Určování struktury proteinů NMR, CryoEM a krystalografie Tadeáš Zoubek, Eva Pecháčková, Marek Skaličan 1 NMR 2 Trocha historie nikoho nezabije (Krom jejích aktérů...) •30. léta 20. století – Isidor Isaac Rabi – první NMR experimenty v molekulárním paprsku •1944 – Nobelova cena •Po válce – Felix Bloch a Edward Purcell – nezávisle na sobě vylepšují Rabiho přístroj •1949 – chemický posun •1975 – Richard Ernst zavádí frekvenční a fázové kódování a Fourierovu transformaci pro analýzu signálu •1991 Nobelova cena 3 Nukleární magnetická rezonance – není to nebezpečné? •Nukleární – měříme jádra stabilních prvků •Magnetická – máme velký magnet •Rezonance – měříme frekvence jader Jak NMR funguje? •Měřitelná jádra mají určitý magnetický moment •Mimo magnetické pole – celkový nulový magnetický moment •V magnetickém poli – zvýhodnění určitého směru •Excitace → sklopení vektoru o 90° → vypnutí excitačního záření → sběr signálu 5 Jak NMR funguje? • 6 [USEMAP] Dají se měřit všechna jádra? •Ne, jen jádra s nenulovým magnetickým spinem •1H, 31P – běžné a měřitelné izotopy •12C, 14N – běžné, ale neměřitelné – co s tím? •13C, 15N – velmi vzácné •Měří se i jiná jádra? •19F 7 Jak připravit vzorek? •1H •V proteinech přirozeně, měří se ale ve spektrech od 2D výše •31P •Stačí nafosforylovat •13C, 15N •Vzácné •Exprese v minimálním médiu s 13C glukózou a 15N chloridem amonným •Koncentrace 0,05 – 1 mM •Vhodný pufr – 20 mM NaPi, pH 6 •Objem kyvety 300 – 500 μl 8 13C Obsah obrázku stůl Popis byl vytvořen automaticky 9 15N Obsah obrázku stůl Popis byl vytvořen automaticky 10 A co 19F? •19F značené aminokyseliny •V případě vazby na uhlík 19F = 1H •Exprese v auxotrofních bakteriích •Cell-free protein synthesis 11 Spektra •1D •1H – nepoužitelné •31P – studium kinetiky •13C, 15N – nedělají se •2D a vyšší •Korelace jader •Homonukleární (1H) – COSY, TOCSY, INADEQUATE •Heteronukleární (1H, 13C, 15N) – HSQC, CON, CAN •Přes vazby •Přes prostor – NOESY • 12 HSQC 13 CON Obsah obrázku rostlina Popis byl vytvořen automaticky •Optimalizovaný pro IDP a velké proteiny 14 NOESY •Nuclear Overhauser Effect spectroscopy •Měří se vzdálenosti mezi jádry 15 Shrnutí •Výhody •Nativní stav •Rychlost přípravy •Nulové poškození vzorku •Lze zde studovat i IDP •Není limitované velikostí proteinů •Použitelné nejenom pro studium struktury, ale i pro interakce • •Nevýhody •Cena chemikálií pro značení •Časová náročnost přiřazení signálů •Nízká senzitivita •Chemický posun záleží na pH a složení pufru 16 CryoEM 17 Co je CryoEM? •Kryogenní elektronová mikroskopie - výkonná technika ve strukturální biologii, která je schopna poskytovat mapy hustoty makromolekulárních struktur s vysokým rozlišením (1,5 Å) •Jedná se o TEM, která je navržena pro udržování kryogenních teplot v komoře •Dosažení těchto teplot je velice rychlé, aby se zabránilo krystalizaci molekul vody – protein má pak přirozenou strukturu •Cryo-EM se stal oblíbenou metodou pro vědce po celém světě 18 Historie •Poprvé objevena v roce 1968 (TEM) •Pro snížení radiačního poškození byla v roce 1974 vytvořena kryogenní elektronová mikroskopie. •V posledních letech udělala technologie Cryo-EM revoluční pokrok, zejména v analýze jednotlivých částic. •Od roku 2012 - obrovský pokrok v elektronovém detektoru a zpracování obrazu - rozlišení Cryo-EM je nyní srovnatelné s rentgenovou difrakcí jediného krystalu. • 19 •Od 2013 se stala hlavní technikou pro určování proteinové struktury a její použití se dramaticky zvýšilo. •V roce 2017 byla za Cryo-EM udělena Nobelova cena 20 White, J. B. R., Maskell, D. P., Howe, A., Harrow, M., Clare, D. K., Siebert, C. A., Hesketh, E. L., Thompson, R. F. Single Particle Cryo-Electron Microscopy: From Sample to Structure. Jak to funguje? •Elektronový mikroskop vystřelí elektrony rychlostí světla na vzorek, poté kamery zaznamenávají paprsky elektronů (200 kV nebo 300 kV) a určí kombinací promítaných obrazů do 3D struktury daného proteinu 21 https://ccemmp.org/research/what-is-cryo-em/ •Každý snímek je zašuměný a neúplný - desítky nebo stovky tisíc snímků částic jsou zarovnány a zprůměrovány. •Kvalita konečné mapy molekuly závisí na přesnosti, s jakou lze obrazy částic zarovnat - lépe pro větší částice • • • 22 Obsah obrázku mapa Popis se vygeneroval automaticky. Zmrazování vzorku 23 Kazuyoshi Murata, Matthias Wolf, Cryo-electron microscopy for structural analysis of dynamic biological macromolecules •Nosná mřížka (1-2 um) •Vzorek 3-5 ul •Odsátí filtračním papírem •Tloušťka ledu hraje velkou roli •Rychlý ponor do tekutého etanu - zabrání tvorbě krystalů ledu - vitrifikovaný led •Teplota musí zůstat při teplotě kapalného dusíku (-196 °C) Jak odlišit dobrý a špatný vzorek? •Nedostatečně rychlé zmražení - hexagoniální led (a) •Zahřívání vzorku - krychlový led (b) •Při vkládání vzorku do TEM je vzorek vystaven vodní páře - námraza (c) •Kontaminace uvnitř kolony, nízké vakuum – led z leopardí kůže (d) 24 Obsah obrázku hra Popis se vygeneroval automaticky. •Je potřeba zajistit správné nastavení kontrastu - vyšší rozostření zlepšuje kontrast, ale za cenu nížšího rozlišení (e,f) •Vzorky jsou náchylné k radiačnímu poškození - bublinky plynu (g,h) • 25 Obsah obrázku různé Popis se vygeneroval automaticky. Bhella, D. Cryo-electron microscopy: an introduction to the technique, and considerations when working to establish a national facility. Výhody vs. nevýhody •Výhody •Vzorky ve stavu vodného roztoku – nejsou narušeny krystalickou strukturou •Stačí malý objem vzorku •Cryo-EM dokáže rozlišit širokou škálu různých vzorků •Oproti TEM negativnímu barvení nevyžaduje kontrastní činidlo solí těžkých kovů, která může ovlivnit složení biomolekuly •Nevýhody •Nelze dostatečně dobře rozlišit nukleové kyseliny a proteiny menší než 75kDa (kontrast) •Nízký signál v porovnání se šumem •Náročná manipulace se vzorkem •Výpočetně náročná rekonstrukce obrazu - trvá to slouho •Drahá metoda 26 Zhodnocení •I když má Cryo-EM své problémy, je cenným nástrojem v různých biologických oblastech •Stále více se používá i v jiných průmyslových odvětvích, jako je farmacie, zdravotnictví a kosmetika •Protože dokáže překonat řadu omezení, kterým čelí jiné techniky umožnil Cryo-EM vědcům a technikům pozorovat a studovat širokou škálu molekul a jejich struktur •Problémy Cryo-EM jsou stále opravovány aby se stal jedním z nejlepších nástrojů v biologii, medicíně a výzkumu pro určování struktur makromolekul. 27 Krystalografie 28 História ••80. roky 19. storočia - návrh niekoľko kryštalických štruktúr ••1914 – Max von Laue – Nobelová cena za difrakciu RTG žiarenia kryštálom ••1915 - William Lawrence Bragg a William Henry Bragg: Nobelová cena za prvé použitie rentgenovej kryštalografie ••1949- James Batcheller Sumner: Nobelová cena za objav kryštalizácie enzýmov • 29 Ako funguje RTG Kryštalografia ••RTG žiarenie 0.01 – 10 nm ••Najčastejšie používaná λ = 1 Å ( 0.1 nm) ••Žiarenie aplikované na kryštál proteinu ••Vznik difrakčného vzoru ••Podľa elektrónovej hustoty určíme štruktúru proteinu • 30 Ako funguje RTG Kryštalografia 31 A picture containing indoor, white Description automatically generated Diagram Description automatically generated Príprava Kryštálov ••2 najpoužívanejšie metódy tvorby kryštálov • -Metóda visiacej kvapky • -Metóda sediacej kvapky ••Jeden veľký nepoškodený kryštál ••Bežná veľkosť asi 0.1 mm ••Kryštalizácia môže zabrať pár dní až 2 roky • 32 Príprava Kryštálov 33 A picture containing logo Description automatically generated Príprava Kryštálov ••Veľmi ťažké odhadnúť dobré podmienky nukleácie a rastu kryštálov ••Nie vždy sú podmienky nukleácie a rastu kryštálov rovnaké ••Prednosť sa dáva podmienkam rastu kryštálov ••V praxi sa využíva screening – skúšanie sady vzorkov s rôznymi koncentráciami proteinu a soli (NaCl), rôzna teplota, pH... ••Dnes je tento krok automatizovaný • 34 Meranie dát ••Kryštál je namontovaný na goniometer a postupne rotovaný za bombardovania RTG žiarením • -Rotácia musí dosiahnúť 180° • -Pri vysoko symetrických kryštáloch stačí 90° alebo 45° ••Vytvorenie difrakčného vzoru ••Intenzita zaznamenaná fotografickým filmom, plošným detektorom alebo obrazový snímač CCD ••Pretvorenie z 2D vzoru do 3D modelu elektrónovej hustoty pomocou Fourierovej transformácie ••Na správne určenie štruktúry elektrónovej hustoty potrebujeme intenzitu difrakčných bodov a ich fázu • 35 Fázový problém 36 Text, letter Description automatically generated Diagram Description automatically generated Molekulárna náhrada (Molecular replacement) ••Nájdeme podobnú štruktúru proteinu, ktorá bola už určená ( z protein data bank (PDB) ) – fourierovou transformáciou dostaneme difrakčný vzor s fázami ••Snažíme sa nasmerovať určený protein, aby čo najviac sedel nášmu nameranému difrakčnému vzoru ••Matematicky dopočítame fáze nášho proteinu ••Pomocou našich vypočítaných fáz určíme štruktúru elektrónovej hustoty • 37 Ďalšie riešenia fázového problému ••Zakomponovanie tažkých kovov do kryštálu (Multiple isomorphous replacement) ••Ab initio phasing/priame metódy – používané na malých proteinoch ••Anomálny RTG rozptyl ( anomalous x-ray scattering) • 38 39 Záver •Výhody Nevýhody •-Pomerne lacná metóda - Tvorba kryštálov •-Použiteľná pre veľké štruktúry - Fázový problém •-Dostaneme 3D štruktúru - Vzorok musí byť kryštalizovateľný •-Nelimitovaná atomárnou •hmotnosťou • 40