041 TTCACGGTATTGTTTCTGGGG AGAGATAGTGGGCAACGAGG 35 4.2. Výsledky 4.2.1. Optimalizace sběru adherovaných bakterií pomocí oscilace Optimalizace sběru adherované frakce bakterií byla prováděna v závislosti na frekvenci oscilace, době oscilace a průměru přidaných skleněných mikrokuliček (viz Tabulka 7). Kuličky byly přidávány v množství 0,1 g na 1 ml vzorku. Tabulka 7. Sběr adherovaných bakterií pomocí oscilačního mlýnku. Vzorek 1 Vzorek 2 Vzorek 3 Vzorek 4 Vzorek 5 Vzorek 6 f (Hz) 5 5 5 10 10 5 t (min) 5 5 5 5 10 10 Průměr mikrokuliček (mm) 0,1 – 0,11 0,25 – 0,30 0,45 – 0,50 0,25 – 0,30 0,25 – 0,30 0,25 – 0,30 Počet bakterií v 1 ml 3,6 × 108 7,5 × 108 5,5 × 108 7,5 × 108 7,5 × 108 7,5 × 108 Při získávání adherované frakce bakterií pomocí oscilačního mlýnku nezáleželo příliš na zvolené frekvenci ani době oscilace, jako na průměru použitých skleněných mikrokuliček. Pro odběry adherovaných buněk byla zvolena optimální kombinace oscilace při frekvenci 10 Hz, po dobu 5 min s mikrokuličkami o průměru 0,25 – 0,30 mm. 4.2.2. Optimalizace sběru adherovaných bakterií pomocí ultrasonikace Sonikace adherovaných bakterií byla prováděna v ultrasonické lázni při teplotě 4 °C a frekvenci 40 kHz. Výsledky vícekrokové ultrasonikace s různými časovými intervaly jsou zobrazeny v Tabulce 8. Tabulka 8. Odběr adherovaných bakterií pomocí ultrazvukové lázně. První sonikace (min) 1 5 10 Počet bakterií v 1 ml 0,8 × 107 1,2 × 107 1,5 × 107 Druhá sonikace (min) 1 5 10 Počet bakterií v 1 ml 2,1 × 107 1,6 × 107 1,4 × 107 Celkový počet bakterií v 1 ml 2,9 × 107 2,8 × 107 2,9 × 107 36 Ukázalo se, že při ultrasonikaci po dobu 10 min se z pyritu uvolnilo nejvíce bakterií. Při opakování ultrasonikace u téhož pyritu se uvolnilo ještě jednou stejné množství bakterií. Celkem se dá při dvojím opakování 10 min ultrasonikace získat 2,9 × 107 bakterií, což je ale řádově pořád méně než při použití oscilačního mlýnku. 4.2.3. Poměr planktonických a adherovaných bakterií během kultivace na pyritu Experiment byl proveden s kulturou At. ferrooxidans rostoucí v médiu s obsahem základních solí a pyritu v objemu 200 ml po dobu 14 dní. Bylo zjištěno, že adherovaných bakterií je v roztoku méně než 15 % z celkového počtu bakterií, v dalších experimentech se tedy pracovalo s majoritní frakcí planktonických bakterií (viz Tabulka 9). Tabulka 9. Zastoupení planktonických a adherovaných bakterií At. ferrooxidans při kultivaci na pyritu. Planktonické bakterie Adherované bakterie Počet bakterií v 1 ml 6,1 × 109 0,98 × 109 Podíl z celkového počtu bakterií 86,18 % 13,82 % 4.2.4. Purifikace a identifikace tetrathionanhydrolasy Tetrathionanhydrolasa byla purifikována pomocí ionexové chromatografie, pak byl vzorek pomocí ultrafiltrace odsolen a zahuštěn. Nakonec byl vzorek separován pomocí SDS-PAGE a analyzován LC-MS/MS. 37 4.2.4.1. Ionexová chromatografie pro tetrathionanhydrolasu Chromatogram z ionexové chromatografie je znázorněn na Obr. 5. Na koloně se zachytily proteiny, které byly v další fázi eluovány v lineárním gradientu 0-2 M NaCl. Frakce s TTH aktivitou (50-53) se uvolnily až téměř při 2 M koncentraci NaCl. Obr. 5. Celkový průběh ionexové chromatografie. Modře je znázorněna absorbance v UV oblasti, hnědou je vyznačena vodivost roztoku, světle zelenou barvou je vyznačena koncentrace NaCl. Červená čísla značí čísla frakcí. 4.2.4.2. SDS-PAGE pro TTH byla provedena dohromady Coomassie Briliant Blue R250 ( Obr.6 aktivitou (vpravo) bandy, u nichž byla dále provedena hmotnostní analýza. 4.2.4.3. Byly analyzovány 4 vzorky z tetrathionan nižší intenzitě signálu jen s MS/MS nalezeny. Tabulka Název proteinu Tetrathionan SDS-PAGE pro tetrathionan PAGE pro TTH byla provedena dohromady a výsledný vzorek byl assie Briliant Blue R250 ( 6. SDS-PAGE aktivitou (vpravo). bandy, u nichž byla dále provedena hmotnostní analýza. LC-MS/MS analýza pro tetrathionan Byly analyzovány 4 vzorky z hionanhydrolasa nižší intenzitě signálu jen s MS/MS nalezeny. Tabulka 10. Proteiny identifikované pomocí LC Název proteinu Tetrathionanhydrolasa PAGE pro tetrathionan PAGE pro TTH byla provedena a výsledný vzorek byl assie Briliant Blue R250 ( PAGE společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 50 . Hmotnostní bandy, u nichž byla dále provedena hmotnostní analýza. MS/MS analýza pro tetrathionan Byly analyzovány 4 vzorky z hydrolasa (AFE_0029) nižší intenzitě signálu jen s nesignifikantním skóre. Další komponenty n Proteiny identifikované pomocí LC Název proteinu hydrolasa PAGE pro tetrathionanhydrolasu PAGE pro TTH byla provedena s a výsledný vzorek byl zahuštěn a odsolen pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven assie Briliant Blue R250 (viz Obr. 6 společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 50 Hmotnostní standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v bandy, u nichž byla dále provedena hmotnostní analýza. MS/MS analýza pro tetrathionan Byly analyzovány 4 vzorky z gelu SDS (AFE_0029) jako jediná složka ( nesignifikantním skóre. Další komponenty n Proteiny identifikované pomocí LC Název genu tetH 38 hydrolasu s IEC frakcemi 50 zahuštěn a odsolen pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven 6). společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 50 standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v bandy, u nichž byla dále provedena hmotnostní analýza. MS/MS analýza pro tetrathionanhydrolasu gelu SDS-PAGE, ve všech vzorcích b jako jediná složka ( nesignifikantním skóre. Další komponenty n Proteiny identifikované pomocí LC-MS/MS u frakce s SDS- PAGE (bandy) 1,2,3,4 IEC frakcemi 50-53. Tyto frakce byly smíchány zahuštěn a odsolen pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 50 standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v hydrolasu PAGE, ve všech vzorcích b jako jediná složka (viz Tabulka nesignifikantním skóre. Další komponenty n MS/MS u frakce s tetrath Lokus AFE_0029 53. Tyto frakce byly smíchány zahuštěn a odsolen pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 50-53 s tetrathionan standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v kDa. PAGE, ve všech vzorcích b abulka 10), ve vzorku 4 kvůli nesignifikantním skóre. Další komponenty n tetrathionanhydrolasovou aktivitou. Lokus Počet AMK AFE_0029 499 53. Tyto frakce byly smíchány zahuštěn a odsolen pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven tetrathionanhydrolas kDa. Šipky označují PAGE, ve všech vzorcích byla identifikována ), ve vzorku 4 kvůli nesignifikantním skóre. Další komponenty nebyly pomocí LC hydrolasovou aktivitou. Počet pI hmotnost 9,1 53. Tyto frakce byly smíchány zahuštěn a odsolen pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven hydrolasovou Šipky označují yla identifikována ), ve vzorku 4 kvůli ebyly pomocí LChydrolasovou aktivitou. Mol. hmotnost (kDa) 53 39 4.2.5. Purifikace a identifikace thiosírandehydrogenasy Thiosírandehydrogenasa byla purifikována pomocí afinitní chromatografie s kolonou naplněnou sorbentem s imobilizovaným cytochromem c, poté pomocí ionexové chromatografie na koloně Mono S HR 5/5. Nakonec byl vzorek separován pomocí SDSPAGE a poté identifikován LC-MS/MS. 4.2.5.1. Ionexová chromatografie pro thiosírandehydrogenasu Celková frakce proteinů, která byla získána AC s imobilizovaným cytochromem c byla dále přečištěna pomocí IEC. Chromatogram z ionexové chromatografie je znázorněn na Obr. 7. Na koloně se zachytily proteiny, které byly v další fázi eluovány v lineárním gradientu 0-2 M NaCl. Frakce s TDH aktivitou (22, 23, 24 a 25) se uvolnily až téměř při 2 M koncentraci NaCl (viz Obr. 8). Obr. 7. Celkový průběh ionexové chromatografie. Modře je znázorněna absorbance v UV oblasti, hnědou je vyznačena vodivost roztoku, světle zelenou barvou je vyznačena koncentrace NaCl, tmavě zelenou tlak v systému. Červená čísla značí čísla frakcí. 4.2.5.2. SDS-PAGE byla provedena smíchány, Blue R250 ( Obr. 9 Hmotnostní standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v dále provedena hmotnostní analýza. Obr. 8. Ú SDS-PAGE pro thiosírandehydrogenasu PAGE byla provedena smíchány, zahuštěn Blue R250 (viz Obr. 9 9. SDS-PAGE Hmotnostní standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v dále provedena hmotnostní analýza. Úsek chromatogramu z PAGE pro thiosírandehydrogenasu PAGE byla provedena s zahuštěny a odsolen br. 9). PAGE společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 22 Hmotnostní standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v dále provedena hmotnostní analýza. sek chromatogramu z obrázku 10 PAGE pro thiosírandehydrogenasu ICE frakcemi 22 a odsoleny pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven Cooma společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 22 Hmotnostní standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v dále provedena hmotnostní analýza. 40 obrázku 10. Eluovan PAGE pro thiosírandehydrogenasu ICE frakcemi 22-25. Před provedením SDS pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven Cooma společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 22 Hmotnostní standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v Eluované frakce s Před provedením SDS pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven Cooma společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 22 Hmotnostní standard (vlevo), hodnoty molekulové hmotnosti v kDa. Šipky označují bandy, u nichž byla TDH aktivitou Před provedením SDS pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven Cooma společné IEC frakce, jež vznikla smícháním frakcí 22-25 s TDH aktivitou (vpravo). kDa. Šipky označují bandy, u nichž byla TDH aktivitou (22-25). Před provedením SDS-PAGE byl pomocí ultrafiltrace. Gel byl obarven Coomassie Briliant TDH aktivitou (vpravo). kDa. Šipky označují bandy, u nichž byla PAGE byly frakce ssie Briliant TDH aktivitou (vpravo). kDa. Šipky označují bandy, u nichž byla 41 4.2.5.3. LC-MS/MS analýza pro thiosírandehydrogenasu Bylo analyzováno 5 bandů z SDS-PAGE, vzorek 5 byl rozdělen na tři části, celkem se analyzovalo 7 vzorků. (viz Tabulka 11). Celkem bylo nalezeno 6 proteinů. Tabulka 11. Proteiny identifikované pomocí LC-MS/MS analýzy u frakce s thiosírandehydrogenasovou aktivitou. Název proteinu Název genu SDS- PAGE (bandy) Lokus Počet AMK pI Mol. hmotnost (kDa) Tetrathionanhydrolasa tetH 1,2,3,4,5 AFE_0029 499 9,1 53 ABC transportérový protein 3 AFE_0602 294 8,4 32 Protein s TATsignálním peptidem tat 3,4 AFE_0042 270 7,1 29 Thioredoxin trx 4 AFE_0657 108 4,8 12 30S ribozomální protein S3 rpsC 4 AFE_0333 228 10,3 26 Rusticyanin rus 5 AFE_3146 187 8,8 20 42 4.2.6. Analýza genové exprese pomocí RT-qPCR Probíhaly dvě paralelní kultivace (A, B) bakterie At. ferrooxidans po dobu 15 dnů na pyritu v objemech 10 l. Z obou kultivací byly pravidelně odebírány vzorky buněk, ke stanovení relativní exprese genů byly použity odběry ve dnech 0, 3, 6, 9, 12 z obou kultivací. Průběhy obou kultivací jsou zobrazeny na Obr. 10 – 12. Údaje o průběhu relativní exprese genů jsou zaznamenány v Tabulce 12 a na Obr. 13. Obr. 10. Oxidace Fe3+ iontů v průběhu kultivací A (♦) a B (♦) bakterie At. ferrooxidans na pyritu. Obr. 11. Pokles pH v průběhu kultivací A (♦) a B (♦) bakterie At. ferrooxidans na pyritu. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 KoncentraceFe3+(mmol/l) Doba kultivace (dny) 0 0.5 1 1.5 2 0 2 4 6 8 10 12 14 16 pH Doba kultivace (dny) 43 Obr. 12. Nárůst počtu bakterií v průběhu kultivací A (♦) a B (♦) bakterie At. ferrooxidans na pyritu. 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 0 2 4 6 8 10 12 14 16 107buněk/ml Doba kultivace (dny) 44 Tabulka 12. Relativní exprese (R) vybraných genů účastnících se sirného metabolismu při kultivaci bakterie At. ferrooxidans na pyritu. Jde o průměr hodnot obou kultivací A a B a jejich směrodatné odchylky (s). Doba kultivace Geny 3. den 6. den 9. den 12. den logR ± s logR ± s logR ± s logR ± s RISC geny tetH 0,22 ± 0,07 0,16 ± 0,04 0,26 ± 0,06 0,31 ± 0,05 sqrA 0,08 ± 0,05 0,00 ± 0,06 0,20 ± 0,05 0,11 ± 0,04 sqrB -0,08 ± 0,06 -0,15 ± 0,05 0,09 ± 0,07 -0,01 ± 0,04 sat 0,03 ± 0,08 -0,10 ± 0,07 0,15 ± 0,08 0,02 ± 0,06 hdr operon sdhC 0,16 ± 0,06 0,14 ± 0,06 0,27 ± 0,06 0,21 ± 0,04 hdrC1 -0,07 ± 0,06 -0,12 ± 0,05 0,12 ± 0,06 -0,02 ± 0,05 orf 0,18 ± 0,06 0,09 ± 0,06 0,22 ± 0,05 0,29 ± 0,05 hdrA 0,10 ± 0,05 0,03 ± 0,06 0,22 ± 0,05 0,16 ± 0,04 hdrB1 -0,08 ± 0,07 -0,08 ± 0,06 0,57 ± 0,06 0,52 ± 0,04 hdrC2 0,10 ± 0,09 0,12 ± 0,06 0,24 ± 0,05 0,27 ± 0,05 drsE 0,13 ± 0,07 0,08 ± 0,05 0,26 ± 0,05 0,26 ± 0,06 tusA 0,01 ± 0,07 0,05 ± 0,06 0,13 ± 0,04 0,20 ± 0,05 p11 0,06 ± 0,07 0,03 ± 0,07 0,21 ± 0,07 0,21 ± 0,06 hdrB2 -0,04 ± 0,05 -0,12 ± 0,06 0,07 ± 0,04 -0,03 ± 0,05 dox operon p14.3 -0,02 ± 0,05 -0,19 ± 0,05 0,07 ± 0,05 0,03 ± 0,04 p21 0,02 ± 0,05 -0,12 ± 0,05 0,18 ± 0,05 0,14 ± 0,06 doxDA 0,06 ± 0,05 -0,05 ± 0,05 0,25 ± 0,05 0,18 ± 0,04 psb -0,11 ± 0,06 -0,11 ± 0,06 0,01 ± 0,05 0,00 ± 0,04 tat -0,06 ± 0,06 -0,14 ± 0,06 0,15 ± 0,05 0,10 ± 0,04 tdt 0,07 ± 0,06 0,00 ± 0,07 0,24 ± 0,06 0,19 ± 0,06 45 Obrázek 13. Grafické znázornění relativní exprese vybraných genů účastnících se sirného metabolismu při kultivaci bakterie At. ferrooxidans na pyritu. Vybrané geny Doba kultivace 3. den 6. den 9. den 12. den RISC geny tetH sqrA sqrB sat hdr operon sdhC hdrC1 orf hdrA hdrB1 hdrC2 drsE tusA p11 hdrB2 dox operon p14.3 p21 doxDA psb tat tdt Barevná škála (logR) -0.6 -0.3 0 0.3 0.6 46 4.3. Diskuse Byla provedena purifikace enzymu tetrathionanhydrolasy a thiosírandehydrogenasy pomocí chromatografií a SDS-PAGE. Thiosírandehydrogenasa byla stejným postupem purifikována již dříve. 26 Při IEC docházelo k vymytí obou proteinů TDH i TTH z katexu až při téměř 2 M koncentraci NaCl. Podle toho by se dalo předpokládat, že protein je na koloně držen i jinými než Coulombovskými silami, a protože byla ve vzorku s předpokládanou TDH aktivitou překvapivě detekována i TTH aktivita, je na místě se domnívat, že tyto dva proteiny spolu silně interagují. Po provedení SDS-PAGE a následné LC-MS/MS byla ve vzorku s TTH aktivitou prokázána jako jediná složka tetrathionanhydrolasa, která byla pomocí databáze Uniprot identifikována jako membránový protein kódovaný genem tetH na lokusu AFE_0029. Ke stejnému výsledku došel dříve už i Kanao a kol. (2007), který purifikoval tetrathionanhydrolasu u bakterie At. ferrooxidans ATCC 23270. 29 U vzorku s TDH aktivitou, u kterého byla paralelně naměřena i TTH aktivita, bylo po provedení SDS-PAGE a hmotnostní spektrometrii s následným porovnáním s databází Uniprot určeno více proteinů. Ve všech bandech byla identifikována TTH. Dále byl identifikován periplazmatický ABC transportérový protein, jehož předpokládaná funkce je řízený pohyb iontů kovu do buňky, z buňky nebo mezi buňkami a protein s TAT-signálním peptidem, jehož předpokládaná funkce je transport proteinů skrz membránu do buňky, ale byl už také zmíněn dříve jako součást dox operonu spolu s doxDA genem. 1 Gen doxDA vznikl sloučením genů doxA a doxD, které kódují pojednotky TDH např. u bakterie Acidianus ambivalens. 17 Poměrně nedávno byl purifikován a identifikován protein tvořící tetrathionan u bakterie At. ferrooxidans ATCC 23270. Maximální enzymová aktivita této thiosírandehydrogenasy byla zaznamenána při pH 2,5 a teplotě 70 °C. Gen kódující tento protein byl na lokusu AFE_0042. Jedná se tedy o již zmíněný protein s TAT-signálním peptidem, jehož gen leží v dox operonu. 18 Výsledky purifikace TDH u lokálního kmene At. ferrooxidans CCM 4253 v této práci tak korelují s výsledky v literatuře u kmene ATCC 23270. Protein kódovaný doxDA nebyl analýzou prokázán. Přítomnost TTH ve všech bandech a zjištěná TTH aktivita také u frakcí s TDH aktivitou by mohla indikovat přítomnost většího multienzymového komplexu kódovaného geny dox operonu a genem tetH. Přítomnost podobného multienzymového komplexu není u bakterie At. ferrooxidans výjimkou, u této 47 bakterie byl již prokázán multienzymový komplex kódovaný rus operonem, který spojuje vnější a vnitřní membránu a vytváří tzv. elektronový drát. 11 Tuto hypotézu by bylo třeba ještě ověřit pomocí nedenaturující separační metody, např. za podmínek nativní elektroforezy. Další identifikované proteiny nemají předpokládanou funkci v sirném metabolismu bakterie At. ferrooxidans. Je možné, že interakcí s imobilizovaným cytochromem c a vzájemnými interakcemi dokázaly projít skrz jednotlivé separační kroky. Jsou to proteiny thioredoxin, který pomáhá udržovat v buňce správné redoxní prostředí, 30S ribozomální protein S3, který se účastní translačních procesů a rusticyanin, který přenáší elektrony v metabolismu železa. Podle výsledků analýzy genové exprese lze usoudit, že v průběhu kultivace bakterie At. ferrooxidans na pyritu dochází k nárůstu exprese genů, jež mají vztah k sirnému metabolismu u majoritní planktonické frakce. Signifikantní nárůst exprese genů sirného metabolismu nicméně pozorujeme až v plně aktivní fázi oxidace pyritu, nejdříve po devátém dni kultivace. To může znamenat, že k oxidaci sirných meziproduktů dochází až v aktivní fázi a než k této fázi dojde (tato doba zahrnuje i lag fázi), buňka nejspíš přednostně exprimuje geny účastnící se metabolismu železa a tím přispívá k recyklaci Fe3+ z Fe2+ . Gen tetH kódující protein TTH vykazoval od začátku kultivace vyšší expresi ve srovnání s ostatními geny, i když těsně pod hranicí signifikance. Jako jeden z mála proteinů sirného metabolismu se vůbec nevyskytuje u železitých kultur. Jeho syntéza u železitých buněk oxidujících pyrit probíhá tedy de novo. To by mohlo naznačovat potřebu enzymaticky dále degradovat tetrathionan na různé sirné sloučeniny jako je elementární síra a siřičitan. Vznik tetrathionanu oxidací thiosíranu jako prvního rozpustného sirného meziproduktu oxidace pyritu, je součástí teoretického modelu thiosíranového mechanismu. 30,31 Méně se pak exprimovaly geny dox operonu, jehož součástí je i gen tat, jež kóduje enzym s TDH aktivitou. U dox operonu celkově pozorujeme zvyšující se trend exprese, i když pod hranicí signifikance. Z genů hdr operonu kódující komplex, u něhož se předpokládá, že se účastní oxidace elementární síry, resp. glutathionem aktivované síry, se nejvíce exprimoval gen hdrB v aktivní fázi kultivace na pyritu. Tento gen kóduje jednu z podjednotek heterodisulfidreduktasy a již dříve byla prokázána jeho zvýšená exprese na síře. 13 Z výsledků expresních profilů vybraných genů u železitých kultur At. ferrooxidans během růstu na pyritu je zřejmé, že i u planktonických frakcí dochází k regulaci genů, jež mají vztah k sirnému metabolismu. To je v rozporu s literaturou, podle které se u buněk planktonických při růstu na pyritu více exprimují geny oxidace železa a naopak u adherovaných zase geny 48 oxidace elementární síry a RISC. 5 Tento nesoulad může být výsledkem stanovení exprese v různých časech kultivace. V této práci byly sledovány expresní profily genů sirného metabolismu v průběhu dvou týdnů na rozdíl od výše zmíněné end-point analýzy, která srovnávala expresi po čtyřech dnech kultivace. V citovaném případě navíc nebyla brána v úvahu ani možná lag fáze. Exprese genů sirného metabolismu může být navíc ovlivněna redoxním potenciálem prostředí. V prostředí s nižším redoxním potenciálem na úplném začátku oxidace pyritu může být exprese genů sirného metabolismu potlačena RegBA regulačním systémem, který je v tomto prostředí indukován a pozitivně reguluje pouze geny oxidace železa. V pozdější aktivní fázi oxidace pyritu, kdy se redoxní potenciál zvyšuje, RegBA systém je neaktivní a nedereguluje tak expresi genů sirného metabolismu. 32 49 5. Závěr 1. U bakterií At. ferrooxidans rostoucích na tetrathionanu byl identifikován jediný protein vykazující tetrathionanhydrolasovou aktivitu, kódovaný genem tetH (AFE_0029). 2. Bylo identifikováno více proteinů v purifikované frakci s thiosírandehydrogenasovou aktivitou. Na základě bioinformatické analýzy a srovnáním výsledků s literaturou byl z identifikovaných proteinů vybrán protein s TAT-signálním peptidem kódovaným genem tat (AFE_0042), který s největší pravděpodobností reprezentuje thiosírandehydrogenasu, případně podjednotku s thiosírandehydrogenasovou aktivitou v rámci většího multienzymového komplexu. 3. Analýza genové exprese planktonických bakterií At. ferrooxidans rostoucích na pyritu prokázala nárůst exprese genů s předpokládanou účastí v sirném metabolismu. 4. Geny sirného metabolismu se exprimovaly až v pozdější aktivní fázi oxidace pyritu, což znamená, že v rané fázi kultivace buňka získává energii zejména oxidací železa, případně dominantní mechanismus biooxidace pyritu enzymy sirného metabolismu nezahrnuje. 50 6. Seznam zkratek AC afinitní chromatografie At. Acidithiobacillus BIS methylenbisakrylamid EPS extracelulární polymerní vrstva ESI ionizace pomocí elektrospreje FPLC střednětlaká kapalinová chromatografie GSSG glutathion disulfid HiPIP železo-sirný protein s vysokým redoxním potenciálem IEC ionexová chromatografie LC kapalinová chromatografie MALDI ionizace laserem za přítomnosti matrice MS hmotnostní spektrometrie MS/MS tandemová hmotnostní spektrometrie PAGE polyakrylamidová elektroforeza PCR polymerázová řetězová reakce RISC redukované anorganické sirné sloučeniny RT reverzní transkripce SDS dodecylsíran sodný SQR sulfidchinonreduktasa TDH thiosírandehydrogenasa TEMED tetramethylethylendiamin TOF průletový analyzátor TQO thiosíranchinonoxidoreduktasa TTH tetrathionanhydrolasa 51 7. Seznam literatury 1. Valdés, J. et al. Acidithiobacillus ferrooxidans metabolism: from genome sequence to industrial applications. BMC Genomics 9, 597–597 (2008). 2. Williams, K. P., Kelly, D. P. Proposal for a new class within the phylum Proteobacteria, Acidithiobacillia classis nov., with the type order Acidithiobacillales, and emended description of the class Gammaproteobacteria. Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63, 2901–2906 (2013). 3. Vera, M., Schippers, A., Sand, W. Progress in bioleaching: fundamentals and mechanisms of bacterial metal sulfide oxidation--part A. Appl. Microbiol. Biotechnol. 97, 7529–7541 (2013). 4. Quatrini, R. et al. Insights into the iron and sulfur energetic metabolism of Acidithiobacillus ferrooxidans by microarray transcriptome profiling. Hydrometallurgy 83, 263–272 (2006). 5. Vera, M. et al. Characterization of biofilm formation by the bioleaching acidophilic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans by a microarray transcriptome analysis. Adv. Mater. Res. 71-73, (2009). 6. González, D. et al. Evolution of biofilms during the colonization process of pyrite by Acidithiobacillus thiooxidans. Appl. Microbiol. Biotechnol. 93, 763–775 (2012). 7. Liu, J.-S., Xie, X.-H., Li, B.-M., Dong, Q.-H. Adsorption characteristics of Thiobacillus ferrooxidans on surface of sulfide minerals. J. Cent. South Univ. Technol. Engl. Ed. 12, 671–676 (2005). 8. YU, R. et al. Effect of EPS on adhesion of Acidithiobacillus ferrooxidans on chalcopyrite and pyrite mineral surfaces. Trans. Nonferrous Met. Soc. China 21, 407–412 (2011). 9. Gehrke, T., Telegdi, J., Thierry, D., Sand, W. Importance of extracellular polymeric substances from Thiobacillus ferrooxidans for bioleaching. Appl. Environ. Microbiol. 64, 2743–2747 (1998). 10. Tu, B. et al. Analysis of genes and proteins in Acidithiobacillus ferrooxidans during growth and attachment on pyrite under different conditions. Geomicrobiol. J. 30, 255–267 (2013). 11. Roger, M. et al. Mineral respiration under extreme acidic conditions: from a supramolecular organization to a molecular adaptation in Acidithiobacillus ferrooxidans. Biochem. Soc. Trans. 40, 1324–1329 (2012). 52 12. Cox, J. C., Boxer, D. H. The purification and some properties of rusticyanin, a blue copper protein involved in iron(II) oxidation from Thiobacillus ferrooxidans. Biochem. J. 174, 497–502 (1978). 13. Quatrini, R. et al. Extending the models for iron and sulfur oxidation in the extreme acidophile Acidithiobacillus ferrooxidans. BMC Genomics 10, 394 (2009). 14. Dopson, M., Johnson, D. B. Biodiversity, metabolism and applications of acidophilic sulfurmetabolizing microorganisms. Environ. Microbiol. 14, 2620–2631 (2012). 15. Janiczek, O., Zemanova, J., Mandl, M. Purification and some properties of thiosulfate dehydrogenase from Acidithiobacillus ferrooxidans. Prep. Biochem. Biotechnol. 37, 101–111 (2007). 16. Brasseur, G. et al. Apparent redundancy of electron transfer pathways via bc1 complexes and terminal oxidases in the extremophilic chemolithoautotrophic Acidithiobacillus ferrooxidans. Biochim. Biophys. Acta BBA - Bioenerg. 1656, 114–126 (2004). 17. Müller, F. H. et al. Coupling of the pathway of sulphur oxidation to dioxygen reduction: characterization of a novel membrane-bound thiosulphate:quinone oxidoreductase. Mol. Microbiol. 53, 1147–1160 (2004). 18. Kikumoto, M., Nogami, S., Kanao, T., Takada, J., Kamimura, K. Tetrathionate-forming thiosulfate dehydrogenase from the acidophilic, chemolithoautotrophic bacterium Acidithiobacillus ferrooxidans. Appl. Environ. Microbiol. 79, 113–120 (2013). 19. Sargent, F., Berks, B. C., Palmer, T. Pathfinders and trailblazers: a prokaryotic targeting system for transport of folded proteins. FEMS Microbiol. Lett. 254, 198–207 (2006). 20. Bugaytsova, Z., Lindström, E. B. Localization, purification and properties of a tetrathionate hydrolase from Acidithiobacillus caldus. Eur. J. Biochem. 271, 272–280 (2004). 21. Kanao, T., Kamimura, K., Sugio, T. Identification of a gene encoding a tetrathionate hydrolase in Acidithiobacillus ferrooxidans. J. Biotechnol. 132, 16–22 (2007). 22. Beard, S., Paradela, A., Albar, J. P., Jerez, C. A. Growth of Acidithiobacillus ferrooxidans ATCC 23270 in thiosulfate under oxygen-limiting conditions generates extracellular sulfur globules by means of a secreted tetrathionate hydrolase. Front. Microbiol. 2, (2011). 53 23. Snustad, D. P. et al. Genetika. 2009, (Masarykova univerzita, 2009). 24. Silverman, M. P., Lundgren, D. G. Studies on the chemoautotrophic iron bacterium Ferrobacillus ferrooxidans. J. Bacteriol. 77, 642–647 (1959). 25. Mandl, M., Nováková, O. An ultraviolet spectrophotometric method for the determination of oxidation of iron sulphide minerals by bacteria. Biotechnol. Tech. 7, 573–574 (1993). 26. Janiczek, O., Pokorna, B., Zemanova, J., Mandl, M. Use of immobilized cytochrome c as a ligand for affinity chromatography of thiosulfate dehydrogenase from Acidithiobacillus ferrooxidans. J. Biotechnol. 117, 293–298 (2005). 27. Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Res. 29, e45 (2001). 28. Kucera, J. et al. Ferrous iron oxidation by sulfur-oxidizing Acidithiobacillus ferrooxidans and analysis of the process at the levels of transcription and protein synthesis. A. Van. Leeuw. J. Microb. 103, 905–919 (2013). 29. Kanao, T., Kamimura, K., Sugio, T. Identification of a gene encoding a tetrathionate hydrolase in Acidithiobacillus ferrooxidans. J. Biotechnol. 132, 16–22 (2007). 30. Schippers, A., Jozsa, P., Sand, W. Sulfur chemistry in bacterial leaching of pyrite. Appl. Environ. Microbiol. 62, 3424–3431 (1996). 31. Schippers, A., Sand, W. Bacterial leaching of metal sulfides proceeds by two indirect mechanisms via thiosulfate or via polysulfides and sulfur. Appl. Environ. Microbiol. 65, 319–321 (1999). 32. Ponce, J. S., Moinier, D., Byrne, D., Amouric, A., Bonnefoy, V. Acidithiobacillus ferrooxidans oxidizes ferrous iron before sulfur likely through transcriptional regulation by the global redox responding RegBA signal transducing system. Hydrometallurgy 127–128, 187–194 (2012).