MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BIOCHEMIE PŘÍPRAVA LEKTINU PSL2 Z HRACHU SETÉHO (PISUM SATIVUM) Diplomová práce Bc. Helena Vondrová Vedoucí práce: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D. Brno 2016 Bibliografický záznam Autor: Bc. Helena Vondrová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Název práce: Příprava lektinu PSL2 z hrachu setého (Pisum sativum) Studijní program: Biochemie Studijní obor: Analytická biochemie Vedoucí práce: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D. Akademický rok: 2015/2016 Počet stran: 79 + 23 Klíčová slova: lektiny, PSL2, E. coli, L. tarentolae Bibliografický záznam Autor: Bc. Helena Vondrová Prírodovedecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochémie Názov práce: Príprava lektínu PSL2 z hrachu siateho (Pisum sativum) Študijný program: Biochémia Študijný obor: Analytická biochémia Vedúci práce: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D. Akademický rok: 2015/2016 Počet strán: 79 + 23 Kľúčové slová: lektíny, PSL2, E. coli, L. tarentolae Bibliographic Entry Author: Bc. Helena Vondrová Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Title of Thesis: Preparation of lectin PSL2 from Pisum sativum Degree programme: Biochemistry Field of Study: Analytical Biochemistry Supervisor: prof. RNDr. Michaela Wimmerová, Ph.D. Academic Year: 2015/2016 Number of Pages: 79 + 23 Keywords: lectins, PSL2, E. coli, L. tarentolae Abstrakt Tato diplomová práce je zaměřena na optimalizaci produkce a purifikace hypotetického lektinu PSL2 a na jeho následné strukturně - funkční studie. Lektiny jsou proteiny reverzibilně vázající sacharidy. Mimo jiné se vyznačují i tím, že jsou schopny aglutinovat erytrocyty. Vyskytují se napříč živočišnou, rostlinnou, houbovou a bakteriální říší, včetně prvoků. Díky rozsáhlému výskytu a variabilitě funkcí a vlastností mají lektiny široké využití. Na zisk zmíněného proteinu PSL2 byly využity různé kmeny bakteriálních buněk E. coli, které byly transformovány dvěma druhy DNA konstruktů. První konstrukt byl již dříve připraven v naší laboratoři. Obsahoval gen pro fúzní protein tioredoxín, který sloužil nejen jako protein napomáhající rozpustnosti cílového proteinu PSL2, ale zároveň i jako kotva, pomocí které byl tento rekombinantní protein purifikován. Druhý konstrukt byl navržen a připraven v rámci této práce. Obsahoval gen pro vysoce rozpustný NusA fúzní protein, který sloužil na posun produkce cílového proteinu PSL2 do rozpustné formy. Na purifikaci proteinu PSL2 s Nusa fúzním proteinem byly použity dvě oligohistidínové kotvy, které byly připojeny na N-konec sekvence pro gen psl2. Pomocí takto modifikovaných buněk E. coli prostřednictvím dvou vybraných konstruktů byly optimalizovány podmínky produkce rekombinantního proteinu PSL2. Dále byla provedena optimalizace purifikace proteinu PSL2 pomocí metody FPLC s využitím metaloafinitní chromatografie na Ni-NTA koloně. Protein získaný purifikací byl podroben strukturně - funkčním studiím. Na produkci proteinu PSL2 v eukaryotickým expresním organismu L. tarentolae byly také navrženy a připraveny dva konstrukty. Abstrakt Táto diplomová práca je zameraná na optimalizáciu produkcie a purifikácie hypotetického lektínu PSL2 a na jeho následné štruktúrne - funkčné štúdie. Lektíny sú proteíny reverzibilne viažuce sacharidy. Okrem iného sa vyznačujú aj tým, že sú schopné aglutinovať erytrocyty. Vyskytujú sa naprieč živočíšnou, rastlinnou, hubovou a bakteriálnou ríšou, vrátane prvokov. Vďaka rozsiahlemu výskytu a variabilite funkcií a vlastností majú lektíny široké využitie. Na zisk spomínaného proteínu PSL2 boli využité rôzne kmene bakteriálnych buniek E. coli, ktoré boli transformované dvomi druhmi konštruktov. Prvý konštrukt bol už skôr pripravený v našom laboratóriu. Obsahoval gén pre fúzny proteín tioredoxín, ktorý slúžil nielen ako proteín napomáhajúci rozpustnosti cieľového proteínu PSL2, ale zároveň aj ako kotva, pomocou ktorej bol tento rekombinantný proteín purifikovaný. Druhý konštrukt bol navrhnutý a pripravený v rámci tejto práce. Obsahoval gén pre vysoko rozpustný NusA fúzny proteín, ktorý slúžil na posun produkcie cieľového proteínu PSL2 do rozpustnej formy. Na purifikáciu proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom boli použité dve oligohistidínové kotvy, ktoré boli pripojené na N-koniec sekvencie pre gén psl2. Pomocou takto modifikovaných buniek E. coli prostredníctvom dvoch vybraných konštruktov boli optimalizované podmienky produkcie rekombinantného proteínu PSL2. Ďalej bola vykonaná optimalizácia purifikácie proteínu PSL2 pomocou metódy FPLC s využitím metaloafinitnej chromatografie na Ni-NTA kolóne. Proteín získaný purifikáciou bol podrobený štruktúrne – funkčným štúdiám. Na produkciu proteínu PSL2 v eukaryotickom expresnom organizme L. tarentolae boli tiež navrhnuté a pripravené dva konštrukty. Abstract This thesis is focused on the production optimization and purification of the hypothetical PSL2 lectin and subsequent structural - functional studies. Lectins are proteins reversibly binding carbohydrates. Among other things, they are characterized by the fact that they are able to agglutinate erythrocytes. They are present across animal, plant, fungal and bacterial organisms, including protozoa. Thanks to their major occurence and variability of functions and features, they have wide range of applications. To obtain this PSL2 protein, various strains of E. coli cells were transformed by two kinds of constructs. The first construct was previously prepared in our laboratory. It contained the gene for thioredoxin fusion protein, which is not only conducive to the protein solubility of the target PSL2 protein, but also works as a tag by which the recombinant protein can been purified. A second construct was designed and prepared in this Master´s thesis. It contained the gene for the highly soluble NusA fusion protein, which was used to advance the production of a target PSL2 protein in his soluble form. Two oligohistidine tags on the N-terminal sequence of the psl2 gene were used to purify the PSL2 protein with NusA fusion protein. Conditions for production of the recombinant PSL2 protein were optimized by the E. coli cells modified by the two selected constructs. Further, the optimization of the purification using the method FPLC with metaloaffinity chromatography was performed using Ni-NTA column. The protein obtained by purification was subjected to structural - functional studies. Also, two constructs for production of the PSL2 protein in eukaryotic expression cells L. tarentolae were proposed and prepared. Poďakovanie Na tomto mieste by som sa chcela poďakovať prof. RNDr. Michaele Wimmerovej, Ph.D. za odborné vedenie mojej diplomovej práce, špeciálne Mgr. Eve Dubskej a Mgr. Márii Pokornej za trpezlivosť, pomoc pri vypracovávaní, užitočné rady a dlhé konzultácie. Moja vďaka patrí aj ostatným členom skupiny Glykobiochémie. Ďakujem Vám za každú jednu poskytnutú radu a ochotu diskutovať nad vecami možnými aj nemožnými, za vytvorenie príjemného pracovného kolektívu. V neposlednej rade moje veľké ďakujem patrí rodine a priateľom. Prehlásenie Prehlasujem, že som svoju diplomovú prácu vypracovala samostatne s využitím informačných zdrojov, ktoré sú v práci citované. ................................................. Brno, 16.mája 2016 Bc. Helena Vondrová OBSAH I. ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK..............................................................................12 II. TEORETICKÁ ČASŤ ........................................................................................................14 1. LEKTÍNY.............................................................................................................................14 1.1. História......................................................................................................................14 1.2. Základná charakteristika...........................................................................................14 1.3. Vlastnosti a využitie...................................................................................................15 1.4. Rastlinné lektíny........................................................................................................16 1.5. Lektíny húb a plesní...................................................................................................20 1.6. Živočíšne lektíny........................................................................................................20 1.7. Bakteriálne lektíny.....................................................................................................21 2. EXPRESNÉ SYSTÉMY...........................................................................................................21 2.1. Leishmania tarentolae...............................................................................................21 2.2. Escherichia coli.........................................................................................................24 III. CIELE PRÁCE....................................................................................................................25 IV. PRAKTICKÁ ČASŤ...........................................................................................................26 1. MATERIÁL A METÓDY ........................................................................................................26 1.1. Biologický materiál ...................................................................................................26 1.2. Kultivácia buniek.......................................................................................................27 1.3. Antibiotiká.................................................................................................................29 1.4. Príprava konštruktov pre produkciu proteínu s oligohistidínovou kotvou ...............29 1.5. Transformácia E. coli kompetentných buniek teplotným šokom...............................34 1.6. Transfekcia L. tarentolae pomocou elektroporácie ..................................................36 1.7. Príprava vzoriek na sekvenáciu ................................................................................37 1.8. Test a optimalizácia expresie rekombinantného proteínu PSL2 v bunkách E. coli ..38 1.9. Test rozpustnosti produkovaného proteínu PSL2......................................................39 1.10. SDS-PAGE ................................................................................................................39 1.11. Imunobloting .............................................................................................................40 1.12. Expresia proteínu PSL2 pre purifikáciu....................................................................41 1.13. Purifikácia s využitím metaloafinitnej choromatografie...........................................42 1.14. Dialýza ......................................................................................................................43 1.15. Koncentrovanie proteínu...........................................................................................43 1.16. CD spektroskopia ......................................................................................................43 1.17. Funkčné štúdie hypotetického lektínu PSL2..............................................................44 2. VÝSLEDKY A DISKUSIA ......................................................................................................45 2.1. Príprava konštruktov pre produkciu proteínu s oligohistidínovou kotvou ...............45 2.2. Reštrikčné štiepenie...................................................................................................46 2.3. Transfekcia Leishmania tarentolae...........................................................................51 2.4. Test expresie pripravených konštruktov pre produkciu proteínu PSL2 v E. coli......53 2.5. Test rozpustnosti produkovaného proteínu PSL2......................................................55 2.6. Produkcia proteínu PSL2 pre purifikáciu .................................................................57 2.7. Purifikácia PSL2 s tioredoxínovou kotvou................................................................59 2.8. Imunobloting .............................................................................................................60 2.9. Purifikácia PSL2 s dvomi oligohistidínovými kotvami (N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2) ...........................................................................62 2.10. CD spektroskopia ......................................................................................................72 2.11. Testy aktivity..............................................................................................................72 V. ZÁVER.................................................................................................................................75 VI. SUMMARY..........................................................................................................................76 VII. ZOZNAM POUŽITEJ LITERATÚRY ............................................................................77 VIII.PRÍLOHY............................................................................................................................80 12 I. ZOZNAM POUŽITÝCH SKRATIEK AI autoindukcia ALP alkaline phosphatase (alkalická fosfatáza) APS ammonium persulfate (persíran amónny) BCIP 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate BHI Brain-Heart Infusion médium CD cirkulárny dichroizmus CI cytoplasmic insoluble (nerozpustná časť bunkového lyzátu) Con A concanavalin A (konkanavalín A) CRD carbohydrate recognition domain (doména rozpoznávajúca sacharid) CS cytoplasmic soluble (rozpustná časť bunkového lyzátu) dH2O destilovaná voda DMF N,N-dimetylformamid dNTP deoxyribonukleotidy E. coli Escherichia coli EDTA ethylen diamin tetraacetyl acid (kyselina etyléndiamíntetraoctová) FPLC Fast Protein Liquid Chromatography (rýchla proteínová kvapalinová chromatografia) GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenáza) GalNAc N-acetyl-galakózamín GlcNAc N-acetyl-glukozamín IDA iminodiacetic acid (kyselina iminodioctová) IPTG isopropyl-β-D-thiogalaktosid (izopropyl-β-D-tiogalaktozid) kb kilo base (kilo báz) LB lysogeny broth (Luria – Bertani médium) L. tarentolae Leishmania tarentolae MCS Multi-cloning site (multiklonovacie miesto konštruktu) MS Mass spectrometry (hmotnostná spektrometria) Neu5Ac N-Acetylneuraminic acid (kyselina N-acetylneuramínová) Ni-NTA Nickel - nitrilotriacetic acid (kyselina nitrilotrioctová viažuca ión niklu) NTC Nourseothricin 13 OD600 optická denzita pri 600 nm ON over night (cez noc) pb páry báz PBS fosfátový pufer s chloridom sodným PHYRE Protein Homology/analogY Recognition Engine (nástroj rozpoznávajúci proteínovú homológiu a analógiu) PCR Polymerase Chain Reaction (polymerázová reťazová reakcia) RE reštrikčné enzýmy rpm rounds per minute (otáčok za minútu) SDS Sodium Dodecyl Sulfate (dodecylsulfát sodný) SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate - PolyAcrylamide Gel Electrophoresis (elektroforéza v polyakrylamidovom géli v prítomnosti SDS) SOC Super Optimal Catabolite médium SPR Surface Plasmon Resonance (povrchová plazmónová rezonancia) TET tetracyklín TB Terrific Broth médium TC Tissue Culture (tkanivová kultúra) TBE Tris-Borát EDTA TEMED N,N,N’,N’-tetrametyletyléndiamín ThioHP His-Patch Thioredoxín (tioredoxínová histidínová kotva) Tris Tris(hydroxymetyl)aminometán WGA lektín - Wheat Germ Agglutinin 6xHIS oligohistidínová kotva 14 II.TEORETICKÁ ČASŤ 1. Lektíny 1.1. História Prvá zmienka o lektínoch siaha až do roku 1888. Pod názvom hemaglutiníny – proteíny schopné aglutinovať červené krvinky - sa o nich prvý raz zmienil Peter Hermann Stillmark vo svojej doktorskej práci na terajšej Tartuskej univerzite (Estónsko). Neskôr zo semena ricínového stromu Ricinus communis vyizoloval vysoko toxický hemaglutinín, ktorý pomenoval ricín. Ten sa stal následne komerčne dostupný ako modelový antigén (spolu s arbínom) pre imunologické štúdie. Ricín sa dostal do povedomia širokej verejnosti až v roku 1978 vďaka povestne známej „dáždnikovej vražde“ opozičného bulharského spisovateľa v exile Georgiho Markova. Následne sa uvažovalo o použití ricínu ako biologickej zbrane počas prvej svetovej vojny, cez 2. svetovú vojnu bola vyvinutá aj bomba, testovaná na britských vojakoch, ale nikdy nebola použitá na vojnové účely (1). Po prvý raz bol hemaglutinín v čistej forme získaný až v roku 1919. Jamesom B. Sumnerom z Cornellovej univerzity (Ithaca, New York) ho vyizoloval vo forme kryštalického proteínu z rastliny Canavalia ensiformis a dal mu meno konkanavalín A (ConA) (1). Avšak, až v roku 1936 Sumner a Howell opísali lektínovú špecifickosť voči cukrom, kedy ako možný dôsledok hemaglutinácie ConA uviedli jeho reakciu s cukornými zložkami na povrchu erytrocytov (2). Až v roku 1954 došlo k návrhu zmeny názvu Boydom a Shapleighom vďaka schopnosti aglutinínov rozlišovať rôzne krvné skupiny. Názov „lektíny“ je odvedený od latinského slova legere, čo v preklade znamená vybrať si. Tento termín bol neskôr zovšeobecnený na všetky cukor-špecifické aglutiníny neimunitného pôvodu bez ohľadu na ich zdroj alebo špecifickosť krvných skupín (3). 1.2. Základná charakteristika Lektíny sú rozmanitou skupinou proteínov, ktoré vysoko špecificky a reverzibilne viažu sacharidové štruktúry. Štruktúrou sa najviac podobajú enzýmom aj napriek tomu, že nevykazujú enzymatickú aktivitu (4). Lektíny zvyčajne obsahujú 2 a viac väzbových miest pre sacharidové jednotky, niektoré lektíny avšak vytvárajú oligomérne štruktúry s mnohonásobnými väzbovými miestami. Sacharid 15 s lektínom sú prepojené množstvom relatívne slabých interakcií (5). Patria sem hlavne vodíkové väzby, ktoré sú tvorené buď medzi –NH skupinou a hydroxylovou skupinou sacharidu, alebo medzi proteínovým atómom kyslíku a hydroxylovou skupinou sacharidu. Ďalej hydrofóbne interakcie a van der Waalsové sily. Nakoľko sú pomerne slabé, sú pomerne často sa vyskytujúce a zároveň môžu podstatne podporovať stabilitu väzby. Zriedkavo sa na väzbe medzi lektínom a sacharidom podieľajú aj iónové interakcie (6). Spočiatku boli lektíny považované za výhradne rastlinné komponenty. V súčasnej dobe sú lektíny známe u všetkých druhov organizmov od vírusov a baktérií cez huby a plesne až po rastliny a živočíchy vrátane človeka (3). 1.3. Vlastnosti a využitie Záujem o lektíny, od ich opísania postupne stúpal, práve vďaka ich všestrannému využitiu. Sú výbornými nástrojmi na detekciu, izoláciu a charakterizáciu glykokonjugátov, hlavne glykoproteínov pomocou tzv. „lectin microarray“. Je to relatívne nová metóda, určená na rýchlu a citlivú analýzu glykánov, ktorá využíva imobilizované lektíny na dobre definovanom substráte. Metóda môže byť vhodná pre testovanie kvality pri bio-technologickej produkcii rekombinantných ľudských proteínových liečiv (napr. protilátok) (7). Využitie nachádzajú aj pri preskúmaní zmien, ktoré nastávajú na povrchu buniek počas fyziologických a patologických procesov. Lektíny slúžia aj ako histochemické a cytochemické reagencie na detekciu glykokonjugátov v tkanivových rezoch, alebo na mapovanie neurónových ciest. Taktiež sa využívajú na separáciu glykoproteínov, glykopeptidov a oligosacharidov pomocou afinitnej chromatografie. Počas tohto procese sú imobilizované lektíny kovalentne naviazané na agarózu, siliku alebo na inú polymérnu stacionárnu fázu (7). Svoje využitie nachádzajú rovnako pri rozoznávaní druhov krvných skupín (1). Najskôr boli využívané ako jednoduché rozpoznávacie nástroje na identifikáciu zhubných nádorov. Vo viacerých výskumoch sa však preukázalo, že lektíny majú aj protinádorový účinok. Ng a kol. vo svojom článku opisuje hemaglutinín izolovaný z plodníc húb Flammulina velutipes, ktorý je schopný inhibovať proliferáciu leukemických buniek L1210 (8, 9). Teraz sa lektíny využívajú ako dôležité diagnostické a prognostické biomarkery nádorových ochorení. V dnešnej dobe sú skúmané aj ako potenciálne prostriedky na liečbu zhubných nádorov. Napriek ich antiproliferačnej aktivite sa lektíny môžu zúčastňovať komplikovaných mechanizmov, ako je zapájanie sa do rôznych signálnych dráh apoptózy a autofágie, čím sa ich využitie v tejto oblasti komplikuje (9). 16 1.4. Rastlinné lektíny Rastlinné lektíny sú najdlhšie známou skupinou tohto druhu. Sú považované za veľmi komplexnú a heterogénnu skupinu proteínov ako z biochemického a fyzikálneho hľadiska, tak aj z pohľadu štruktúry a sekvencie (10). Najčastejší výskyt je v semenách, ale nachádzajú sa aj v ostatných častiach rastlín, ako napríklad v listoch, luskoch, koreňoch alebo kôre. Ich syntéza prebieha na ribozómoch endolazmatického retikula (6). V roku 1972 mal konkanavalín A ako prvý lektín, stanovenú primárnu sekvenciu aj 3D štruktúru pomocou X-ray kryštalografie (11). Delenie rastlinných lektínov Prvá klasifikácia rastlinných lektínov bola založená na glykánových sekvenciách, ku ktorým sa lektíny viazali najlepšie. Neskôr, ďalšie možné delenie tejto rozmanit339ej skupiny priniesol Kurt Drickamer v roku 1988, kedy opísal CRD (carbohydrate-recognition domain) lektínov. Hovorí, že cukor viažuca aktivita lektínov je daná len určitou časťou peptidu (12). Lektíny rastlín sa s ohľadom na ich štruktúru delia do 4 hlavných skupín. Merolektíny, sú lektíny, ktoré majú iba jednu CRD doménu. Hololektíny, sú skupinou zahŕňajúcou lektíny, ktoré majú 2 alebo mnohoznačné CRD. Chymerolektíny, sú proteíny, obsahujúce viac CRD, majúcich ďalšiu biologickú alebo katalytickú aktivitu závislú na odlišnej doméne ako je CRD. Štvrtou veľkou skupinou rastlinných lektínov sú superlektíny, ktoré majú tiež aspoň 2 CRD, ale od hololektínov sa líšia tým, že dokážu rozpoznať štruktúrne nesúvisiace cukry (13). Lektíny rastlín môžu byť delené do skupín aj podľa ďalších vlastností, pričom jedným z najbežnejších kritérií pre ich klasifikáciu je rozdelenie podľa monosacharidu (N-acetylneuramínová kyselina, D-manóza, N-acetyl-D-galaktozamín, D-galaktóza, N-acetyl-Dglukozamín, L-fukóza), ku ktorému prejavujú najvyššiu afinitu (6). Obranná funkcia lektínov Prítomnosť lektínov v rôznych častiach rastlinných tkanív zvýrazňuje ich dôležitosť. Jednou z možností ich funkcie je fyziologická konkrétne, hrajú obrannú rolu proti fytopatogénnym mikoorganizmom, hmyzu a bylinožravcom. V skutočnosti bolo preukázané, že rastlinné lektíny sú cytotoxické, fungitoxické, s insekticídnymi vlastnosťami (in vitro aj in vivo) a zároveň sú vysoko toxické pre vyššie živočíchy (12). Lektíny boli navrhnuté ako sľubné prostriedky proti hmyzím škodcom. Rôzne plodiny vrátane pšenice, tabaku a zemiakov boli úspešne geneticky modifikované. Takýto postup 17 by mohol byť prínosný pre ochranu hospodárskych rastlín proti škodcom (4). Všeobecne, produkcia transgénnych rastlín s vloženou rezistenciou proti hmyzu a herbicídom vo veľkom rozsahu nevykazuje negatívny vplyv na životné prostredie. Naopak, používanie takýchto rastlín by mohlo zlepšiť dopad na človeka a jeho životné prostredie, keďže ich pestovaním sa znižuje výroba a používanie insekticídov a herbicídov (13). Zaujímavým kandidátom pre takéto poľnohospodárske vylepšovanie je lektín z hrachu, ktorý ma extrémne nízku toxicitu pre cicavčie bunky (14). Je, však, potreba bližšieho štúdia tejto problematiky. Dôležité je zodpovedať, čo konkrétne spôsobujú lektíny v strave alebo aký efekt spôsobujú transgénne rastliny s pridanou vlastnosťou rezistencie voči hmyzu pri styku so škodcami priamo na poli (10). Rezistencia lektínov voči proteolýze, ich prítomnosť v potrave a ich negatívny účinok pri požití Jednou z najzaujímavejších a najdôležitejších vlastností rastlinných lektínov, ktorá súvisí aj s vyššie opísanou obrannou funkciou, je ich vysoká schopnosť stability pri pôsobení pH v širokom rozsahu. Sú odolné voči pôsobeniu proteáz a celkovo voči proteolýze aj v prípade, že sa už nenachádzajú v ich prirodzenom prostredí (10). Toto tvrdenie potvrdzuje aj zistenie, že biologicky neporušený lektín WGA bol detegovaný vo výtoku zachytenom po ileostómii a vo fekálnych zbierkach ľudských subjektov konzumujúcich stravu s obsahom pšeničných klíčkov (15). Orálne užívané rastlinné lektíny môžu zostávať v čiastočne nestrávenej podobe v čreve. Je vysoká pravdepodobnosť, že tam sa viažu na širokú škálu bunkových membrán a glykokonjugátov črevnej sliznice, čo môže viesť k rôznym škodlivým účinkom na samotnej sliznici, ako aj k poškodeniu črevnej bakteriálnej flóry alebo iných vnútorných orgánov (13). Mnoho lektínov spôsobuje priamo alebo nepriamo hlboké morfologické alebo fyziologické zmeny v tenkom čreve. Takéto zmeny spôsobujú zníženie funkcie absorpcie živín. Zaujímavý je preto fakt opísaný v štúdii Riosa a kol., kde sa uvádza, že ďaleko menšie množstvo lektínov prežíva in vitro liečbu s proteolytickými enzýmami (10). Preto sa predpokladá, že lektíny môžu byť taktiež chránené pred proteolytickou degradáciou počas prechádzania cez črevo. Také lektíny sú potom schopné väzby na epiteliálne alebo lumen časti čreva. Lektíny, ktoré nie sú schopné sa viazať na črevnú mukózu nespôsobujú konzumentovi žiadne alebo len veľmi malé tráviace problémy. Škodlivé účinky lektínov tak definitívne závisia od ich stupňa rezistencie voči proteolytickej degradácii. Pri in vitro reakciách 18 môže byť takáto ochrana slabo kompenzovaná pomocou prídavku glukózy alebo Ca2+ a Mn2+ iónov do reakčnej zmesi (10). Rastliny všeobecne obsahujú veľké množstvo výživných látok a stopových prvkov, ktoré sú dôležité a nevyhnutné pre mikroorganizmy, hlísty, hmyz a iné bezstavovce, ako aj pre vyššie živočíchy. Ľudská potrava je závislá na rastlinách a živočíchoch. Samotné zvieratá a ich prežitie je zase závislé na rastlinách (15). Lektíny sa vyskytujú aj v najčastejšie jedlých plodinách ako sú rajčiny, zemiaky, fazuľa, hrášok, mrkva, čerešne, višne, sójové bôby, ryža, kukurica, cesnak, arašidy, huby, avokádo, červená repa, pór, kapusta, korenie, orechy, čaj alebo korenie. V skutočnosti, prítomnosť významného množstva aktívnych lektínov v čerstvých alebo spracovaných potravinách a nedostatok informovanosti verejnosti ohľadom škodlivých účinkoch diétnych lektínov na črevá a zdravie viedli k početným otravám jedlom. V minulosti bola väčšina hospitalizácii kvôli nedostatočne tepelne upraveným fazuliam, ktoré obsahujú lektíny. Hospitalizovaní ľudia mali rôzne tráviace problémy ako napr. nadúvanie, nevoľnosť, zvracanie alebo hnačky (10, (16). Lektíny v hrachu siatom Lektíny sa v hrachu vyskytujú v lusku, v hojnom počte v semenách, ako aj v koreňoch a obranných štruktúrach tkanív. V semenách zastupujú úlohu zásobných a obranných proteínov. Ich funkcia v koreňoch nie je úplne jasná, uvažuje sa o ich úlohe v tvorbe uzlíkov (14). PSL (Pisum sativum lektín) je metaloproteín zložený z dvoch monomérov. Monomérne jednotky tohto proteínu sú veľmi podobné lektínu ConA nielen sekundárnou a terciárnou štruktúrou, ale aj výskytom cys-peptidových väzieb a špecifickosťou voči Ca2+ a Mn2+ iónom. Rozdiely medzi týmito lektínmi sú hlavne v oblasti slučiek a na koncoch reťazcov (11, 18) (obrázok č. 1). Boli predpovedané sekvencie 4 vegetatívnych homológov lektínu PSL a to Blec 1-4. Vegetatívne lektíny hrachu sú transkribované prinajmenšom 4 členmi vysoko konzervovanej multigénovej rodiny, ktorej členovia sú iba vzdialene príbuzní na základe aminokyselinovej sekvencie k lektínu PSL, ktorý obsahuje iba jeden transkribovaný gén. Všetky 4 homológy sú si sekvenčne veľmi podobné, tri z nich sú považované za nefunkčné gény. Blec 1 je iba v 38 % identický s PSL. Naopak, Blec 1 je sekvenčne identický s lektínom, študovaným v tejto práci, ktorý dostal pracovný názov PSL2. Polypeptid Blec 1 obsahuje 265 aminokyselín s predpokladanou molekulovou hmotnosťou 27,6 kDa (11,19). PSL je špecifický pre väzbu manózy a glukózy. Toto sacharid viažuce miesto je zobrazené v štrbine na vrchu molekuly (Obrázok č. 2). Táto vlastnosť nie je opísaná u Blec 1, 19 ale pri porovnaní štruktúr týchto 2 lektínov je možné pozorovať podobnú štrbinu vykazujúcu aktivitu pre väzbu cukrov (18). Obrázok č. 1: Stereo páry monomérov lektínu PSL (vrchná dvojica) a lektínu ConA (spodná dvojica) zobrazujúce pozíciu pre ligandy Ca2+ a Mn2+ iónov (krúžky) v kov viažucej slučke; koncové číslované časti reťazcov znázorňujú miesto pre proteínové spájanie; prevzaté a upravené z (11) Obrázok č. 2: porovnanie známej štruktúry PSL monoméru (vľavo) s predikovanou štruktúrou Blec 1 (vpravo); žlté β-isty, fialové α-helixy; S je oblať viažuca cukor; prevzaté a upravené z (18) 20 1.5. Lektíny húb a plesní Do tejto veľkej skupiny eukaryotických organizmov spadajú nielen huby samotné, ale aj kvasinky a plesne (19). Skoršie výskumy boli zamerané hlavne na ich základnú charakteristiku, možnú funkciu alebo na opis ich sacharidovej špecifickosti. V poslednej dekáde boli niektoré lektíny húb klonované, sekvenované a kryštalizované. Tieto lektíny sa v posledných rokoch začali intenzívnejšie skúmať kvôli ich protinádorovej, antiproliferačnej a imunomodulačnej aktivite (20). Napriek tomu, že sa lektíny našli v rôznych častiach húb (bazídie, konídie, mycélium), izolujú sa hlavne z plodníc (21). Lektíny húb dokážu ovplyvňovať vzťahy medzi hubami a ostatnými organizmami. To, či bude vzťah medzi nimi parazitický alebo symbiotický určujú práve lektíny. Predpokladá sa, že majú dôležitú funkciu aj pri dormancii, raste a morfogenéze húb. Taktiež sa podieľajú na prechode parazitickej huby do hostiteľa, ako aj na tvorbe mycélia (22). 1.6. Živočíšne lektíny Živočíšne lektíny boli nájdené u rôznych živočíchov nevylučujúc človeka. Nevýhodou je, že je z nich vždy extrémne nízky výťažok. Hlavnou funkciou živočíšnych lektínov je sprostredkovanie kontaktu medzi bunkou, ktorá má na svojom povrchu lektíny s povrchom druhej bunky nesúcej na svojom povrchu sacharidy (23). Lektíny živočíchov sa delia do 3 veľkých skupín. Jednou z nich je C typ (Obrázok č. 3 (vyžaduje vápnik)). Takéto lektíny majú zvyčajne okolo 120 aminokyselín. Vápenatý ión je v tomto prípade sprostredkovateľ spojenia medzi lektínom a sacharidom pomocou priamych interakcií cez sacharid-hydroxylové interakcie. Do druhej skupiny sa radia lektíny vyžadujúce voľné tioly. Táto skupina sa nazýva skupina S typ lektínov. Neskôr bola premenovaná na galektíny, pretože nie všetky lektíny boli tiol-dependentné. Medzitým boli osekvenované 2 lektíny rozpoznávajúce manózu-6-fosfát. Vo výsledku boli tieto lektíny zaradené do skupiny typu P-lektínov, pretože napriek ich homológii boli odlišné od ostatných. Lektíny boli časom viac skúmané a ich odlišnosti ich postupne delili do menších skupín (5, 24). 21 Obrázok č. 3: Štruktúra živočíšneho lektínu s CRD doménou typu C; Ca2+ ión sprostredkúva viazanie D-manózového zvyšku na lektín; obe glutamátové zvyšky proteínu sa viažu k vápenatému iónu a na cukor, zatiaľ čo ostatné proteínové reťazce tvoria vodíkové väzby s ďalšími hydroxylovými skupinami sacharidu; prevzaté a upravené (4) 1.7. Bakteriálne lektíny V roku 1977 Ofek a kol. navrhli, že proteíny na povrchu baktérií s vlastnosťami podobnými lektínom môžu slúžiť ako adhezíny, ktoré viažu organizmy k živočíšnym bunkám. Neskôr bolo zistené, že E. coli nesie na svojom povrchu fimbrie typu 1, ktoré sú špecifické pre manózu a sú schopné aglutinovať červené krvinky (25). Napríklad vysokovirulentný typ fimbrií 1 uropatogenetickej E. coli nesie na svojom povrchu α-D-manozid špecifický lektín nazývaný FimH, ktorý je potrebný pri adhezívnom procese (26). Fimbrie typu 1 sú zvlášť efektívnymi adhezívnymi nástrojmi baktérií na sprostredkovanie kolonizácie na rôznych biotických a abiotických povrchoch. Sú uniformne rozložené na bakteriálnom povrchu buniek o dĺžke v rozmedzí 0,1 µm až 2,0 µm a šírke 7 nm (27). Adhezíny mnohých patogénnych baktérií sú momentálne pokladané za potenciálne lektíny, aj keď bolo dokázané, že niektoré členy rodu Staphylococcus alebo Streptococcus produkujú adhezíny, ktoré nemajú lektínovú aktivitu a zároveň ostatné členy rovnakého rodu sú známe tým, že majú na svojom povrchu lektíny s adhezívnou funkciou (28). 2. Expresné systémy 2.1. Leishmania tarentolae Trypanozómy patria do radu významných parazitických prvokov triedy bičíkovcov, do ktorého spadá rod Leishmania. Trypanozómy sú organizmy radiace sa medzi jedny 22 z najstarších skupín eukaryot, s veľkým počtom kmeňov, ktoré sú extra- a intracelulárnymi parazitmi človeka alebo hospodárskych zvierat. Spôsobujú vysilenie alebo smrteľné choroby. Vďaka svojmu všeobecne známemu vplyvu na zdravie je táto skupina jednou z najlepšie študovaných eukaryotických skupín po kvasniciach (29). Organizmy rodu Leishmania sú intracelulárnymi parazitmi, vyskytujú sa v 88 krajinách na piatich kontinentoch. Ich výskyt nebol zaznamenaný v Austrálii a južnej Ázii, pretože pre komáre je tam príliš teplé a vlhké podnebie. Leishmánie u ľudí spôsobujú chorobu nazývanú leishmanióza (30). Leishmania tarentolae ako expresný organizmus Bunky Leishmania ako expresné organizmy sú bohaté na glykoproteíny, ktoré môžu prispieť k celkovému výťažku proteínu o viac ako 10 % (31). Je predpoklad, že práve kvôli ich parazitickému životnému štýlu, oligosacharidové štruktúry ich glykoproteínov sú často podobné tým cicavčím glykoproteínom, ktoré zahŕňajú komplexný typ oligosacharidov s α-viazanými galaktózovými a fukózovými zvyškami (Obrázok č. 4) (32). Bunky Leishmánia dokážu produkovať homogénne N-glykány. Táto vlastnosť je prospešná hlavne vtedy, keď sa rekombinantné proteíny plánujú použiť na funkčné štúdie alebo farmaceutické účely. Jeho ďalšími jedinečnými vlastnosťami sú nielen ľahká genetická Obrázok č. 4: Porovnanie exprimovaných oligosacharidových štruktúr u glykoproteínov v bunkách Leishmania s oligosacharidmi glykoproteínov u cicavcov, resp. kvasiniek alebo hmyzu; prevzaté a upravené z 32 23 manipulácia, ale aj priamočiara adaptácia na produkciu vo veľkom meradle alebo nízke nutričné požiadavky (31). Životný cyklus Leishmania sú parazitickými prvokmi s komplexným životným cyklom zahŕňajúcim dve vývojové formy. Tieto formy predstavujú adaptáciu na meniace sa podmienky životného prostredia, s ktorými sa parazity stretávajú v rámci svojich hostiteľov. Jedným z nich je cicavčí hostiteľ, ku ktorému sú patogénne a druhým hostiteľom je prenášač, ktorým je dvojkrídlovec (pakomárikovitý – Flebotomidae). Leishmania sa množia v bodavom hmyze v podobe extracelulárne a aktívne sa pohybujúcich bičíkatých buniek známych ako promastigóty (Obrázok č. 5), ktoré sú umiestnené hlavne v tráviacom trakte prenášača. Keď sa dostanú do cicavčieho hostiteľa počas satia krvi dvojkrídlym hmyzom, promastygóty sú pohltené neutrofilmi. Parazity uvoľnené neutrofilmi sú následne pohltené makrofágmi a v nich sa diferencujú do amastygótnej formy, ktorá už je bez bičíka. Následne sa amastygóty množia v bunkách ako aj v makrofágoch v rôznych tkanivách. V tejto fáze je možné určiť diagnózu. Cyklus sa následne opakuje požitím infikovaných makrofágov v krvi hostiteľa dvojkrídlym prenášačom (29). Obrázok č. 5: Životný cyklus Leishmania tarentolae; prevzaté a upravené z (23) 24 Prejavy choroby Existujú rôzne druhy buniek Leishmania, ktoré vyvolávajú rôzne typy nákaz. Evidovaných je 21 druhov a podľa prejavu choroby sa delia do 2 skupín: povrchové alebo útrobné. Na začiatku sa leishmanióza prejavuje ako nachladnutie. Neskôr sa k nim postupne pridávajú prejavy ako vysoké teploty, vredy na koži alebo slizniciach, zväčšenie pečene a sleziny alebo strata hmotnosti (30). Napríklad choroba spôsobená Leishmania tropica tvorí tzv. suché vredy, ktoré vyúsťujú do kožných znetvorenín. Tie sú väčšinou lokalizované na tvári alebo na miestach nezahalených odevom. Rozšírená je okolo Stredozemného mora (India, stredná Ázia, južná Európa, severná Afrika, Blízky Východ). Inkubačná doba môže byť 2-3 týždne, ale aj niekoľko mesiacov alebo rokov. Veľmi závažne ochorenie (môže končiť smrťou) spôsobuje aj Leishmania brasiliensis. Zapríčiňuje kožnú a mukokutánnu leishmaniózu rozšírenú v Južnej Amerike. Začína ako kožné ochorenie a potom metastázuje do nasofaryngeálnych slizníc a iných miest na tvári (33). 2.2. Escherichia coli Tieto jednoduché prokaryotické organizmy sa používajú ako modelové pre štúdium mnohých základných aspektov biochémie a molekulárnej biológie. Sú to gram negatívne, fakultatívne anaeróbne tyčinkové baktérie, ktoré sa bežne vyskytujú v čreve teplokrvných živočíchov (34). Väčšina kmeňov je neškodných, niektoré však môžu spôsobiť vážnu potravinovú otravu. Ich genóm sa skladá približne z 4,6 miliónov párov báz a kóduje okolo 4000 rôznych proteínov. Pre porovnanie – ľudský genóm je približne 1000-krát zložitejší a kóduje približne 100 tisíc rôznych proteínov. Experimenty sú uľahčované skutočnosťou, že E. coli sa množí pri optimálnych podmienkach každých 20 – 60 minút (35). Existujú rôzne geneticky modifikované E. coli využívané pri laboratórnych experimentoch. Najviac obľúbený a často využívaný spôsob produkcie proteínov pomocou E. coli je T7 systém. Tento systém funguje tak, že expresný konštrukt obsahujúci gén záujmu klonovaný v smere transkripcie promótoru T7 je vnesený do T7 expresných buniek. Tie nesú chromozomálnu kópiu fágového génu pre T7 RNA polymerázu, ktorý je kontrolovaný lac promótorom. Po pridaní induktoru je T7 RNA polymeráza produkovaná a zameriava sa na transkripciu génu záujmu (36). 25 III.CIELE PRÁCE  Vloženie sekvencií N-6xHis_TEV_psl2 a TEV_psl2 nesúcich gén pre hypotetický lektín PSL2 do konštruktov pET-44b a pLEXSY_IE_chlecherry4  Test expresie génu pre produkciu rekombinantného proteínu PSL2 v bakteriálnych bunkách  Optimalizácia produkcie rekombinantného proteínu PSL2 v bunkách E. coli v dostatočnom množstve  Purifikácia a ďalšie štruktúrne - funkčné štúdie hypotetického lektínu PSL2 26 IV.PRAKTICKÁ ČASŤ 1. Materiál a metódy 1.1. Biologický materiál Práca s bunkami prebiehala vždy v lamilárnom boxe (Thermo Electon Industries) v sterilnom prostredí. Počas práce boli používané viaceré kmene geneticky modifikovaných bakteriálnych buniek druhu Escherichia coli, ako aj kmeň geneticky modifikovaných eukaryotických buniek druhu Leishmania tarentolae. Modifikované konštrukty s vloženým génom pre hypotetický lektín PSL2 boli uchovávané v bakteriálnych bunkách E. coli, konkrétne v jej neexpresných kmeňoch XL1 (Stratagene) a DH5α (Invitrogen). Avšak expresia génu v bakteriálnych bunkách bola vykonávaná v expresných kmeňoch buniek E. coli: Arctic Express(DE3)RIL (Stratagene), BL21(DE3) (Stratagene), Tuner(DE3) (Novagen), Rosetta2(DE3)pLysSRare (Novagen). V tejto práci bol najskôr používaný konštrukt pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2. (Invitrogen) Konštrukt obsahuje fúzny proteín tioredoxín o molekulovej hmotnosti 12 kDa, napomáhajúci rozpustnosti cieľového proteínu PSL2. Tioredoxín je zároveň modifikovaný, tak aby vytvoril kotvu s vysokou afinitou k dvojmocným katiónom (napr.Ni2+ ), ktorá slúži na rýchlu purifikáciu rekombinantného proteínu PSL2 s využitím metaloafinitnej chromatografie. Spomínaný konštrukt bol používaný na produkciu proteínu v bunkách E. coli, ako aj na preklonovanie sekvencie TEV_psl2 do konštruktu pET-44b. Konštrukt pET-44b (Novagen) je predurčený na produkciu cieľového proteínu s fúznym proteínom NusTagTM , ktorý zvyšuje rozpustnosť fúznych proteínových partnerov, keďže samotný NusA proteín je vysoko rozpustný. Konštrukt pET-44b na svojom N-konci obsahuje aj oligohistidínovú kotvu, ktorá rovnako ako tioredoxín, slúži na purifikáciu cieľového proteínu pomocou metaloafinitnej chromatografie. Zo zásobných neexpresných buniek z predchádzajúcej práce, na ktorú bolo nadväzované, bol vyizolovaný modifikovaný konštrukt pMAT_N-6xHis_TEV_psl2 (Life Technologies). Ten bol použitý na preklonovanie sekvencie N-6xHis_TEV_psl2 do týchto dvoch druhov konštruktov: pET-44b, ktorý slúžil na produkciu PSL2 v E. coli, a do konštruktu pLEXSY_IE_blecherry4 (Jena Bioscience), ktorý bol modifikovaný pre tvorbu PSL2 v bunkách Leishmania tarentolae. 27 1.2. Kultivácia buniek Práca s bunkami a médiami vždy prebiehala v sterilnom prostredí s využitím lamilárneho boxu (Thermo Electon Industries). Bunky sa v laboratórnych podmienkach kultivujú v sterilných médiách s dostatočným obsahom živín na ich rast a rýchle množenie. Boli pridávané aj antibiotiká pre zisk čistej kultúry. V tejto práci boli používané 4 druhy médií. Pri transformácii buniek bolo používané vysoko výživné SOC médium, kultivácia všetkých kmeňov buniek E. coli prebiehala v tekutom LB médiu. Naopak, v prípade potreby kultivácie buniek staticky bolo použité pevné médium. Pre kultúru L. tarentolae bolo použité tekuté LEXSY BHI médium, ako aj pevné – agarové médium. Médiá pre kultiváciu buniek E. coli 1.2.1.1. Tekuté LB médium Kultivácia E. coli prebiehala v komerčne dostupnom LB médiu od firmy FORMEDIUM (20 g LB low salt zmesi o zložení: 5 g NaCl, 10 g trypton, 5 g kvasnicový extrakt na 1 l média). Pripravené bolo rozpustením 20 g zmesi v 1 l destilovanej vody. Pomocou 10 M NaOH bolo upravené pH na hodnotu 7,30. Jednotlivé kolónie buniek boli zaočkované do tekutého LB média s prídavkom antibiotík (Tabuľka č. 3) a kultivované pri teplote 37 ˚C (200 rpm) do OD600 = 0,4 – 0,6. Pokiaľ sa v tomto médiu kultivovali zásobné kompetentné bunky E. coli s konštruktom pLEXSY_IE_blecherry4, bolo potrebné dbať na zníženú teplotu kultivácie buniek, a to 30 ˚C s prídavkom ampicilínu (výsledné koncentrácie v Tabuľke č. 3). 1.2.1.2. Pevné LB médium Pevné médium bolo používané na kultiváciu buniek staticky na zisk jednotlivých kolónií. Jeho príprava spočívala v pridaní agaru (50 mg.ml-1 ) do tekutého LB média. Kultivačné Petriho misky s bunkami boli uložené do temperovanej miestnosti do 2.dňa (37 ˚C). 1.2.1.3. SOC médium SOC je vysoko výživné médium, používané na regeneráciu buniek po transformácii (2% trypton; 0,5% Yeast Extract; 8,5 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 10 mM MgCl2; 10 mM glukóza; pH 7,0). Médium bolo prefiltrované cez sterilný filter (0,22 µm) a skladované pri teplote -20 ˚C. 28 Médiá pre kultiváciu buniek L. tarentolae 1.2.1.4. Tekuté BHI médium Pre kultiváciu buniek L. tarentolae LEXSY T7-TR bolo použité tekuté BHI médium (zloženie v Tabuľke č. 1). Bunky boli zaočkované do spomínaného média zo zásobných glycerolových bakteriálnych konzerv. Kultivácia vždy prebiehala v špeciálnych ventilovaných TC bankách v tme pri 26 ˚C. Do každého kultivačného média je nutné pridávať Hemín. Na začiatok, pre rozrastenie kultúry sa bunky kultivujú staticky (naležato). Pasáž prebiehala 2x týždenne do sterilného BHI média s prídavkami, a to v pondelok v pomere 1:50 a v piatok v pomere 1:20. Pre udržanie T7 polymerázy a TET represorových génov v genóme hostiteľských buniek LEXSY T7-TR treba vždy pridať do média LEXSY Hygro a LEXSY NTC (do výslednej koncentrácie podľa Tabuľky č. 1). Tabuľka č. 1: Zloženie BHI média pre kultiváciu L. tarentolae Komponenty Množstvo Výsledná koncentrácia Sterilné BHI médium 10 ml 37 g.l-1 NTC LEXSY 10 µl 100 µg.ml-1 Hygro LEXSY 10 µl 100 µg.ml-1 Pen-Strep 50 µl 10 000 U penicilín G sodnej soli, 10 000 µg.ml-1 streptomycín sulfátu v 0,85% fyziologickom roztoku Hemín 23 µl 0,25% prasací Hemín v 50% trietanolamíne 1.2.1.5. Agarové misky Na vysiatie buniek po transfekcii a získanie kolónií boli použité agarové misky, ktoré sa vždy pripravujú čerstvé. Zloženie a množstvo komponent pre prípravu 4 misiek je opísané v Tabuľke č.2. Tabuľka č. 2: Zloženie agarových misiek pre kultiváciu L. tarentolae, typ skladovania jednotlivých komponent Zložka Množstvo Skladovanie Sterilné 2x LEXSY BHI (74 g/l) 35 ml Laboratórna teplota Neaktívne fetálne teľacie sérum (FCS) 10 ml -20 ˚C 1 M HEPES, pH 7,4 4 ml 4 ˚C Pen-Strep 1 ml -20 ˚C Hemín (0,25% v 50% trietanolamíne) 0,23 ml 4 ˚C LEXSY NTC 0,1 ml -20 ˚C LEXSY Hygro 0,1 ml -20 ˚C LEXSY Bleo 0,1 ml -20 ˚C Sterilný 2% agar 50 ml Laboratórna teplota 29 Pre prípravu pevného média bolo potrebné jednotlivé zložky temperovať, aby médium nestuhlo predčasne. Sterilné 2x LEXSY BHI médium bolo vyhriate na 37 ˚C, sterilný 2% agar bol temperovaný pri 55 ˚C. Ostatné zložky média boli zmiešané zvlášť v 50 ml skúmavke. Následne boli všetky časti média zmiešané dohromady a prenesené do Petriho misiek v objeme 25 ml a boli ponechané uschnúť. 1.3. Antibiotiká Počas experimentov boli do kultivačných médií pridávané antibiotiká v závislosti na rezistencii jednotlivých buniek a konštruktov (pozri Tabuľku č. 3). Tabuľka č. 3: Rezistencia buniek a konštruktov *Selekčné antibiotikum, používané až pri klonálnej selekcii po transfekcii buniek LEXSY T7-TR 1.4. Príprava konštruktov pre produkciu proteínu s oligohistidínovými kotvami Pre prípravu prvých dvoch konštruktov na produkciu proteínu PSL2 s oligohistidínovou kotvou buď na N-konci alebo C-konci v bunkách E. coli bol použitý konštrukt pET-44b (pozri Tabuľku č. 4). Tento konštrukt obsahuje gén pre NusA fúzny proteín, ktorý má napomáhať rozpustnosti cieľového proteínu. Pre prípravu ďalších dvoch konštruktov (jeden s produkciou cieľového proteínu PSL2 do média a druhý s produkciou proteínu PSL2 do bunky) s oligohistidínovou kotvou len Bunky Antibiotikum Výsledná koncentrácia Konštrukt Antibiotikum Výsledná koncentrácia E. coli BL21(DE3) - - pRSET A ampicilín 100 µg.ml-1 E. coli Tuner(DE3) - E. coli Rosetta2(DE3) pLysRare Chloramfeni- kol 34 µg.ml-1 pET-44b ampicilín 100 µg.ml-1 E. coli ArcticExpress (DE3)RIL streptomycín 75 µg.ml-1 pMAT ampicilín 100 µg.ml-1 DH5α - XL1 - L. tarentolae LEXSY T7-TR LEXSY NTC 100 µg.ml-1 pLEXSY _IE_ blecherry4 ampicilín LEXSY Bleo* 100 µg.ml-1 100 µg.ml-1 LEXSY Hygro 100 µg.ml-1 Pen-Strep Pozri Tabuľku č. 1 30 na N-konci v bunkách L. tarentolae bol použitý konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4 (pozri Tabuľku č. 4). Prvý konštrukt bol navrhnutý tak, aby mal na N-konci 2 oligohistidínové kotvy. Zdrojovým konštruktom na zisk inzertu N-6xHis_TEV_psl2 bol konštrukt skôr pripravený v našom laboratóriu (pMAT_N-6xHis_TEV_psl2). Proteín získaný pomocou expresie takto pripraveného DNA konštruktu pET-44b s dvomi oligohistídínovými kotvami na N-konci je v podobe: N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2. Druhý konštrukt pET-44b pre expresiu v E. coli bol navrhnutý s jednou oligohistidínovou kotvou na C-konci. Zdrojovým konštruktom pre zisk inzertu TEV_psl2 bol konštrukt pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 (tiež pripravený skôr v našom laboratóriu), pričom stop kodón génu psl2 bol počas PCR reakcie nahradený kodónom, zodpovedajúcim alanínu. Výsledný proteín získaný pomocou expresie takto pripraveného DNA konštruktu pET-44b s oligohistídínovou kotvou na C-konci je v podobe: TEV_psl2_6xHis. Ďalšie dva konštrukty boli navrhnuté pre expresiu génu pre proteín PSL2 v L. tarentolae. Pre tieto bunky je určený špecifický konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4, ktorý bol použitý na prípravu konštruktov pre produkciu proteínu PSL2 s oligohistidínovou kotvou na N-konci. Konštrukty boli navrhnuté tak, aby sa proteín produkoval buď do média (so signálnou sekvenciou) alebo do bunky (bez signálnej sekvencie). Zdrojovým konštruktom pre zisk inzertu pre konštrukty pLEXSY_IE_blecherry4 s expresiou génu do média ako aj do bunky bol už spomínaný konštrukt pMAT_N-6xHis_TEV_psl2. Tabuľka č. 4: Použité primery a teploty nasadania primerov pre zisk génu psl2 (inzertu) z jednotlivých východiskových konštruktov Templátová DNA pre PCR s vyznačeným cieľovým inzertom Veľkosť inzertu psl2 Čísla primerov Teplota nasadania primerov Cieľový konštrukt pMAT_N-6xHis_TEV_psl2 768 pb 622 623 55 ˚C pET-44b_ N-6xHis_NusA pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 (bez 6xHis) 738 pb 624 625 58 ˚C pET-44b_NusA_ C-6xHis pMAT_N-6xHis_TEV_psl2 768 pb 626 627 58 ˚C pLEXSY_IE_blecherry4 so sign. sekvenciou pMAT_N-6xHis_TEV_psl2 768 pb 628 629 58 ˚C pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie 31 Izolácia plazmidov Na izoláciu DNA plazmidov bola použitá prerastená kultúra buniek. Tá bola získaná kultiváciou neexpresných buniek E. coli s požadovaným zdrojovým alebo cieľovým plazmidom cez noc v 5 ml tekutého LB média s prídavkom príslušného antibiotika. Samotná izolácia bola vykonaná pomocou komerčne dodávanej súpravy GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit (SigmaAldrich), postupovalo sa podľa priloženého manuálu (37). Rozdiel oproti manuálu bol v poslednom kroku. Elúcia konštruktu bola realizovaná pomocou 50 µl sterilnej MiliQ vody zahriatej na 50 ˚C. Pre izoláciu cieľového nízkokópiového cieľového plazmidu pET-44b bol použitý NucleoBond® Xtra Midi Kit (MACHEREY-NAGEL). Koncentrácia plazmidov bola zmeraná spektrofotometricky (NanoDrop ND-1000, Coleman Technologies) pri vlnovej dĺžke 260 nm. Plazmidy boli uchovávané pri -20 ˚C. Polymerázová reťazová reakcia (PCR) Na amplifikáciu cieľového génu psl2 s oligohistidínovými kotvami na N- alebo C-konci bola použitá PCR reakcia. Ako templáty boli použité sekvencie DNA konštruktov pMAT_N-6xHis_TEV_psl2 a pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2. Zloženie PCR zmesi je opísané v Tabuľke č.5, pričom boli použité priame a reverzné primery (Tabuľka č. 6) podľa aktuálne štiepeného templátu. Postup navrhovania jednotlivých primerov je opísaný v prílohe č.1. Priebeh reakcie je uvedený v Tabuľke č. 7. Na vizualizáciu PCR produktov bola použitá elektroforéza s 1% agarózovým gélom. Hlavný produkt o predpokladanej veľkosti cca 800 pb bol vyizolovaný a prečistený pomocou kitu MinElute Reaction Cleanup (Qiagen). Spektrofotometricky (NanoDrop ND-1000, Coleman Technologies) bola zmeraná čistota PCR produktov pri pomere absorbancií 260/280 nm a 260/230 nm; pri vlnovej dĺžke 260 nm bola zmeraná koncentrácia DNA. PCR produkty boli uchovávané pri -20 ˚C. Tabuľka č. 5: Zloženie PCR zmesi Zložka Množstvo 10x konc.reakčný pufer pre PfuUltra I polymerázu (Agilent Technologies) 5 µl dNTP mix (10 mM) (NEB) 1 µl Templát 100 ng Priamy primer (1 µM) 1 µl Reverzný primer (1 µM) 1 µl PfuUltra I polymeráza (2,5 U.µl-1 ) (Agilent Technologies) 1 µl Sterilná MiliQ H2O Doplnené do 50 µl 32 Tabuľka č. 6: Navrhnuté primery pre prípravu jednotlivých konštruktov obsahujúcich gén psl2 s N- a C-oligohistidínovými kotvami a použité restriktázy (Sigma-Aldrich) Výsledný konštrukt Primer č. Primer Sekvencia Restriktáza pET-44b N-6xHis_NusA- 6xHisTag_TEV_psl2 622 priamy 5´GCCACTAGTATGAAATTC CATCACCATCACC 3´ SpeI 623 reverzný 5´CGCTCGAGTTAAAC CTGGGAAACGATG 3´ XhoI pET-44b NusA_TEV_psl2_ C-6xHis 624 priamy 5´CGGACTAGTCCGGAGAA CCTGTATTTTCAGTCC 3´ SpeI 625 reverzný 5´CCAAGCTTCGCAACC TGGGAAACGATG 3´ HindIII pLEXSY-IE-blecherry4 B_N-6xHis_TEV_psl2 bez sign. sekv.(do bunky) 626 priamy 5´CGCCCATGGATGAAAT TCCATCACCATCGAG 3´ NcoI 627 reverzný 5´TTGCGGCCGCAATTAAA CCTGGGAAACGATG 3´ NotI pLEXSY-IE-blecherry4 M_N-6xHis_TEV_psl2 so sign. sekv.(do média) 628 priamy 5´GGCTCTAGACAGATGAAATT CCATCACCATCACGAG 3´ XbaI 629 reverzný 5´AAATATGCGGCCGCTATAA ATTAAACCTGGGAAACGATG 3´ NotI Tabuľka č. 7: Priebeh PCR reakcie Gradientová PCR Pre amplifikáciu génu psl2 z konštruktu pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 (bez 6xHis) určeného pre konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie bolo nutné spraviť gradientovú PCR aby sa zistila optimálna teplota nasadania primerov (postup je uvedený v Tabuľke č.8). Tabuľka č. 8: Priebeh reakcie gradientovej PCR PCR Počet cyklov Teplota Čas Počiatočná denaturácia 1x 95 ˚C 2 min Denaturácia 30x 95 ˚C 30 s Nasadanie primerov 50,5 - 65 ˚C 30 s Syntéza nových reťazcov 72 ˚C 1 min Záverečné predlžovanie 1x 72 ˚C 10 min PCR Počet cyklov Teplota Čas Počiatočná denaturácia 1x 95 ˚C 2 min Denaturácia 30x 95 ˚C 30 s Nasadanie primerov 50 - 60 ˚C 45 s Syntéza nových reťazcov 72 ˚C 1 min Záverečné predlžovanie 1x 72 ˚C 10 min 33 Reštrikčné štiepenie Cieľové konštrukty ako aj PCR produkty boli štiepené pomocou reštrikčných endonukleáz (restriktáz). Kvôli dosiahnutiu dostatočnej koncentrácie a čistoty DNA pre následnú ligáciu sa pracovalo vždy naraz s 3 – 4 alikvótmi PCR produktov/ štiepených cieľových vektorov. Počas práce boli použité viaceré restriktázy – pozri Tabuľku č. 6. V Tabuľke č. 9 je uvedené zloženie reakčnej zmesi. Po zmiešaní jednotlivých komponent bol na samotné štiepenie použitý termoblok AccuBlock (Labnet) pri 37 °C po dobu 3 hodín. Nasledujúcim krokom bola denaturácie endonukleáz pri 60 ˚C po dobu 30 min. Tabuľka č. 9: Zloženie zmesi na reštrikčné štiepenie Reagencia Množstvo Konštrukt alebo inzert - obsahujúci gén psl2 (max.20 µg) x µg 10x koncentračný CutSmart pufer (NEB) 5 µl Reštrikčná endonukleáza I (20 000 U.ml-1 ) 5 U/ 1 µg DNA Reštrikčná endonukleáza II (20 000 U.ml-1 ) 5 U/ 1 µg DNA Sterilná MiliQ H2O Doplnenie do 50 µl Elektroforéza na agarózovom géli Na separáciu a vizualizáciu PCR produktov a produktov reštrikčného štiepenia bola použitá agarózová elektroforéza s 1% agarózovými gélmi. Gély boli pripravené zmiešaním 0,5 g agarózy v 50 ml 1x koncentrovanom TBE pufri (0,089 M kyselina boritá, 31 0,098 M Tris/ HCl, 0,002 M EDTA), ktorý bol používaný aj ako elektródový pufer. Po rozvarení a čiastočnom ochladení zmesi bolo do gélu pridaných 2,5 µl fluorescenčného farbiva GelRed (Biotium). Gél bol ešte za tepla naliaty do aparatúry H1-SET (Scie-Plas). Do jamiek stuhnutého gélu boli nanesené vzorky DNA o objeme 10 – 50 µl, ktoré boli predtým zmiešané s nanášacím pufrom (Loading Dye 5×, Qiagen) v pomere 4:1. Na každý gél bol nanesený jeden zo štandardov: 100 bp DNA Ladder (NEB) alebo 1 kb DNA Ladder (NEB) o objeme 5 µl. Výsledky elektroforézy (napätie 80 V, 45 minút) boli vizualizované pomocou stolného transluminátora (TCP-20.M, Vilber Lourmat). Separovaná DNA bola vyrezaná a extrahovaná z gélu do roztoku s využitím komerčnej súpravy MinEluteTM Gel Extraction Kit (QIAGEN). Rozdiel oproti návodu bol v poslednom kroku. Kvôli zisku koncentrovanejšej DNA boli vzorky eluované dvakrát 10 µl sterilnej MiliQ vody ohriatej na 50 °C. Koncentrácia (absorbancia pri 260 nm) a čistota DNA (pomer absorbancií 260/280 nm a 260/ 230 nm) boli zmerané na spektrofotometri. 34 Ligácia Získané fragmenty DNA (cieľového plazmidu a inzertu) ošetrené rovnakou dvojicou reštrikčných endonukleáz boli pomocou T4 DNA ligázy opätovne spojené v procese ligácie, ktorá prebiehala 16 hod pri 16 ˚C. Zloženie ligačnej zmesi je uvedené v Tabuľke č. 10. Množstvo pridaného konštruktu bolo vždy rovnaké, zatiaľ čo množstvo génu psl2 (vo vzorci ako inzert) záležalo na použitom pomere (p = 1:1, 1:3, 3:1, 4:1). Samotné množstvo inzertu bolo vypočítané pomocou vzorca: inzert [ng] = p*plazmid [ng] * inzert [pb] /plazmid [ng] Tabuľka č. 10: Zloženie ligačnej zmesi Reagencia Množstvo Štiepený plazmid 200 ng Štiepený inzert (gén psl2) x ng 10× konc. reakčný pufer pro T4 DNA ligázu (NEB) 1 µl T4 DNA ligáza (400 000 U·ml-1 ) (NEB) 0,5 µl Sterilná MiliQ voda Doplnené do 10 µl 1.5. Transformácia E. coli kompetentných buniek teplotným šokom Do kompetentných buniek E. coli bola transformovaná buď ligačná zmes alebo pripravený konštrukt nasledovne. Ku 100 µl kompetentných buniek bolo pridaných 100 ng konštruktu (alebo ku 50 µl kompetentných buniek 10 µl ligačnej zmesi). Zmes bola 30 minút inkubovaná na ľade, potom nasledovalo zahriatie zmesi na 42 °C po dobu 45 sekúnd a jej opätovné schladenie na ľade po dobu 2 minút. Potom bol k zmesi pridaný 1 ml SOC média bez antibiotika. Bunky boli regenerované 1 hodinu pri 37 °C, 200 rpm. Na centrifugáciu bola použitá stolná centrifúga (Hettich Mikro 20) za podmienok 5 min/10 000 rpm. Vzniknutý bunkový pelet bol rozsuspendovaný v 100 µl supernatantu a zmes bola vysiata na agarové misky s príslušným antibiotikom. Nasledovala kultivácia pri 37 °C cez noc. Na tvorbu zásobných buniek obsahujúcich konštrukt po transformácii boli odškrabnuté kolónie a zaočkované do 5 ml tekutého LB média s príslušným antibiotikom. Zmes bola kultivovaná pri 37 ˚C 200 rpm do OD600 ~ 0,5. Následne bolo k 800 µl bunečnej kultúry pridaných 200 µl 80% sterilného glycerolu. Bunky boli uložené na -80 ˚C. 35 Kontrola úspešnosti transformácie E. coli PCR kolónií Táto metóda slúži na rýchle overenie prítomnosti konštruktu v kolóniách buniek E. coli po transformácii, keďže nie je nutná kultivácia buniek a izolácia konštruktu. Časť kolónie po transformácii bola pridaná do PCR zmesi (pozri Tabuľku č. 12). Počas práce boli používané priame primery (Sigma-Aldrich) zobrazené v Tabuľke č. 11. PCR kolónií bola uskutočnená na termocykléri (Thermal Cycler GenePro, Bioer) za podmienok zobrazených v Tabuľke č. 13. Produkty PCR reakcie kolónií boli vizualizované pomocou agarózovej gélovej elektroforézy. Tabuľka č. 11: Primery pre konštrukty pLEXSY_IE_blecherry4 (Jena Bioscience) a pET-44b (Sigma- Aldrich) Číslo primeru Typ primeru Konštrukt Sekvencia primeru 638 P1442 priamy pLEXSY_IE_blecherry4 CCGACTGCAACAAGGTGTAG 639 A264 reverzný pLEXSY_IE_blecherry4 CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG 266 Coli down reverzný pET-44b TTTCACTTCTGAGTTCGGCATGG 402 T7 priamy primer pET-44b TAATACGACTCACTATAGGGG Tabuľka č. 12: Zloženie reakčnej zmesi PCR kolónií Reagencia Množstvo 10x koncentrovaný Paq5000 pufor (Agilent Technologies) 5 µl 10 mM dNTPs (SERVA) 1 µl 10 µM priamy primer 1 µl 10 µM reverzný primer 1 µl Paq5000 DNA polymeráza (5000 U.ml⁻¹) (Agilent Technologies) 0,5 µl Sterilná voda (MiliQ) 41,5 µl Tabuľka č. 13: Priebeh reakcie PCR kolónií PCR kolónií Počet cyklov Teplota Čas Počiatočná denaturácia 1x 95 ˚C 5 min Denaturácia 30x 95 ˚C 20 s Nasadanie primerov 55 ˚C 20 s Syntéza nových reťazcov 72 ˚C 30 s Záverečné predlžovanie 1x 72 ˚C 5 min 36 Kontrolné reštrikčné štiepenie Pre kontrolu úspešnosti transformácie bola použitá kultúra, ktorá zostala po vytvorení zásobných buniek ponechaná prerásť cez noc pri 37 ˚C, 200 rpm. Na ďalší deň z nej bol izolovaný konštrukt pomocou kitu u GenEluteTM Plasmid Miniprep Kit (Sigma-Aldrich). Reakčná zmes (zloženie v Tabuľke č. 14) bola štiepená pri 37 ˚C po dobu 3 hodín (XP cycler, Bioer). Produkty štiepenia boli vizualizované pomocou agarózovej elektroforézy použitím 1% gélu. Tabuľka č. 14: Zloženie reakčnej zmesi pre kontrolné reštrikčné štiepenie Reagencia Množstvo Konštrukt (100 µg.µl-1 ) 5 µl NEBuffer CutSmart (NEB Biolabs) 10x koncentrovaný 1 µl Reštrikčná endonukleáza I (20 000 U.ml-1 ) 0,4 µl Reštrikčná endonukleáza II (20 000 U.ml-1 ) 0,4 µl Sterilná voda (MiliQ) 3,2 µl Celkový objem 10 µl 1.6. Transfekcia L. tarentolae pomocou elektroporácie Pre efektívnu transfekciu bola kultúra hostiteľských buniek kmeňa T7-TR viackrát pasážovaná do 10 ml čerstvého média. Pasážovanie vždy prebiehalo 2x týždenne v pomere 1:20 a 1:50.  V prvý deň ráno pred samotnou transfekciou boli bunky pasážované v pomere 1:20 do 10 ml LEXSY BHI média, ktoré obsahovalo prídavok Hemínu, LEXSY NTC, LEXSY Hygro, Pen-Strep (do výslednej koncentrácie pozri Tabuľku č.1).  Kultúra bola inkubovaná (tma, 26˚C) v TC banke nastojato po dobu 3 dní (do večera).  Večer v 3.deň bola preočkovaná kultúra v pomere 1:10 do 10 ml do rovnakého čerstvého média a banka bola ponechaná naležato ďalšie 2 dni (tma, 26˚C).  Po uplynutí 2 dní bola zmeraná optická denzita kultúry a bunky boli sledované pod optickým mikroskopom pri 17 °C (mikroskop IX81 s digitálnou kamerou DP72 (Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan) pomocou programu CellSens Dimension).  Pre úspešnú elektroporáciu by mali byť bunky vitálne a v tvare kvapky.  Bunky boli stočené (3 min, 2000 g) a bolo odpipetovaných 6 ml supernatantu.  Vo zvyšku média boli bunky rozsuspendované jemným poklepaním a uložené na ľade po dobu 10 min.  Medzitým boli na ľade pripravené vzorky s DNA o objeme 1 - 10 ug vo vode (MiliQ) v maximálnom objeme 50 µl. 37  Predchladené bunky v objeme 350 µl boli pridané do mikroskúmaviek s DNA a celý objem bol prenesený do elektroporačných kyviet na ľade. Boli použité elektroporačné kyvety (d = 4 mm).  Elektroporácia prebiehala za podmienok podľa protokolu (Tabuľka č. 15) (Bio-Rad Gene-Pulser-Xcell Electroporation System w/ Shock-Pod CE Module 617BR1). Tabuľka č. 15: Protokol pre vysokovoltážnu elektroporáciu Vysoko-voltážny protokol pre elektroporáciu d = 4 mm V = 0,5 ml 1500 V 1,2 ms 50 Ω 2 pulzy 10s interval  Kyvety boli po elektroporácii položené na ľad na 10 min  Elektroporované bunky boli prenesené do 10 ml tekutého BHI média v Petriho miskách, kde boli inkubované do ďalšieho dňa v tme pri 26 ˚C ako statická kultúra. Klonálna selekcia nanesením na stuhnuté médium  Bunky po elektroporácii, ktoré boli poponechané rásť v tekutom BHI médiu boli na ďalší deň stočené (3 min, 2000 g).  Médium bolo zliate a vo zvyšnom objeme boli bunky rozsuspendované poklepaním po stene 15 ml skúmavky.  Bunky boli vysiate na čerstvo pripravené agarové platne (podľa Tabuľky č. 2)  Bunky boli kultivované v tme pri 26 ˚C do narastenia plaku (7-9 dní).  Bunky boli následne prekrížkované na ďalšie agarové platne a poponechané rásť 7-15 dní. 1.7. Príprava vzoriek na sekvenáciu Sekvenácia DNA konštrukov je metóda, pomocou ktorej vieme priamo identifikovať vložený gén a skontrolovať správnosť klonovania. Vzorky boli pripravené zmiešaním konštruktovej DNA o koncentrácii 80 - 100 ng.µl-1 s 10 µl primeru priamy s molárnou koncentráciou 5 µM a v prípade potreby bola tak isto pripravená vzorka s reverzným primerom. Sekvenáciu vykonala firma GATC Biotech. 38 1.8. Test a optimalizácia expresie génu pre rekombinantný proteín PSL2 v bunkách E. coli Na testovanie expresie génu pre proteín PSL2 s fúznym proteínom tioredoxínom na N-konci boli použité expresné bunky E. coli Arctic Express(DE3)RIL (Stratagene), BL21(DE3) (Stratagene), Tuner(DE3) (Novagen), Rosetta2(DE3)pLysSRare (Novagen). Zatiaľ čo na testovanie produkcie proteínu PSL2 s oligohistidínovou kotvou na N-konci boli použité expresné bunky E. coli BL21(DE3) (Stratagene) a Tuner(DE3) (Novagen). Zásobné bunky, transformované príslušným konštruktom boli očkované na pevné médium s príslušným antibiotikom a poponechané rásť cez noc pri 37 ˚C. Z nich bola vždy jedna kolónia zaočkovaná 10 ml LB média s príslušným antibiotikom. Následne boli kultivované pri 37˚C, 200 rpm do OD600 ~ 0,5. Expresia génu psl2 bola indukovaná pomocou IPTG (isopropyl-β-D-1-tiogalaktopyranozid) (Carbosynth) pri zníženej teplote. Testované podmienky expresie sú uvedené v Tabuľke č. 17. Počas testovania boli odoberané vzorky pred indukciou a po indukcii v časových intervaloch. Vzorky odobraté po indukcii boli riedené na rovnakú optickú hustotu akú mali pred indukciou. Tabuľka č. 16: Optimalizácia podmienok expresie génu na produkciu proteínu PSL2 s fúznym proteínom tioredoxínom Tabuľka č. 17: Optimalizácia podmienok expresie génu na produkciu proteínu PSL2 s dvomi oligohistidínovými kotvami a NusA fúznym proteínom Konštrukt pRSET A _Thio(HP)TEV_psl2 Expresný systém E. coli cIPTG Teplota (˚C) Čas kultivácie (hod) Objem (ml) BL21(DE3) (Stratagene) 0,10 mM 0,25 mM 0,50 mM 18 15,20 10, 50 25, 30 3,4,5 10 Tuner(DE3) (Novagen) 18 15,20 10 25, 30 3,4,5 10 Rosetta2(DE3)pLysSRare (Novagen) 18 15,20 10 25, 30 3,4,5 10 Arctic Express(DE3)RIL (Stratagene) 12 20,24 10 10 Konštrukt pET-44b_6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 Expresný systém E. coli cIPTG Teplota (˚C) Čas kultivácie (hod) Objem (ml) BL21(DE3) (Stratagene) 0,25 mM 0,50 mM 16 Cez noc 10 30 3 10 Tuner(DE3) (Novagen) 16 Cez noc 10 30 3 10 39 Pre porovnanie celkového množstva proteínu v odobratých vzorkách pred indukciou (1 ml kultúry) a po indukcii boli vzorky stočené na centrifúge (1 min, 13 000 rpm/10 410 g). Pelet bol rozsuspendovaný v 50 µl 4M močoviny a k nemu bolo pridaných 50 µl 2x koncetrovaného vzorkového pufru (0,05 M Tris/ HCl, 10% glycerol, 2% SDS, 2 mM EDTA, 6% merkaptoetanol, 0,2% brómfenolová modrá, pH 6,8). Následne boli vzorky denaturované pri 95 ˚C po dobu 5 min. Potom boli vzorky analyzované pomocou SDS-PAGE. 1.9. Test rozpustnosti produkovaného proteínu PSL2 Po optimalizácii expresie génu pre produkciu proteínu PSL2 bolo treba zistiť, či sa proteín produkuje v dostatočnej miere v rozpustnej forme. Po kultivácii vzoriek za daných podmienok boli odobraté 2 ml kultúry, nariedené na približne rovnaké OD600 ~ 0,5. Potom boli vzorky centrifugované 3min, 8000 rpm/ 6869 g, 4 ˚C a pelet bol rozsuspendovaný v 200 µl pufru (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2, pH 7,5). Vzorky boli dezintegrované pomocou sklenených guličiek opísaných v ďalšej kapitole. Dezintegrácia buniek pomocou sklenených guličiek Vzorky získané v predchádzajúcom kroku boli ďalej dezintegrované pomocou FastPrep-24 (MP BIOMEDICALS) so sklenenými guličkami (0,07-0,1 mm) (2x 20 s cyklus, 6 m.s⁻¹, medzi cyklami 5 minútové chladenie na ľade). Následne boli bunky stočené na centrifúge 1 min, 13 000 rpm (Minispin Plus, Eppendorf). Bola pripravená vzorka CS (rozpustná frakcia) zmiešaním 50 µl supernatantu s 50 µl 2x konc. vzorkového pufru. Pelet bol 2× premytý 1ml pufru (20 mM Tris/ HCl, 300 mM NaCl, 100 mM CaCl2, 100 mM MgCl2, pH 7,5), rozsuspendovaný v 50 μl 4 M močoviny. K zmesi bolo pridaných 50 μl 1% SDS, a následne bola odobratá vzorka CI (nerozpustná frakcia). Odobraté vzorky boli denaturované 5 min pri 95 °C, analyzované SDS-PAGE. 1.10. SDS-PAGE Počas práce boli používané aparatúry Mini-Protean 3 od firmy Bio-Rad, postupovalo sa podľa manuálu. Zloženie gélov je opísané v Tabuľke č. 18. Získané vzorky denaturovaných proteínov boli nanášané o objeme 5 – 15 µl a štandard Unstained Protein Marker III 6,5 – 200 kDa (AppliChem) bol nanášaný o objeme 10 µl. Samotná elektroforéza prebiehala pri konštantnom napätí 120 V v prítomnosti 1x koncentrovaného elektródového pufru (0,1% SDS, 25 mM Tris, 250 mM glycín, pH 8,3) 40 Tabuľka č. 18: Zloženie 10% polyakrylamidových gélov SDS-PAGE Po skončení elektroforézy boli proteíny na géli fixované 10 min vo fixačnom roztoku (30% izopropanol, 10% kyselina octová). Potom bol gél ofarbený pomocou Coomasie Blue (Tabuľka č. 19) alebo pomocou striebra (Tabuľka č. 20). Po odfarbení boli gély uchovávané v MiliQ vode alebo boli vysušené (postupovalo sa podľa manuálu) pomocou sušičky GelAir Dryer (Bio-Rad). Tabuľka č. 19: Postup pri farbení gélu pomocou farbičky Coomasie Briliant Blue R250 Krok Čas Farbiaci roztok (0,025% Coomasie Briliant Blue R250, 50% metanol, 10% kys. octová) Cez noc Odfarbovací roztok (10% kys. octová, 40% etanol) Do odfarbenia pozadia Tabuľka č. 20: Postup pri farbení gélu pomocou striebra 1.11. Imunobloting Imunobloting je metóda, pri ktorej sa proteíny z polyakrylamidového gélu prenášajú na nitrocelulózovú membránu pomocou elektrického prúdu. K špecifickej detekcii proteínov sa používajú protilátky. V tomto prípade bola použitá primárna protilátka proti tioredoxínu (Tioredoxin 1 Polyclonal Rabbit Antibody (ThermoScientific)), ktorý je naviazaný na PSL2 Komponenty Separačný gél 10% (10 ml) Koncentračný gél (5 ml) MiliQ H2O 4,0 ml 3,4 ml 30 % akrylamid 3,3 ml 0,83 ml 1,5 M Tris/ HCl (pH 8,8) 2,5 ml x 1,0 M Tris/ HCl (pH 6,8) x 0,63 ml 10 % SDS 100 ml 50 μl 10 % APS 80 ul 80 μl TEMED 7 µl 5 μl Krok Čas Premytie destilovanou vodou 3x 5 s 60 ml 50% acetónu 5 min 100 μl 10% Na2S2O3, 60 ml destilovanej vody 1 min Premytie destilovanou vodou 3x 5 s 160 mg AgNO3, 60 ml dH2O, 0,6 ml 37% HCHO 8 min Premytie destilovanou vodou 2x 5 s 60 ml 2% Na2CO3, 25 μl 37% HCHO, 25 μl 10% Na2S2O3 Do vyfarbenia 1% kyselina octová 30 s 41 proteín. Ako sekundárna protilátka bola použitá protilátka proti primárnej protilátke (Anti-Rabbit IgG-Alcaline Phosphatase (Sigma-Aldrich)). Po prebehnutí SDS-PAGE bol polyakrylamidový gél namočený na 0,5 min do vody (dH2O) a následne na 15 min do katódového pufru (25 mM Tris, 20 mM glycín, 20% metanol, pH 9,4) spolu s 8 filtračnými papiermi Whatman. Ostatných 8 filtračných papierov spolu s nitrocelulózovou membránou boli na 15 min namočené do anódového pufru (0,3 M Tris, 10% metanol, pH 10,4). Na semi-dry blotovací systém (Trans-BlotTurbo Transfer System (Biorad)) boli naskladané filtračné papiere ekvilibrované v anódovom pufri, nitrocelulózová membrána a polyakrylamidový gél. Na vrch boli položené filtračné papiere ekvlilibrované v katódovom pufri. Do uzavretej blotovacej súpravy bol pustený prúd (I = 1,0 mA; 25 V; 30 min). Nitrocelulózová membrána bola 2x ekvilibrovaná v 5 ml TBS pufru (10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 8,0). Potom bola premiestnená do blokovacieho pufru na 1 hod. V ďalšom kroku bola 3x 5 min premytá v TBST pufri (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,05% Tween20, pH 8,0) a vložená do roztoku primárnej protilátky (Tioredoxin 1 Polyclonal Rabbit Antibody (ThermoScientific), odporučené riedenie 1:1000 (10 ml TBST + 10 µl protilátky), v ktorom bola inkubovaná cez noc pri 4 ˚C. Ďalší deň bola membrána premytá 3x 5 min v 20 ml TBST pufri, potom inkubovaná 1 hod v sekundárnej protilátke (Anti-Rabbit IgG-Alcaline Phosphatase (Sigma-Aldrich) odporučené riedenie 1:30 000 (30 ml TBST +1 µl protilátky). Membrána bola následne premytá 2x 4 min v 15 ml TBST pufri, potom 2x 4 min v 15 ml TBS pufri. Ďalej bola membrána inkubovaná v roztoku s ALP substrátom (20 ml 0,1 M Tris, 0,5 mM MgCl2, pH 9,5; + 100 µl 30 mg.ml-1 BCIP v DMF + 100 µl 60 mg.ml-1 tetrazóliová modrá v 70% DMF). Do 10 minút prebehla farebná reakcia. Membrána bola usušená. 1.12. Produkcia proteínu PSL2 s tioredoxínom na purifikáciu Zásobné bunky E. coli BL21(DE3) s modifikovaným konštruktom pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 boli zaočkované do 5 ml tekutého LB média s príslušným antibiotikom pre vytvorenie inokula (37 ˚C; 200 rpm; OD600 ~ 0,5). Inokulum bolo následne preočkované do 250 ml LB média s prídavkom antibiotika. Bunky boli kultivované (18 ˚C; 19 hod; 0,1 mM IPTG). Konštrukt pET-44b_6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 bol podobne kultivovaný v bunkách E. coli BL21(DE3), indukcia prebehla pomocou 0,5 mM/ 0,25 mM IPTG pri podmienkach 16 ˚C, 18 hod. 42 Po ukončení kultivácie boli bunky zozbierané a centrifugované za podmienok 10 min, 8 000 rpm/11806 g, 4 °C. Bunkový pelet bol rozsuspendovaný v pufri A a uskladnený pri -20 ˚C. V rámci spolupráce s Mgr. Adamom Norkom z výskumnej skupiny „Štruktúra a dynamika proteínov“ z Centra štruktúrnej biológie (CEITEC) boli bunky E. coli kultivované pomocou fermentoru. Najprv boli pripravené tzv. bakteriálne konzervy. Bunky Rosetta2(DE3)pLysSRare, ktoré obsahujú konštrukt pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 boli najprv zaočkované zo zásobných buniek do 3x 100 ml LB média s prídavkom príslušných antibiotík (výsledná c = 200 µg.ml-1 ). Bunky boli kultivované cez noc, následne boli stočené (20 min, 6000 rpm/ 6641g ). Supernatant bol zliaty a bunky boli rozsuspednované v 4 ml 10% glycerolu. Takto pripravené bunky boli rozdelené do alikvótov po 1 ml, zmrazené tekutým dusíkom a uchovávané pri -80 ˚C. Do 3 l TB média (Tryptone 36 g; Yeast extract 72 g; (NH4)2SO4 9,9 g; pH 6,8) s prídavkom 0,1 l fosfátového pufru (0,17 M KH2PO4; 0,72 M Na2HPO4) boli naočkované bunky zo zásobných bakteriálnych konzerv. Indukcia prebehla pomocou prídavku sacharidového roztoku v dvoch podobách za súčasného zníženia teploty (Tabuľka č. 21). Tabuľka č. 21: Priebeh indukcie pomocou IPTG a pomocou autoindukcie počas kultivácie buniek na fermentore Typ indukcie Glukóza Laktóza MgSO4 1M IPTG Zmena teploty IPTG 2,5 g 0,0 g 0,15 g 0,5 ml 30 ᵒC → 16 ᵒC Autoindukcia 0,5 g 2,0 g 0,15 g 0,0 ml 25 ᵒC → 22 ᵒC Sonikácia Zmrazené bunky získané z predchádzajúceho kroku boli poponechané cez noc rozmrznúť pri 4 ˚C. Na ďalší deň boli dezintegrované na sonikátore (SONICSvibracell VCX500) pri podmienkach 2x 10 cyklov, 1 s pulz a 4 s pauza na ľade, amplitúda 40 %. Potom boli bunky centrifugované 45 min pri 4 °C, 14 000 rpm/21 036 g (centrifúga 16-16K, Sigma). Bunkový supernatant bol ďalej prefiltrovaný pomocou nesterilného filtra s veľkosťou pórov 0,45 µm (Roth). Vzorka bola udržiavaná na ľade. 1.13. Purifikácia s využitím metaloafinitnej choromatografie Na purifikáciu proteínu PSL2 s fúznym proteínom tioredoxínom alebo s oligohistidínovými kotvami bola využitá metaloafinitná chromatografia s Ni-NTA matricou (Ni-NTA Superflow Cartridge, 5 ml (3 x 2 cm), Qiagen), navrhnutou pre FPLC purifikáciu za použitia prístroja ÄKTA Purifier (GE Healthcare) a programu Unicorn 5.11. 43 Kolóna bola najskôr premytá nanášacím pufrom (A). Vzorka získaná dezintegráciou bola nanášaná na kolónu prietokom 0,3 ml.min-1 , odmývanie nezachytených frakcií bolo vykonané pomocou prietoku 1 ml.min-1 . Nasledovala elúcia proteínu postupným zvyšovaním koncentrácie imidazolu obsiahnutom v elučnom (B) pufri. Z každej frakcie teoreticky obsahujúcej požadovaný proteín boli spracované vzorky pre SDS-PAGE zmiešaním vzorky s 2x vzorkovým pufrom v pomere 1:1. Pomocou elektroforézy bola zistená nielen prítomnosť vypurifikovaného proteínu, ale aj jeho čistota. 1.14. Dialýza Vzorky, ktoré podľa výsledkov elektroforézy obsahovali proteín boli dialyzované 3x pomocou dialyzačného čreva (SnakeSkin, cut-off limit 3,5 kDa; Thermo Scientific) v chlade oproti purfu: (10 l) 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 8,0 po dobu dvoch dní. Dialýza bola použitá na odstránenie imidazolu a EDTA, ktorými bol proteín PSL2 eluovaný z kolóny. U vzoriek po elúcii pomocou EDTA dialýza slúžila aj na navrátenie iónov kovov do roztoku proteínu, preto bol na začiatku dialýzy do čreva bol pridaný 30 mM CaCl2. 1.15. Koncentrovanie proteínu Proteín bol koncentrovaný pomocou koncentračných skúmaviek (Vivaspin® 20), použitá membrána mala cut-off 10 000 Mr. Koncentrovanie prebiehalo pri podmienakch 4 ˚C, 8 000 rpm. Výsledná koncentrácia proteínu bola stanovená na nanodrope (NanoDrop ND-1000, Coleman Technologies). Na prípadné zakoncentrovanie proteínu z malého objemu boli použité koncentračné mikroskúmavky (Vivaspin® 500) s cut-off hodnotou 3 000 Mr za podmienok RT, 14 000 rpm. 1.16. CD spektroskopia Pri metóde spektroskopie cirkulárneho dichroizmu sa meria rozdielna absorbcia väzieb opticky aktívnych chirálnych molekúl pri prechode ľavostranného a pravostranného polarizovaného svetla (pozri na graf č.1). Metóda sa používa na sledovanej celkovej konformácie nukleových kyselín a proteínov. V tomto prípade bola sledovaná sekundárnu štruktúru proteínu PSL2. Meranie prebiehalo priUV svetle v rozpätí vlnových dĺžok 180 – 250 nm. Výsledné CD spektrum je zložené z možných sekundárnych štruktúr proteínov: α-helixu, β-skladaného listu alebo náhodného klbka. Meranie vzoriek proteínu PSL2 po purifikácii v pufri (20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 8,0) prebiehalo na spektrofotometri J-810 (Jasco) vždy v 3 opakovaniach, rýchlosť 44 skenovania bola nastavená na 50 nm.min-1 a rozpätie po 1 nm. Dáta boli vyhodnotené pomocou programu SpectraManager. Použité kremenné kyvety (Hellma), ktorých dĺžka optickej dráhy je 1 mm boli opatrne naplnené 200 µl vzorky obsahujúcej proteín PSL2 po hrane kyvety. Graf č. 1: Špecifické krivky CD spektra pre jednotlivé sekundárne štruktúry; revzaté z a upravené z http://www.fbs.leeds.ac.uk/facilities/cd/ 1.17. Funkčné štúdie hypotetického lektínu PSL2 Hemaglutinácia s použitím mikroskopu Hemaglutinácia je dej, pri ktorom dochádza k zhlukovaniu povrchových aglutinogénov (antigénov) – poligosacharidových reťazcov pripojených na glykoforíny (integrálne membránové proteíny) – pri reakcii s aglutinínmi, v tomto prípade lektínmi. Povrchové antigény erytrocytov sú zodpovedné za rozlišovanie krvých skupín (A, B, AB a 0). Majú rovnaký základ, ktorý sa nazýva H antigén. Ten je zložený z D-galaktózy, GlcNAc a L-fukózy. Takýto antigén majú na svojom povrchu erytrocyty skupiny 0 (antigén 0). Krvná skupina A sa líši tým, že obsahuje základnú zostavu sacharidov a navyše GalNAc (antigén A). Krvná skupina B má na svojom povrchu okrem základu navyše D-galaktózu (antigén B). Jedinci so skupinou AB majú na povrchu erytrocytov naviazané antigény A aj B (38). Pred samotným vykonaním experimentov bola krv stabilizovaná zmiešaním s protizrážajúcim činidlom citrátom sodným (3,8%), centrifugovaná, premytá 3x PBS pufrom (137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 8 mM Na2HPO4, 1,47 mM KH2PO4, pH je 7,4 ± 0,2) a získané erytrocyty boli nariedené na 50% PBS pufrom. Na podložné sklíčko bolo napipetovaných 10 μl 50% erytrocytov a 10 μl vzorky. Obe zložky boli na sklíčku premiešané a poponechané reagovať po dobu 3 minút. Negatívna kontrola bola vytvorená zmiešaním krviniek a pufru v pomere 1:1. V rovnakom pomere bola vytvorená pozitívna kontrola s lektínom Con A (0,1 mg.ml-1 ). Všetky pozorovania boli vykonané pri laboratórnej teplote pomocou optického mikroskopu s digitálnou kamerou (Levenhuk D2L) za využitia programu ToupView. 45 2. Výsledky a diskusia 2.1. Príprava DNA konštruktov pre produkciu proteínu s oligohistidínovými kotvami PCR Vyizolované 2 východiskové plazmidy, obsahujúce gény psl2, boli podrobené PCR reakcii, pre amplifikáciu tohto génu psl2. Prvým takýmto plazmidom bol pMAT¬_N-6xHis_TEV_psl2, z ktorého bol amplifikovaný inzert N-6xHis_TEV_psl2, ktorý bol následne vložený do týchto cieľových konštruktov: pLEXSY_IE_blecherry4 so sign. sekvenciou, pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie, pET-44b_N-6xHis_NusA. Druhý plazmid, použitý na amplifikáciu inzertu TEV_psl2 bol pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 (bez 6xHis). Získaný inzert bol preklonovaný do cieľového konštruktu pET-44b_NusA_C-6xHis. Vzorky boli vložené do dvoch termocyklérov s rozdielnym nastavením teploty nasadania primerov. Teplota nasadania primerov bola zvolená na základe štruktúry navrhnutých primerov (pozri Tabuľku č. 4). PCR produkty odpovedajúce očakávanej veľkosti génu (768/ 738 pb) boli vyrezané z gélu (Obrázok č. 6) a použité pre ďalšie reštrikčné štiepenie. Obrázok č. 6: 1% agarózový gél s PCR produktami: a. N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 pre cieľový konštrukt pET-44b b. TEV_psl2 pre cieľový konštrukt pET-44b c. N-6xHis_TEV_psl2 pre cieľový konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie d. N-6xHis_TEV_psl2 pre cieľový konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4 so sign. sekvenciou Použitý DNA štandard 100 - 1 517 pb (NEB) Gradientová PCR Pri PCR reakcii sa neporadilo získať inzert TEV_psl2 z východiskového plazmidu pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 (bez 6xHis) určeného pre cieľový konštrukt 768 pb 768 pb 768 pb 738 pb a b c d 768 pb 768 pb 738 pb 700 pb 800 pb 46 pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie. Preto bola vykonaná gradientová PCR na zistenie optimálnej teploty nasadania primerov (Obrázok č. 7). Podľa Obrázku č. 7 bolo usúdené, že najvhodnejšia teplota nasadania primerov č. 626 a 627 na templátovú DNA pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 (bez 6xHis) je 50,5 ˚C (jamka č.2). Na Obrázku č. 8 je zobrazený PCR produkt (inzert TEV_psl2) po optimalizácii. Obrázok č. 8: 1% agarózový gél s PCR produktami TEV_psl2 po optimalizácii nasadania primerov pre cieľový konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4-sig. sekvencia, očakávaná veľkosť 768 pb, DNA štandard 0,5 – 10 kb (NEB) 2.2. Reštrikčné štiepenie Štiepenie cieľových plazmidov Vyizolované cieľové plazmidy boli podrobené reštrikčnému štiepeniu (podľa návodu opísaného v kapitole Reštrikčné štiepenie). V Tabuľke č.22 sú uvedené použité reštrikčné Obrázok č. 7: 1% agarózový gél s PCR produktami TEV_psl2 po gradientovej PCR pre cieľový konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie, očakávaná veľkosť PCR produktu 768 pb, DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB) 768 pb 768 pb 800 pb 700 pb Legenda 1- 50,0 ˚C 2- 50,5 ˚C 3- 51,2 ˚C 4- 52,1 ˚C 5- 53,5 ˚C 6- 54,7 ˚C 7- 55,6 ˚C 8- 56,9 ˚C 9- 58,1 ˚C 10- 59,1 ˚C 11- 59,7 ˚C 12- 60,0 ˚C 13- DNA Štandard 100 - 1 517 pb (NEB) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 0,5 kb 1,0 kb 47 enzýmy (RE) a očakávané veľkosti linearizovaných plazmidov a fragmentov vyštiepených z MCS. Výsledné štiepené plazmidy sú zobrazené na Obrázku č. 9. Tabuľka č. 22: Očakávané veľkosti plazmidov pred štiepením a po štiepení, použité reštrikčné endonukleázy Konštrukt Veľkosť celého konštruktu Použitá dvojica restriktáz Očakávaná veľkosť linerarizovanej plazmidovej DNA Očakávaný vyštiepený fragment DNA pET-44b_N-6xHis_NusA 7311 pb SpeI, XhoI 7020 pb 291 pb pET-44b_NusA_C-6xHis 7311 pb SpeI, HindIII 7086 pb 225 pb pLEXSY_IE_blecherry4 so sign. sekvenciou 7692 pb XbaI, NotI 6644 pb 1048 pb pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie 7692 pb NcoI, NotI 6569 pb 1123 pb Reštrikčné štiepenie cieľových plazmidov prebehlo bez problémov. Na obrázku č. 9 je zobrazené, že štiepené plazmidy ako aj vyštiepené fragmenty z MCS svojimi veľkosťami odpovedajú očakávaným hodnotám. Linearizované plazmidové DNA boli z 1% gélov vyrezané. Kvôli zisku koncentrovanješích vzoriek boli spojené vždy 2 – 3 prúžky gélu a pomocou kitu (Gel Extraction, QIAGEN) boli vzorky extrahované do roztoku. Obrázok č. 9: 1% agarózový gél: štiepenie cieľových plazmidov pomocou dvojice restriktáz: a. pET-44b_ N-6xHis_NusA, štiepený RE: SpeI, XhoI (DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB)) b. pET-44b_ NusA_C-6xHis, štiepený RE: SpeI, HindIII (DNA štandard 0,5 – 10 kb (NEB)) c. pLEXSY_IE_blecherry4 so sign. sekvenciou, štiepený RE: XbaI, NotI (DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB)) d. pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie, štiepený RE: NcoI, NotI (DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB)) a b c d 6569 pb 1123 pb 1048 pb 225 pb291 pb 6644 pb 7086 pb 7020 pb 48 Štiepenie PCR produktov Štiepenie PCR produktov prebiehalo podľa opísaného návodu (Reštrikčné štiepenie). Takmer všetky PCR produkty boli úspešné naštiepené pomocou špecifickej dvojice restriktáz. V tomto kroku sa z dôvodu nedostatočného množstva restriktázy SpeI nepokračovalo v príprave konštruktu pET-44b s oligohistidínovou kotvou na C-konci. Kontrola úspešnosti transformácie buniek E. coli pripravenými konštruktami 2.2.1.1. PCR kolónií Pre rýchle zistenie prítomnosti rekombinantného konštruktu v bunkách E. coli po transformácii kompetentných buniek, bola vykonaná PCR kolónií (postup a použité primery pozri v kapitole 0) v prípade transformovaných buniek pomocou rekombinantných plazmidov pLEXSY_IE_blecherry4 (s/ bez sign. sekvencie). Ak prebehli všetky predchádzajúce kroky v rámci klonovania správne, pomocou UV žiarenia bolo možné na 1% agarózovom géli pozorovať inzert DNA sekvencie o približnej veľkosti 800 pb. Z gélov (Obrázky č. 10, 11) sa nedá jednoznačne učiť, či prebehla reakcie správne, lebo veľkosť prítomného prúžku DNA je väčšia ako predpokladaná. Preto boli jednotlivé kolónie použité pri PCR kolónií zaočkované do tekutého LB média a z prerastenej kultúry boli vyizolované DNA plazmidy. Tie boli použité pre kontrolné reštrikčné štiepenie rovnakou dvojicou restriktáz, aké boli použité pri procese klonovania. Obrázok č. 10: PCR kolónií; konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 bez sign. sekvencie (1% agarózový gél), očakávaná veľkosť vyšiepeného fragmentu cca 800 pb, DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB) 700 pb 800 pb 49 Kvôli nepresnosti výsledkov z PCR kolónií u konštruktov pLEXSY_IE_blecherry4 (s a bez sign. sekvencie) bola kontrola úspešnosti transformácie buniek E. coli konštruktom pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV__psl2 vykonaná iba pomocou kontrolného reštrikčného štiepenia. 2.2.1.2. Kontrolné reštrikčné štiepenie Vyizolovaný DNA plazmid (pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 s/ bez sign. sekvencie) z kolónii narastených po transformácii buniek E. coli bol analyzovaný aj pomocou kontrolného reštrikčného štiepenia. Na géli sú zobrazené vyštiepené fragmenty obsahujúce sekvenciu génu psl2 o očakávanej približnej veľkosti 800 pb (Obrázok č. 12, jamky 1, 4-8). Z nich boli vybraté vzorky č. 4, 5, 6, ktoré boli podrobené sekvenácii. Pomocou tejto metódy bola potvrdená prítomnosť vloženého inzertu N-6xHis_psl2 do konštruktov pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign. sekvencie (príloha č.2, 3) a pLEXSY_IE_blecherry4 so sign. sekvenciou (príloha č.4). V jamke č.3 sa nachádza prúžok o veľkosti cca 1100 pb, čo znamená že počas predchádzajúcich krokov klonovania nebol úspešne vyštiepený fragment (1123 pb) pomocou dvojice restriktáz z MCS, a preto nebol do konštruktu úspešne vložený požadovaný inzert obsahujúci gén pre proteín PSL2. Obrázok č. 11: PCR kolónií; konštrukt pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 so sign. sekvenciou, očakávaná veĺkosť vyštiepeného fragmentu cca 800 pb, (1% agarózový gél), DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB) 800 pb 700 pb 50 Vyizolovaný DNA konštrukt pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 z kolónii narastených po transformácii buniek E. coli bol tak isto podrobený kontrolnému reštrikčnému štiepeniu. Obrázok č. 13 znázorňuje vyštiepený inzert 6xHis_TEV_psl2 o približnej veľkosti 800 pb. Všetky 3 vzorky boli poslané na sekvenáciu, ktorá potvrdila prítomnosť inzertu (príloha č.5). Výsledky kontroly úspešnosti transformácie a následné výsledky sekvenácie potvrdzujú, že sa podarilo pripraviť 3 konštrukty. Štvrtý konštrukt (pET-44b C-6xHis_TEV_psl2) nebol úspešne pripravený pre nedostatok restriktázy SpeI. Obrázok č. 12: Kontrolné štiepenie konštruktov pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 so/ bez sign. sekvencie po transformácii kompektentných buniek E. coli; obrázok zobrazuje vyštiepené fragmenty inzertu o predpokladanej veľkosti cca 800 pb (N-6xHis_TEV_psl2); v jamke č.3 je vyštiepený fragment z MCS o veľkosti cca 1000 pb - neobsahujúci gén psl2 (1% agarózový gél), DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB) Obrázok č. 13: Kontrolné štiepenie konštruktu pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 po transformácii buniek E. coli, vyštiepený fragment inzertu o predpokladanej veľkosti cca 800 pb (N-6xHis_TEV_psl2); (1% agarózový gél), DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB) 800 pb 700 pb Legenda: fragmenty reštrikčného štiepenia vyizolovanej plazmidovej DNA 1- pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign.sekvencie 2- DNA štandard 100 – 1 517 pb (NEB) 3- pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign.sekvencie 4- pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign.sekvencie 5- pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign.sekvencie 6- pLEXSY_IE_blecherry4 so sign.sekvenciou 7- pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign.sekvencie 8- pLEXSY_IE_blecherry4 bez sign.sekvencie 700 pb 800 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 51 2.3. Transfekcia Leishmania tarentolae Na produkciu proteínu PSL2 bol tento eukaryotický systém aj napriek časovej náročnosti experimentálnej práce zvolený vďaka tomu, že L. tarentolae sa radí medzi zložitejšie expresné organizmy. L. tarentolae obsahujú glykoproteíny veľmi podobné vyšším organizmom, vďaka ktorým sú schopné zvýšiť produkciu ako aj čistotu cieľového proteínu (31). Predpokladom bolo, že táto vlastnosť organizmu L. tarentolae bude vhodná pre proteín PSL2, ktorý je pôvodne z hrachu siateho. Do buniek L. tarentolae boli podľa postupu transfekcie vnesené pripravené konštrukty pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 bez sign. sekvencie v objeme 50 µl o koncentrácii 181 ng.µl-1 a pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 so sign. sekvenciou v objeme 30 µl o koncentrácii 323 ng.µl-1 . V dôsledku nesprávne použitého nastavenia prístroja boli aplikované iné hodnoty (pozri Tabuľku č.23). Aj napriek tomu sa po elektroporácii pokračovalo klonálnou selekciou podľa návodu. Tabuľka č. 23: Porovnanie vysoko-voltážneho protokolu s hodnotami v skutočnosti použitými na elektroporáciu Bunky elektroporované oboma druhmi konštruktov na miskách po prekrížkovaní nenarástli do 15 dní, preto boli kultivované ešte ďalších 7 dní na miskách, avšak s rovnakým výsledkom. Napriek tomu boli bunky z misiek s krížikmi ako aj z pôvodných misiek po transformácii zaočkované do 1 ml média bez tetracyklínu (jamky v bielom rámčeku (zloženie média v Tabuľke č.1 s prídavkom LEXSY Bleo do výslednej koncentrácie 100 µg.ml-1 )) a do 1 ml média s tetracyklínom (jamky v šedom rámčeku (rovnaké zloženie média ako predtým + prídavok LEXSY Tet do výslednej koncentrácie 10 µg.ml-1 )) použitím 12 jamkovej misky (Obrázok č. 14). Bunky boli kultivované staticky v tme pri 26 ˚C po dobu 14 dní. Po uplynutí tejto doby boli bunky skontrolované pod mikroskopom. Na základe vyžarovania červeného svetla pod vplyvom tetracyklínu (Obrázok č. 15) bolo usúdené, že bunky boli pomocou konštruktu pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 so sign. sekvenciou úspešne transfekované. Vysoko-voltážny protokol pre elektroporáciu Správny protokol Priebeh experimentu d = 4 mm d = 4 mm V = 0,5 ml V = 0,5 ml 1500 V 1490 V 1,2 ms 7 ms 50 Ω 200 Ω 2 pulzy 10s interval 2 pulzy 10s interval 52 Bunky transfekované konštruktom pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 bez sign. sekvencie nenarástli. Transfekcia neprebehla úspešne pravdepodobne kvôli nesprávnemu nastaveniu prístroja pri elektroporácii. Z dôvodu nedostatku času sa nepodarilo experiment opakovať. Bez tetracyklínu S tetracyklínom Obrázok č. 14: Zobrazenie 12 jamkovej misky, do ktorej boli očkované bunky L.tarentolae po elektroporácii obomi konštruktami: z misiek po transformácii (riadky A, B) ako aj z misiek po prekrížkovaní (riadok C); v šedej časti obrázku bol do média pridaný tetracyklín; značky -/+ znamenajú, označenie buniek zaočkovaných do média na miske (bunky s konštruktom pLEXSY_IE_blecherry4_N- 6xHis_psl2 so sign. sekvenciou alebo bunky obsahujúce pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 bez sign. sekvencie) Obrázok č. 15: Leishmania tarentolae po elektroporácii konštruktom pLEXSY_IE_blecherry4_N- 6xHis_TEV_psl2 so sign.sekvenciou a následnej indukcii pomocou tetracyklínu vyžarujúce červené svetlo 53 2.4. Test expresie génu psl2 vloženého do konštruktov pre produkciu proteínu PSL2 v E. coli Konštrukt pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 Počas tohto testu boli používané kmene E. coli Arctic Express(DE3)RIL (Stratagene), BL21(DE3) (Stratagene), Tuner(DE3) (Novagen), Rosetta2(DE3)pLysSRare (Novagen). Bunky E. coli Arctic Express(DE3)RIL sú uspôsobené na produkciu proteínov pri nízkych teplotách, pretože ko-exprimujú šaperoníny adaptované na chlad - Cpn10 a Cpn60 z baktérie Oleispira antarctica. Tie majú 74% a 54% aminokyselinovú identitu so šaperóninmi z E. coli (GroEL a GroES šaperoníny). Bunky obsahujú konštrukty s extrakópiami tRNA génov, ktoré kódujú tRNA. Tie, ako signalizuje označenie „RIL“, samostatne rozpoznávajú kodóny arginínu AGA a AGG, izoleucínu – AUA, a leucínové kodóny CUA. Dostupné tRNA najčastejšie obmedzujú transláciu heterológnych proteínov z organizmov, ktoré majú AT- bohaté genómy. Vďaka tomu že, poskytujú vysokú aktivitu proteínového opätovného zbalenia pri teplotnom rozmedzí 4 – 12 ˚C, poskytujú potenciálne zvýšený výťažok aktívneho proteínu v rozpustnej forme (39). Kmeň Rosetta2(DE3)pLysSRare je špecifický tým, že obsahuje kodóny, ktoré sa zriedka vyskytujú v E. coli - poskytuje tRNA pre 7 vzácnych kodónov (AGA, AGG, AUA, CUA, GGA, CCC a CGG). Tento kmeň exprimuje T7 lyzozým, ktorý ďalej potláča základnú expresiu T7 RNA polymerázy pred indukciou, tak stabilizuje pET rekombinantné cieľové proteíny, ktoré majú vplyv na bunkový rast a životaschopnosť (40). Výsledky optimalizácie celkovej produkcie proteínu PSL2 v týchto kmeňoch sú zobrazené na obrázkoch č. 16, 17, 18. Indukcia expresie génu psl2 prebiehala vo všetkých experimentoch pomocou 0,1 mM IPTG. Očakávaná veľkosť produkované proteínu PSL2 s fúznym proteínom tioredoxínom je približne 42 kDa. Najvýraznejšia celková produkcia proteínu PSL2 bola v kmeni E. coli BL21(DE3), za podmienok indukcie 18 ˚C, 20 h (Obrázok č. 18 – 8. jamka). Ostatné výsledky celkovej produkcie proteínu PSL2 v rôznych kmeňoch E. coli naznačujú, že celková produkcia proteínu PSL2 je približne rovnaká. Konštrukt pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 Nakoľko predchádzajúci konštrukt pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 pri teste celkovej produkcie poskytoval skreslené výsledky – do celkovej produkcie proteínu PSL2 spadá aj proteín produkovaný v nerozpustnej forme, bol z tohto dôvodu vynechaný test celkovej produkcie proteínu PSL2 pre konštrukt pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2. 54 Obrázok č. 16: Optimalizácia produkcie proteínu PSL2 s tioredoxínom v bunkách E. coli ArcticExpress(DE3)RIL a Rosetta2(DE3)pLysRare (10% polyakrylamidový gél) Obrázok č. 17: Optimalizácia produkcie proteínu PSL2 s tioredoxínom v bunkách E. coli Tuner(DE3) (10% polyakrylamidový gél) Obrázok č. 18: Optimalizácia produkcie proteínu PSL2 s tioredoxínom v bunkách E. coli BL21(DE3) (10% polyakrylamidový gél) 45 kDa 42 kDa 1 2 3 4 5 6 7 Legenda - produkcia proteínu PSL2 za podmienok: 1- ArcticExpress(DE3)RIL, 12 ˚C, 20h 2- ArcticExpress(DE3)RIL, 12 ˚C, 24h 3- ArcticExpress(DE3)RIL, pred indukciou 4- Rosetta2(DE3)pLysRare, 18 ˚C, 15h 5- Rosetta2(DE3)pLysRare, 18 ˚C, 20h 6- Rosetta2(DE3)pLysRare, pred indukciou 7- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 29 kDa 42 kDa Legenda 1- Tuner(DE3), 30 ˚C, 3h 2- Tuner(DE3), 30 ˚C, 4h 3- Tuner(DE3), 30 ˚C, 5h 4- Tuner(DE3), 25 ˚C, 3h 5- Tuner(DE3), 25 ˚C, 4h 6- Tuner(DE3), 25 ˚C, 5h 7- Tuner(DE3), 18 ˚C, 15h 8- Tuner(DE3), 18 ˚C, 20h 9- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 10- Tuner(DE3), pred indukciou 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 45 kDa 29 kDa 45 kDa 42 kDa 29 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Legenda 1- BL21(DE3), 30 ˚C, 3h 2- BL21(DE3), 30 ˚C, 4h 3- BL21(DE3), 30 ˚C, 5h 4- BL21(DE3), 25 ˚C, 3h 5- BL21(DE3), 25 ˚C, 4h 6- BL21(DE3), 25 ˚C, 5h 7- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 8- BL21(DE3), 18 ˚C, 20h 9- BL21(DE3), pred indukciou 55 2.5. Test rozpustnosti produkovaného proteínu PSL2 Proteín PSL2 s tioredoxínom (pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2) Aj napriek tomu, že bola nájdená podmienka, počas ktorej je celková produkcia proteínu PSL2 vo viditeľne väčšom množstve ako pri ostatných podmienkach, bolo nutné zistiť jeho množstvo v rozpustnej forme. Preto boli vykonané rozsiahle testy rozpustnosti proteínu PSL2 v 3 bakteriálnych kmeňoch E. coli (pozri prílohu č. 6). Pomocou testu rozpustnosti nebola nájdená podmienka, ktorá by mala výrazne väčší vplyv na produkciu proteínu PSL2 s tioredoxínom v rozpustnej forme. Výťažok tohto proteínu v rozpustnej forme bol pri každej testovanej podmienke takmer rovnaký. Na produkciu proteínu PSL2 s tioredoxínom pomocou fermentoru bol aj tak pre ďalšiu prácu vybraný kmeň buniek E. coli Rosetta2(DE3)pLysSRare, práve vďaka jeho vlastnostiam. Proteín PSL2 s dvomi oligohistidínovými kotvami a NusA fúznym proteínom (pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2) Keďže pri predchádzajúcich testoch produkcie proteínu PSL2 nepreukázali kmene buniek E. coli Arctic Express(DE3)RIL a Rosetta2(DE3)pLysSRare vplyv na väčšiu produkciu proteínu PSL2, neboli pri teste rozpustnoti proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom použité. Testu rozpustnosti bol podrobený proteín PSL2 produkovaný dvomi kmeňmi buniek E. coli: BL21(DE3) a Tuner(DE3), ktoré boli transformované konštruktom pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2. U oboch kmeňoch buniek sa preukázalo, že prítomnosť NusA proteínu výrazne napomohla k posunu produkcie proteínu PSL2 do rozpustnej frakcie (pozri obrázky č. 19, 20). NusA proteín sa bežne používa ako fúzny partner na pridelenie stability a vyššej rozpustnosti cieľového proteínu. Táto vlastnosť zvyšovať produkciu fúznych proteínov do rozpustnej fáze môže byť spojená s jeho vysokou vnútornou rozpustnosťou a biologickou aktivitou v E. coli. Tento fúzny partner spomaľuje transláciu, čím poskytuje proteínu viac času na zbalenie (41). 56 Na základe testu rozpustnosti boli vybraté pre ďalšiu prácu bunky E. coli BL21(DE3) a podmienky expresie: indukcia pomocou 0,50 mM IPTG, následné pestovanie buniek cez noc (ON) pri 16˚C. Prítomnosť rekombinantného proteínu 6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 bola potvrdená prostredníctvom analýzy pomocou hmotnostnej spektrometrie (MS) (pozri príloha č. 7, vzorka č.5). Obrázok č. 19: Test rozpustnosti proteínu PSl2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami (veľkosť cca 86 kDa) v bunkách E. coli BL21(DE3) (10% polyakrylamidový gél) Obrázok č. 20:Test rozpustnosti proteínu PSl2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami (veľkosť cca 86 kDa) v bunkách E. coli Tuner(DE3) (10% polyakrylamidový gél) (ON = cez noc) Legenda: bunky E. coli Tuner(DE3) transformované konštruktom pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 1. pred indukciou 2. po indukcii 30˚C, 3h, 0,25 mM IPTG 3. CS 30˚C, 3h, 0,25 mM IPTG 4. CI 30˚C, 3h, 0,25 mM IPTG 5. po indukcii 30˚C, 3h, 0,50 mM IPTG 6. CS 30˚C, 3h, 0,50 mM IPTG 7. CI 30˚C, 3h, 0,50 mM IPTG 8. - 9. Po indukcii 16˚C, ON, 0,50 mM IPTG 10. CS 16˚C, ON, 0,50 mM IPTG 11. CI 16˚C, ON, 0,50 mM IPTG 12. Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 116 kDa 66 kDa Legenda: bunky E. coli BL21(DE3) transformované konštruktom pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 1. pred indukciou 2. po indukcii 30˚C, 3h, 0,25 mM IPTG 3. CS 30˚C, 3h, 0,25 mM IPTG 4. CI 30˚C, 3h, 0,25 mM IPTG 5. po indukcii 30˚C, 3h, 0,50 mM IPTG 6. CS 30˚C, 3h, 0,50 mM IPTG 7. CI 30˚C, 3h, 0,50 mM IPTG 8. Po indukcii 16˚C, ON, 0,25 mM IPTG 9. CS 16˚C, ON, 0,25 mM IPTG 10. CI 16˚C, ON, 0,25 mM IPTG 11. Po indukcii 16˚C, ON, 0,50 mM IPTG 12. CS 16˚C, ON, 0,50 mM IPTG 13. CI 16˚C, ON, 0,50 mM IPTG 14. Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 116 kDa 66 kDa 57 2.6. Produkcia proteínu PSL2 pre purifikáciu Proteín PSL2 s tioredoxínom (pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2) Podľa hodnoty celkovej produkcie proteínu PSL2 v bunkách bola na jeho produkciu vybratá podmienka E. coli BL21(DE3), 18 ˚C, 20 hod. Avšak produkcia proteínu PSL2 v rozpustnej forme bola pri týchto podmienkach príliš nízka. Preto boli podľa testov rozpustnosti a na základe poznania vlastností buniek vybraté bunky Rosetta2(DE3)pLysSRare. Keďže produkcia proteínu PSL2 do rozpustnej frakcie počas kultivácie v malých objemoch bola nízka, bol na kultiváciu buniek použitý fermentor. Predpokladalo sa, že zväčšením množstva získaných buniek, by sa mal zvýšiť aj výťažok proteínu PSL2. Táto metóda kultivácie bola prínosná v rôznych iných výskumoch, práve preto, že sme schopní za kratšiu dobu získať väčšie množstvo biomasy. Vďaka spolupráci s pánom Mgr. Norkom bolo získané po autoindukcii ≈ 40 g mokrej masy z 3 l kultivačného média (OD600 ~ 25) a po indukcii pomocou IPTG ≈ 50 g mokrej masy z 3 l kultivačného média (OD600 ~ 30). Počas kultivácie, po indukcii IPTG, ako aj po autoindukcii boli odoberané vzorky v čase (v intervaloch po 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 25, 27 hod) pozri graf č. 2. Zvyšujúca sa produkcia proteínu PSL2 v čase bola potvrdená aj pomocou SDS-PAGE na 10% géli (obrázok č. 21). Graf č. 2: Porovnanie nárastu hustoty kultúry buniek E. coli kmeňa Rosetta2(DE3)pLysSRare transformovaných konštruktom pRSET_Thio(HP)TEV_psl2 po autoindukcii (AI) a po indukcii pomocou IPTG v časových intervaloch 2, 4, 6, 8, 10, 11, 13, 15, 25, 27 hod (merané pri OD600) 58 Prvotné testy zmeny rozpustnosti proteínu PSL2 s tioredoxínom v závislosti na pH sonikačného pufru, boli vykonané v Centre štruktúrnej biológie (CEITEC) vo výskumnej skupine „Štruktúra a dynamika proteínov“. Na našom pracovisku boli testy rozpustnosti tohto proteínu zopakované, pričom boli použité 4 rôzne pufre (pozri Tabuľku č. 24). Vo výsledku bol na polyakrylamidovom géli jediný viditeľný prúžok o veľkosti proteínu PSL2, a to vo vzorke s pufrom A (Obrázok č. 22). Tento pufer bol používaný v ďalších krokoch. Tabuľka č. 24: Zloženie pufrov použitých pri teste rozpustnosti A B C D 0,1 M CAPSO 0,3 M NaCl 0,1 mM CaCl2 0,1 mM MnCl2 pH 11,0 1 mM PMSF 20 mM Tris/ HCl 0,3 M NaCl 0,1 mM CaCl2 0,1 mM MnCl2 pH 7,5 0,05% Tween 20 mM Tris/ HCl 0,3 M NaCl 0,1 mM CaCl2 0,1 mM MnCl2 pH 7,5 5% glycerol 20 mM Tris/ HCl 0,3 M NaCl 0,1 mM CaCl2 0,1 mM MnCl2 pH 7,5 Obrázok č. 21: Porovnanie produkcie proteínu PSL2 s tioredoxínom v čase v bunkách E. coli kmeňa Rosetta2(DE3)pLysSRare transformovaných konštruktom pRSET_Thio(HP)TEV_psl2 po autoindukcii a po indukcii pomocou IPTG v časových intervaloch (10% polyakrylamidový gél) Obrázok č. 22: Test rozpustnosti proteínu PSL2 s tioredoxínom produkovaným pomocou buniek E. coli kmeňa Rosetta2(DE3)pLysSRare transformovaných konštruktom pRSET_Thio(HP)TEV_psl2 v 4 rôznych pufroch (10% polyakrylamidový gél) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Legenda vzoriek odoberaných v čase: 1- Štandard 20 – 120 kDa (ThermoFisher) 2- Kontrola - neindukované 3- Indukcia IPTG po 2 h 4- Indukcia IPTG po 8 h 5- Indukcia IPTG po 15 h 6- Indukcia IPTG po 27 h 7- Autoindukcia 11 h 8- Autoindukcia 15 h 9- Autoindukcia 27 h 50 kDa 35 kDa 42 kDa Legenda vzoriek po teste rozpustnosti v rôznych pufroch: 1- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 2- CS pufer A 3- CI pufer A 4- CS pufer B 5- CI pufer B 6- CS pufer C 7- CI pufer C 8- CS pufer D 9- CI pufer D 45 kDa 29 kDa 42 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 59 Proteín PSL2 s dvomi oligohistidínovými kotvami a NusA fúznym proteínom (N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2) Boli napestované bunky v objeme 500 ml, indukované a kultivované cez noc pri optimalizovaných podmienkach (E. coli BL21(DE3); 16˚C; 0,50 mM IPTG). Získaný pelet bol rozsuspendovaný v 15 ml pufru (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 100 µM CaCl2, pH 8,0). Bunky boli sonikované 2 x (10x (1s pulz + 4 s pauza). 2.7. Purifikácia PSL2 s tioredoxínovou kotvou Bunková hmota získaná po autoindukcii z kultivácie pomocou fermentoru bola rozsuspendované v 500 ml pufru A, zmes bola sonikovaná (amplitúda 40%, 3 hod (3s pulz + 4 s pauza) + 30 min (5s pulz + 6s pauza) za neustáleho chladenia 4 ˚C), centrifugovaná (40 min, 14 000 rpm, 4 ˚C) a prefiltrované cez nesterilný filter (0,45 µm). Lyzát o objeme 450 ml bol nanesený na Ni-NTA kolónu pomocou prietoku 0,6 ml.min-1 po dobu 12,6 hodín. Bunkový lyzát bol udržiavaný na ľade. Počas purifikácie proteínu PSL2 (graf č. 3) bol použitý nanášací pufer A (0,1 M CAPSO; 0,3 M NaCl; 0,1 mM MnCl2; 0,1 mM CaCl2; pH 11,0) a elučný pufer B (0,5 M imidazol; 0,1 M CAPSO; 0,3 M NaCl; 0,1 mM MnCl2; 0,1 mM CaCl2; pH 11,0). Počas purifikácie boli z Ni-NTA kolóny postupne zvyšujúcou sa silou imidazolu uvoľňované zachytené proteíny. Z každej frakcie boli vytvorené vzorky, ktoré boli podrobené SDS-PAGE (Obrázok č. 23). Proteíny na 10% polyakrylamidovom géli boli zviditeľnené pomocou Coomasie blue. Kvôli veľmi nízkej koncentrácii proteínu PSL2 vo vzorkách po elúcii imidazolom bola táto časť gélu ofarbená striebrom. Po vykonaní tohto kroku boli na géli pozorované prúžky proteínu o očakávanej veľkosti proteínu PSL2 s fúznym proteínom tioredoxínom (42 kDa). Vzorky z polyakrylamidového gélu boli poslané na MS analýzu. Počas čakania na výsledky bol vykonaný imunobloting s vybranými vzorkami z purifikácie proteínu PSL2 s tioredoxínom. 60 2.8. Imunobloting Pre potvrdenie prítomnosti proteínu PSL2 s tioredoxínom aspoň v minimálnom množstve vo vybraných vzorkách po purifikácii z predchádzajúcej kapitoly, boli niektoré vzorky po elúcii Graf č. 3: Záznam z purifikácie proteínu PSL2 s tioredoxínom produkovaného bunkami E. coli Rosetta2(DE3)pLysSRare vykonanej pomocou metaloafinitnej chromatografie na Ni-NTA kolóne (5 ml (3 x 2 cm)) Obrázok č. 23: Výsledok SDS-PAGE so vzorkami odoberanými počas purifikácie proteínu PSL2 s tioredoxínom pomocou metaloafinitnej chromatografie s využitím Ni-NTA kolóny (10% polyakrylamidový gél) 1 2 3 4 5 6 7 Legenda úsekov zo záznamu purifikácie: 1. Nezachytené proteíny 2. Elúcia 25 mM imidazolom 3. Elúcia 50 mM imidazolom 4. Elúcia 100 mM imidazolom 5. Elúcia 150 mM imidazolom 6. Elúcia 250 mM imidazolom 7. Elúcia 500 mM imidazolom 8. Elúcia MiliQ H2O 8 Legenda: vzorky po purifikácii pomocou FPLC: 1- Nezachytené proteíny 2- Nezachytené proteíny 3- Elúcia 25 mM imidazolom 4- Elúcia 50 mM imidazolom 5- Elúcia 50 mM imidazolom 6- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 7- Elúcia 50 mM imidazolom 8- Elúcia 100 mM imidazolom 9- Elúcia 150 mM imidazolom 10- Elúcia 250 mM imidazolom 11- Elúcia 500 mM imidazolom 12- CS 13- CI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 45 kDa 29 kDa 42 kDa 61 imidazolom podrobené imunoblotingu. Vo výsledku (obrázok č. 24) sa však nepodarilo proteín PSL2 potvrdiť ani v jednej z elučných frakcií. Po imunodetekcii sa zobrazil slabý prúžok proteínu očakávanej veľkosti (42 kDa) vo frakcii nerozpustných proteínov (CI), čo potvrdzuje produkciu proteínu PSL2 s tioredoxínom v E. coli. Na membráne sa po imunitnej reakcii zobrazili aj iné proteíny v rozpustnej frakcii (CS). Keďže sa vizualizovali aj ostatné proteíny o rôznych veľkostiach, výsledky tohoto experimentu nemožno považovať za adekvátne. Nedosiahnutie očakávaných výsledkov mohlo byť spôsobené použitím polyklonálnej protilátky Tioredoxin 1 (Polyclonal Rabbit Antibody). Z toho dôvodu sa pre väčšiu špecifickosť reakcie používajú monoklonálne protilátky (42), ktoré avšak neboli k dispozícii. Tento výsledok bol následne potvrdený aj výsledkami z MS analýzy. Prítomnosť proteínu PSL2 s fúznym tioredoxínom bola dokázaná len vo vzorkách v nenaviazaných proteínoch a v rozpustej frakcii (pozri príloha č. 7, vzorky č.1 - 4). Prúžky s podobnou veľkosťou akú má proteín PSL2 s tioredoxínom viditeľné po ofarbení striebrom patria GAPDH z Candida albicans. GAPDH je klasický enzým glykolýzy, s ktorým sa pracuje v našom laboratóriu. Gén tohto enzýmu bol modifikovaný tak, aby obsahoval na oboch koncoch polyhistidínovú kotvu (43). Pravdepodobne bola Ni-NTA kolóna najprv použitá na purifikáciu tohto rekombinantného enzýmu, a následne na purifikáciu proteínu PSL2 s tioredoxínom, v dôsledku čoho bola Obrázok č. 24: Detekcia proteínu PSL2 s tioredoxínom vo vybratých vzorkách z purifikácie pomocou imunoblotingu za využitia protilátky tioredoxín 1 (10% polyakrylamidové gély) Kontrolný gél Gél po imunoblotingu Nitrocelulózová membrána po imunodetekcii proteínu protilátkou Tioredoxín 1 PS PM CI CS C5 A1 NP PS PM CI CS C5 A1 NP PS PM CI CS C5 A1 NP Legenda: PS – Prestained Protein Marker, Broad Range, 7-175 kDa (NEB) PM – Štandard 6,5 -200 kDa (Applichem) CI – Nerozpustná frakcia CS – Rozpustné priteíny C5 – Elúcia 30% (150 mM) imidazolom – purifikácia na NiNTA kolóne A1 – Elúcia 5% (25 mM) imidazolom – purifikácia na NiNTA kolóne NP – Nezachytené proteíny – purifikácia na NiNTA kolóne 45 kDa 29 kDa 42 kDa 62 pozorovaná kontaminácia. Tá spôsobila skreslenie výsledkov purifikácie proteínu PSL2 s tioredoxínom. Odhliadnuc od prítomnosti kontaminácie, proteín PSL2 nebol prítomný vo vzorkách odoberaných počas elúcie imidazolom ani v malom množstve. Bola by možná optimalizácie podmienok purifikácie ale z časových dôvodov bolo od používania konštruktu pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 pre zisk proteínu PSL2 upustené. 2.9. Purifikácia PSL2 s dvomi oligohistidínovými kotvami (N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2) Bunky E. coli kmeňa BL21(DE3) transformované pomocou konštruktu N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 boli kultivované v 500 ml tekutého sterilného LB média. Takto získaná kultúra bola spracovaná a bunky boli rozsuspendované v 15 ml pufru A. Ďalej boli bunky dezintegrované (2,5 cyklu sonikácie) a centrifugované (45 min, 14000 rpm, 4 ˚C). So získaným lyzátom bola prevedená purifikácia použitím nanášacieho A pufru (20 mM Tris, 150 mM NaCl, 100 µM CaCl2, pH 8,0) a elučného pufru B (500 mM imidazol, 20 mM Tris, 150 mM NaCl, 100 µM CaCl2, pH 8,0). Nanášanie vzorky (12 ml) na kolónu Ni-NTA bolo prevedené prietokom 0,3 ml.min-1 . Po nanesení vzorky na Ni-NTA kolónu prebiehali všetky ostatné kroky purifikácie pri prietoku 1 ml.min-1 . Postupne zvyšujúca sa koncentrácia použitého imidazolu, spôsobovala na zázname (Graf č. 4) odpoveď v podobe píkov, ktoré mohli, ale nemuseli znamenať prítomnosť eluovaných proteínov, pretože aj samotný imidazol spôsobuje zmenu absorbancie. Keďže veľkosť píku nemusí znázorňovať prítomnosť proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom, na zistenie jeho zastúpenie v eluovaných frakciách a jeho čistoty, bola vykonaná elektroforéza eluovaných vzoriek. Obrázok č. 25 zobrazuje, že frakcie eluované pomocou imidazolu neobsahujú cieľový proteín PSL2 s NusA fúznym proteínom. V jamke č.4, ktorá reprezentuje podiel proteínu v nerozpustnej forme sa nachádza veľký prúžok proteínu, ktorý veľkosťou zodpovedá proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom (cca 86 kDa). Na základe podielu prítomnosti tohto proteínu v CS a CI frakciách (pozri v predchádzajúcej kapitole 2.5.2: Obrázok č. 19) bol vyvodený záver, že proteín je produkovaný výrazne, až výhradne, v rozpustnej forme. Avšak po porovnaní tohto záveru z testu rozpustnosti proteínu PSL2 s výsledkom vzoriek po purifikácii bolo usúdené, že pomocou purifikácie nebol získaný proteín PSL2 s NusA fúznym proteínom kvôli nedostatočnej dezintegrácii buniek. 63 Graf č. 4: Záznam z 1. purifikácie proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami produkovaného bunkami E. coli BL21(DE3) vykonanej pomocou afinitnej chromatografie na Ni-NTA kolóne, (5 ml (3 x 2 cm)) Obrázok č. 25:Gél po SDS-PAGE so vzorkami po 1. purifikácii proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami na Ni-NTA kolóne (10% polyakrylamidový gél) Preto pri nasledujúcej purifikácii boli bunky sonikované vo väčšom objeme pufru A (25 ml). Sonikácia prebehla klasicky v dvoch cykloch. Nanášanie vzorky (23 ml) na kolónu Ni-NTA bolo vykonané za prietoku 0,3 ml.min-1 . Purifikácia po nanesení vzorky prebiehala pri prietoku 1 ml.min-1 a pred 100% gradientom imidazolu bol zastavený prietok na 30 min. Na purifikáciu boli použité tie isté pufre ako pri predchádzajúcej purifikácii až na elučný pufer, Legenda: vzorky po purifikácii pomocou FPLC: 1. Pred indukciou 2. Po indukcii 3. CS 4. CI 5. Nezachytené proteíny 6. Elúcia 25 mM imidazolom 7. Elúcia 100 mM imidazolom 8. Elúcia 100 mM imidazolom 9. Elúcia 200 mM imidazolom 10. Elúcia 500 mM imidazolom 11. Elúcia 500 mM imidazolom + premývanie pumpy 2% SDS 12. Elúcia 2% SDS 13. Elúcia 6 M GuHCl 14. Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 86 kDa 116 kDa 66 kDa Legenda úsekov zo záznamu purifikácie: 1. Nezachytené proteíny 2. Elúcia 25 mM imidazolom 3. Elúcia 100 mM imidazolom 4. Elúcia 200 mM imidazolom 5. Elúcia 500 mM imidazolom 6. Elúcia 500 mM imidazolom + pemývanie pumpy A pomocou 2% SDS 7. Elúcia 2% SDS 8. Elúcia 6 M GuHCl 9. odpad 64 v ktorom bola zvýšená koncentrácia imidazolu na 1 M. Graf č. 5 zobrazuje píky, napovedajúce, z ktorých frakcií bolo treba odobrať vzorky pre vykonanie SDS-PAGE. Obrázok č. 26 znázorňuje, že väčšina rekombinantného proteínu PSL2 o predpokladanej veľkosti cca 86 kDa je v nezachytených frakciách a vo frakciách po elúcii 2% SDS. Naopak, Legenda úsekov zo záznamu purifikácie: 1. Nezachytené proteíny 2. Elúcia 30 mM imidazolom 3. Elúcia 100 mM imidazolom 4. Elúcia 1 M imidazolom 5. Elúcia MiliQ H2O 6. Elúcia 2% SDS Obrázok č. 26: Gél po SDS:PAGE so vzorkami po 2. purifikácii proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami na Ni-NTA kolóne (10% polyakrylamidový gél) Graf č. 5: Záznam z 2. purifikácie proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami produkovaného bunkami E. coli BL21(DE3) vykonanej pomocou afinitnej chromatografie na Ni-NTA kolóne, (5 ml (3 x 2 cm)) 2 3 4 5 61 Legenda: vzorky po purifikácii pomocou FPLC: 1. CS 2. – 3. CI 4. – 5. Pred indukciou 6. Po indukcii 7. Nezachytené frakcie 8. Elúcia 30 mM imidazolom 9. Elúcia 100 mM imidazolom 10. Elúcia 1 M imidazolom 11. Elúcia 1 M imidazolom 12. Elúcia MiliQ H2O 13. Elúcia 2% SDS 14. Elúcia 2% SDS 15. Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 116 kDa 66 kDa 86 kDa 65 tento proteín eluovaný pomocou 1 M imidazolu je vo veľmi nízkej koncentrácii a nevhodnej čistote. Preto bola pomocou koncentračných skúmaviek (Vivaspin® 20) zakoncentrovaná frakcia po elúcii MiliQ vodu (z 11 ml na 0,9 ml o c = 0,32 mg.ml-1 ). Vzorka zakoncentrovaného proteínu PSL2 bola odovzdaná na vykonanie funkčných štúdii pomocou metódy povrchovej plazmónovej rezonancie (SPR) do zdieľaného laboratória inštitúcie Interakcie a kryštalizácie biomolekúl (CEITEC). Tento proteín nepreukazoval žiadnu väzbovú aktivitu k imobilizovaným sacharidom na použitých čipoch. Na podporu lepšieho zbaľovania proteínu PSL2 a pre obmedzenie zachytávania nešpecifických proteínov na kolónu bola zvýšená koncentráciu solí v pufroch A aj B (150 mM → 300 mM). Bunky BL21(DE3) transformované konštruktom N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 boli kultivované v 500 ml sterilného LB média. Pri dosiahnutí optimálnej optickej denzity (OD600 ~ 0,5) bola bunková kultúra indukovaná zníženou koncentráciou IPTG (0,25 mM), čím sa znížila rýchlosť tvorby proteínu PSL2 resp. jeho nadprodukcia. Tým bol získaný čas na lepšie a pomalšie zbalenie proteínu PSL2. Kultúra bola pred sonikáciou rozsuspendovaná v 40 ml pufru A. Sonikácia takto pripravených buniek prebiehala v 2 opakovaniach. Nanášanie lyzátu (40 ml) na kolónu Ni-NTA bolo vykonané za prietoku 0,3 ml.min-1 . Ostatné kroky purifikácie prebiehali pri prietoku 1 ml.min-1 . Pred 100% gradientom imidazolu bol pozastavený prietok po dobu 45 min. Na purifikáciu boli použité pufre: nanášací A pufer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 100 µM CaCl2, pH 8,0) a elučný B pufer (1M imidazol, 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 100 µM CaCl2, pH 8,0), pričom bola na elúciu použitá aj 50 mM EDTA (v roztoku 20 mM Tris, 300 mM NaCl) (Graf č.6). 66 Graf č. 6: Záznam z 3. purifikácie proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami produkovaného bunkami E. coli BL21(DE3) vykonanej pomocou afinitnej chromatografie na Ni-NTA kolóne (5 ml (3 x 2 cm)) Frakcie po elúcii pomocou EDTA boli dialyzované ((3 x 10 l) 20 mM Tris, 100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, pH 8,0), pričom do čreva bol pridaný roztok 30 mM CaCl2 pre navrátenie iónov Ca2+ do pufru, ktoré boli vyviazané EDTA. Získaný proteín PSL2 bol zakoncentrovaný Obrázok č. 27: Gél po SDS-PAGE so vzorkami po 3. purifikácii proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami na Ni-NTA kolóne (10% polyakrylamidový gél) 1 2 3 4 5 6 7 odpad Legenda úsekov zo záznamu purifikácie: 1. Nezachytené proteíny 2. 100 mM imidazol 3. 500 mM imidazol 4. 1M imidazol 5. MiliQ H2O 6. 50 mM EDTA 7. 2%SDS Legenda: vzorky po purifikácii pomocou FPLC: 1. CS 2. CI 3. Pred indukciou 4. Po indukcii 5. Nezachytené proteíny 6. Elúcia 100 mM imidazolom 7. Elúcia 500 mM imidazolom 8. Elúcia 1 M imidazolom 9. Elúcia 1 M imidazol 10. Elúcia 1 M imidazol 11. Elúcia MiliQ H2O 12. Elúcia 50 mM EDTA 13. Elúcia 50 mM EDTA 14. Elúcia 2% SDS 15. Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 116 kDa 66 kDa 86 kDa 67 na 0,11 ml o c = 1,02 mg.ml-1 . Tento proteín bol podrobený CD spektroskopii a hemaglutinácii. Proteín PSL2 po elúcii MiliQ vodou bol tiež zakoncentrovaný za zisku 0,8 ml o c = 0,23 mg.ml-1 (koncentrácia proteínu bola meraná spektrofotometricky pri 280 nm). Časť proteínu eluovaného MiliQ vodou bol tiež podrobený hemaglutinácii, CD spektroskopii a SPR. Zbytok proteínu eluovaného MiliQ vodou bol lyofilizovaný (Free Zone 6 (Labconco)) a zamrazený na -20 ˚C. Pomocou MS analýzy bola potvrdená prítomnosť proteínu PSL2 s NusA proteínom v oboch vzorkách (príloha č. 8). Väčšina PSL2 proteínu sa po purifikácii stále nachádza v nezachytenej frakcii a vo frakcii po elúcii 2% SDS (Obrázok č. 27). Táto skutočnosť sa dá vysvetliť rôznymi spôsobmi. Prítomnosť proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom v nezachytených frakciách môže byť vysvetliteľná presiahnutou kapacitou kolóny, keďže proteín PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami je veľký 84 kDa a pri naviazaní na kolónu sa uplatňujú stérické efekty. Rovnako v bunkovom lyzáte nanášanom na Ni-NTA kolónu môže byť rádovo zhodný pomer molárnych koncentrácií proteínu PSL2 a Ca+2 iónov, ktoré boli do pufru pridávané v podobe CaCl2 (c = 100 µM). To môže zapríčiňovať, že Ca+2 ióny vytláčajú proteín PSL2 z väzbového miesta na kolóne. Tiež platí, že čím je nižšie pH pufru, tým je nižšia interakcia oligohistídínovej kotvy s matricou. Pre overenie týchto hypotéz bol vykonaný porovnávací test (pozri Graf č. 7, Obrázok č. 28 a Graf č. 8, Obrázok č. 29), pri ktorom boli bunky BL21(DE3) obsahujúce konštrukt N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 sonikované v dvoch rozdielnych pufroch (≠ pH, s a bez prídavku Ca2+ iónov). 1. test - pufer A1: 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 100 µM CaCl2, pH 8,0 pufer B1: 1 M imidazol, 20 mM Tris, 300 mM NaCl, 100 µM CaCl2, pH 8,0 2. test - pufer A2: 20 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 6,0 pufer B2: 1 M imidazol, 20 mM Tris, 300 mM NaCl, pH 6,0 V oboch prípadoch bol pelet z 500 ml kultúry dezintegrovaný v dvoch opakovaniach, rozsuspendovaný v 40 ml pufru A (1 alebo 2). Na kolónu bol nanášaný bunkový lyzát o zníženom objeme 10 ml (rýchlosťou prietoku 0,3 ml.min-1 , ostatné kroky purifikácie prebiehali za prietoku 1,0 ml.min-1 ) kvôli zisteniu vplyvu stérických efektov na väzbu proteínu PSL2 s dvomi oligohistidínovými kotvami na Ni-NTA kolónu. 68 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Legenda: vzorky po purifikácii pomocou FPLC: 1. Nezachytené proteíny 2. Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 3. Elúcia 100 mM imidazolom 4. Elúcia 1 M imidazolom 5. Elúcia 1 M imidazolom 6. Elúcia 1 M imidazolom 7. Elúcia 2% SDS 8. – 9. Pred indukciou 10. Po indukcii 11. – 12. CS 13. CI 116 kDa 66 kDa 86 kDa Graf č. 7: Záznam z 4. purifikácie proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami produkovaného bunkami E. coli BL21(DE3) vykonanej pomocou afinitnej chromatografie na Ni-NTA kolóne (5 ml (3 x 2 cm)), bunkový lyzát nanášaný v objeme 10 ml, pH 8,0 Obrázok č. 28: Gél po SDS-PAGE so vzorkami po 4. purifikácii proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami na Ni-NTA kolóne (10% polyakrylamidový gél) Legenda úsekov zo záznamu purifikácie: 1. Nezachytené proteíny 2. Elúcia 100 mM imidazolom 3. Elúcia 1 M imidazolom 4. Elúcia 2% SDS 69 Pri porovnaní grafov č. 7 a 8 napriek podobnému priebehu purifikácie, sa pri pH 6,0 púšťa relatívne málo nečistôt. Už v tomto kroku sa graf č. 8 výrazne líši, pretože po elúcii nečistôt 100 mM imidazolom (pík 2) sa samovoľne z kolóny pustili ďalšie proteíny, ktoré boli zaznamené v podobe malého píku (pík 3). Naopak po elúcii pomocou 1M imidazolu sa vytvoril vysoký pík, ako odozva na pustenie sa ďalších proteínov z kolóny. Z Obrázka č.29 vyplýva, že proteíny, ktoré sa púšťali 1M imidazolom sú fragmenty proteínu PSL2 s NusA fúznym Graf č. 8 Záznam z 5. purifikácie proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami produkovaného bunkami E. coli BL21(DE3) vykonanej pomocou afinitnej chromatografie na Ni-NTA kolóne (5 ml (3 x 2 cm)), bunkový lyzát nanášaný v objeme 10 ml, pH 6,0 Obrázok č. 29: Gél po SDS-PAGE so vzorkami po 5. purifikácii proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami na Ni-NTA kolóne (10% polyakrylamidový gél) Legenda úsekov zo záznamu purifikácie: 1. Nezachytené proteíny 2. Elúcia 100 mM imidazolom 3. Elúcia 100 mM imidazolom 4. Elúcia 1 M imidazolom 5. Elúcia 2% SDS Legenda: vzorky po purifikácii pomocou FPLC: 1. Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 2. Nezachytené proteíny 3. Elúcia 100 mM imidazolom 4. Elúcia 100 mM imidazolom samovoľne 5. Elúcia 1 M imidazolom 6. Elúcia 1 M imidazolom 7. Elúcia 1 M imidazolom 8. Elúcia 2% SDS 9. CS 86 kDa 116 kDa 66 kDa 1 2 3 4 5 6 7 8 9 70 proteínom a dvomi oligohistodínovými kotvami. Tento fakt bol potvrdený aj MS analýzy vybraných prúžkov zo žltého rámčeka (pozri príloha č. 9). Po porovnaní veľkostí prúžkov (Obrázok č. 29) proteínov eluovaných pomocou 1M imidazolu (jamka č. 5 a 6) a po samovoľnej elúcii 100mM imidazolom (jamka č. 4) bolo usúdené, že fragmenty cieľového proteínu sa začali z kolóny púušťať už pri nižšej koncentrácii imidazolu. Pomocou purifikácie pri pH 6,0 sa síce podarilo odstrániť proteín záujmu z nezachytených frackií a z frakcie po elúcii pomocou 2% SDS, ale zároveň nízke pH spôsobilo jeho štiepenie ešte pred nanášaním na kolónu. Ak by sa aj naďalej uvažovalo o znižovaní pH pufru, muselo by sa preskúmať, aké pH by bolo pre proteín PSL2 optimálne. Vďaka rozštiepeniu proteínu pri nízkom pH sa nepodarilo overiť teóriu o rádovo zhodnom pomere molárnych koncentrácií proteínu PSL2 a Ca+2 iónov. V týchto dvoch purifikáciách bol v porovnaní s 3. purifikáciou na kolónu nanesený ¼ objem lyzátu ale na Obrázku č. 28 je znovu zobrazený veľký prúžok proteínu PSL2 v nezachytených frakciách. Tento výsledok popiera teóriu o tom, že v predchádzajúcich prrifikáciách bola prekročená kapacita Ni-NTA kolóny. Ďalšími možnosťami nenaviazania proteínu PSL2 na kolónu môže byť nesprávne zbalenie proteínu PSL2 pri dezintegrácii buniek alebo veľmi krátka doba počas ktorej je proteín PSL2 stabilný po sonikácii buniek. To by sa dalo riešiť prídavkami aditív alebo stabilizátorov do pufru. Naopak prítomnosť proteínu PSL2 vo frakcii eluovanej 2% SDS môže byť spôsobená vysokou afinitou dvoch oligohostidínových kotiev ku Ni-NTA kolóne. Sila väzby medzi proteínom a iónom kovu je ovplyvnená viacerými faktormi. Patria sem dĺžka, pozícia a doba počas ktorej bola oligohistidínová kotva vystavená možnosti väzby na kolónu, typ použitého iónu a matrice a hodnoty pH pufru. Pre overenie tejto teórie by sa dali použiť kolóny s menšou afinitou ku histidínom a teda ku oligohistidínovej kotve. Táto afinita sa dá regulovať používaním rôznych chelatačných skupín naviazaných na matricu. Najpoužívanejšie sú IDA a NTA. Sila akou tieto matrice dokážu viazať ión (Ni2+ ) je daná počtom väzieb. NTA je 4 mocná a IDA je 3 mocná. Obe viaš viažu Ni2+ pomocou 2 väzieb. Z tohto dôvodu má IDA nižšiu afinitu ku Ni2+ iónom, ktoré sa počas purifikácie môžu vyplavovať skôr. Pre purifikáciu rekombinantných proteínov sa používajú Cu2+ , Ni2+ , Zn2+ , Co2+ ióny naviazané na spomínané chelatačné skupiny. Od Cu2+ vzrastá špecifickosť, ale klesá afinita ku proteínom. Mohol by sa použiť napríklad Co2+ ión, ktorý má nízku afinitu, a zároveň vytvára vysoko špecifickú väzbu, takže znižuje prítomnosť nežiadúcich proteínov v eluáte. 71 Ak by rekombinantný proteín PSL2 naozaj vykazoval silnú afinitu ku Ni2+ iónom na kolóne vďaka dvom oligohostidínovým kotvám, dala by sa využiť prítomnosť miesta pre TEV proteázu v rekombinantnom proteíne PSL2 (N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_PSL2), ktorá by odštiepila proteín PSL2 z kolóny v mieste medzi oligohistidínovými kotvami a samotným proteínom PSL2. Táto reakcia je avšak zdĺhavá a finančne náročná. Proteín PSL2 môže byť už pri nanášaní na kolónu čiastočne vyzrážaný alebo zle zbalený (ako bolo vyššie spomenuté), a preto sa môže držať na kolóne inak ako cez oligohistidínovú kotvu. Takýto proteín sa po elúcii 2% SDS už len rozvoľní a pustí z kolóny. Ak by táto úvaha bola správna, nebolo by možné eluovať proteín PSL2 pomocou EDTA. Túto hypotézu potvrdzuje polyakrylamidový gél so vzorkami z 3. purifikácie (Obrázok č. 27), kedy sa proteín PSL2 eluoval pomocou EDTA len vo veľmi malom množstve. Tento výsledok značí, že proteín na kolóne pravdepodobne nedrží silno cez oligohistidínové kotvy, ale práve naopak, že kotvy pravdepodobne nie sú využívané na väzbu na kolónu a proteín sa na kolónu viaže inak ako cez oligohistidínové kotvy na svojich koncoch. Aj napriek tomu, že sa sekvenáciou potvrdila správna príprava DNA konštruktu s vloženým génom psl2 s oligohistidínovými kotvami na jeho N-konci, nemusí sa takýto rekombinantný proteín na kolónu nutne cez tieto kotvy viazať. To môže byť spôsobené zbalením proteínového N-/C-konca dovnútra proteínu (44). Avšak predikcia 3D štruktúry na základe aminokyselinového sekvenčného preloženia proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami pomocou bioinformatického nástroja Phyre2 (Obrázok č. 30) zobrazuje, že by sa proteín mal zbaľovať tak, aby jeho N- (červená farba) aj C- (modrá farba) koniec boli voľne prístupné. Tento program našiel 50% zhodu medzi proteínmi PSL2 o ConA (45). Obrázok č. 30: predikovaná 3D štruktúra rekombinantného proteínu N-6xHis_NusA_6xHis_PSL2 na základe sekvenčnej podobnosti pomocou bioinformatického nástroja Phyre2 (45); dúhové zobrazenie od červenej (N-koniec) po modrú farbu (C- koniec) 72 2.10. CD spektroskopia Pomocou CD spektroskopie bolo študované zbalenie proteínu PSL2 získaného z 3. purifikácie po elúcii pomocou EDTA ako aj po elúcii pomocou MiliQ vody. Graf č. 9 zobrazuje krivky z merania proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom (c = 0,44 mg.ml-1 ) po elúcii pomocou 50 mM EDTA. CD spektroskopickým meraniam boli podrobené vzorky po filtrácii (veľkosť pórov 0,2 µm) ako aj vzorky nefiltrované. Proteín po elúcii MiliQ vodou poskytol podobné výsledky.Výsledky meraní potvrdzujú, že sa proteín PSL2 s NusA fúznym proteínom zbaľuje správne. Podľa tvaru kriviek je sekundárna štruktúra tohto proteínu z časti tvorená α-helixom a z časti β- skladaným listom. Program Phyre2 predikoval zloženie sekunárnej štruktúry proteínu PSL2 s NusA proteínom s 30 % obsahom β-skladaného listu a 34% obsahom α-helixu (Obrázok č. 30). Graf č. 9: Výsledné krivky z CD spektroskopie - proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami po elúcii pomocou 100 mM EDTA z 3. purifikácie, nefiltrovaná vzorka, c = 0,44 mg.ml-1 , po odčítaní signálu pufru 2.11. Testy aktivity Hemaglutinácia Proteín PSL2 s NusA fúznym proteínom (c = 1,02 mg.ml-1 ) získaný z 3. purifikácie po elúcii pomocou 50 mM EDTA bol použitý na hemaglutinačné testy v koncentrovanej ako aj 73 v zriedenej forme (riedenie 1:1 s pufrom A). Tak isto bol podrobený hemaglutinácii proteín PSL2 získaný z tej istej purifikácie elúciou pomcou MiliQ vody o c = 0,32 mg.ml-1 . Na experiment boli použité krvné skupiny A+, B+, 0-. Pri žiadnej podmienke neprebehla hemaglutinácia (Obrázok č. 31), čo môže byť spôsobené špecifickosťou voči iným cukrom ako tým, ktoré sú exponované na povrchu erytrocytov jednotlivých krvných skupín. Ako je spomínané v kapitole (Lektíny v hrachu siatom), PSL2 proteín by mohol byť špecifický voči D-manóze a D-glukóze. Obrázok č. 31: Výsledky hemaglutinácie pri použití krvných skupín 0-, A+, B+ s proteínom PSL2 s NusA fúznym proteínom a dvomi oligohistidínovými kotvami získaným elúciou pomocou EDTA; P.K.= pozitívna kontrola; N.K. = negatívna kontrola N.K. P.K. 0,5 mg.ml-1 PSL2 EDTA 1 mg.ml-1 PSL2 EDTA 0,23 mg.ml-1 PSL2 MiliQ H2O 0- A+ B+ 74 -500 -400 -300 -200 -100 0 100 200 300 400 -100 0 100 200 300 400 Čas s RU Väzba na imobilizovanú L-fukózu Väzba na imobilizovanú D-manózu Väzba na imobilizovaný Neu5Ac Teória o možnej špecifickosti proteínu PSL2 voči D-manóze bola čiastnočne testovaná aj v spolupráci so zdieľaným laboratóriom Interakcie a kryštalizácie biomolekúl (CEITEC). Obrázok č. 32: SPR krivky proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom (c = 0,32 mg.ml-1 ), ktorý bol eluovaný MiliQ vodou, čip HC200M (Xantec) Boli vykonané testy SPR na čipe HC200M (Xantec) (Obrázok č. 32). Najvyššia odozva väzby proteínu PSL2 s NusA fúznym proteínom, ktorý bol eluovaný MiliQ vodou (c = 0,32 mg.ml- 1) je na kanáli s D-manózou. Pre potvrdenie interakcie by boli potrebné ešte ďalšie experimenty, na ktoré už nezostal čas. 75 V.Záver Jedným z množstva lektínov, ktorým sa zaoberá výskumná skupina Glykobiochémie je hypotetický lektín PSL2. Na jeho prípravu a následné štruktúrne - funkčné štúdie bola zameraná táto diplomová práca. Bolo nadviazané na predchádzajúce výsledky výskumu proteínu PSL2. Gén psl2 bol v minulosti na našom pracovisku vložený do rôznych druhov DNA konštruktov určených na expresiu génu v odlišných expresných organizmoch. Proteín PSL2 v rozpustnej forme sa, avšak, pomocou takto modifikovaných buniek expresných organizmov E. coli, P. pastoris a S. cerevisiae neporadilo získať v dostatočnom množstve. V rámci diplomovej práce boli vykonané testy expresie génu psl2 vloženého do konštruktu pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2 (vopred pripravený na našom pracovisku) v týchto 4 kmeňoch buniek E. coli: Arctic Express(DE3)RIL (Stratagene), BL21(DE3) (Stratagene), Tuner(DE3) (Novagen), Rosetta2(DE3)pLysSRare (Novagen). Napriek rozsiahlym testom produkcie proteínu PSL2 nebola úspešne nájdená podmienka pre tvorbu dostatočného množstva proteínu PSL2 v rozpustnej forme. Z toho dôvodu sa pristúpilo k dizajnu a príprave ďalších 4 konštruktov. Bol vytvorený návrh na vloženie génu psl2 v dvoch podobách do konštruktu pET-44b. Výhodou týchto konštruktov bolo, že obsahujú gén pre vysoko rozpustný NusA fúzny proteín. Prvý konštrukt bol navrhnutý s oligohistidínovou kotvou na C-konci, druhý konštrukt obsahoval na N-konci dve oligohistidínové kotvy. Oba konštrukty boli určené na produkciu proteínu PSL2 v bakteriálnych bunkách E. coli. Podarilo sa pripraviť konštrukt pET-44b_N- 6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2, ktorým boli transformované tieto kmene buniek E. coli: Arctic Express(DE3)RIL a Rosetta2(DE3)pLysSRare. Bola optimalizovaná produkcia proteínu PSL2 v rozpustnej forme, následne bol proteín purifikovaný a štruktúrne -funkčne testovaný. Počas diplomovej práce boli pripravené ďalšie 2 konštrukty určené pre produkciu PSL2 proteínu v expresnom organizme L.tarentolae. Jeden z pripravených vektorov bol následne úspešne transfekovaný do buniek týchto prvokov. 76 VI.Summary One of the lectins of inetrest of the research group Glycobiochemistry is the hypothetical lectin PSL2. This Master's thesis is foccused on the preparation and subsequent structural - functional study of PSL2 protein. We continued on previous research results of PSL2 protein production. psl2 gene was formerly embedded into different types of DNA constructs designed for gene expression in different organisms in our laboratory. Using such modified expression organisms E. coli, P. pastoris or S. cerevisiae PSL2 protein was not obtained in his soluble form in sufficient quantity. Testing the expression of the pls2 gene which was inserted into the construct pRSET A_Thio (HP) TEV_psl2 (previously prepared in our workplace) in these 4 strains of E. coli Arctic Express (DE3) RIL (Stratagene), BL21 (DE3) ( Stratagene), Tuner (DE3) (Novagen), Rosetta2 (DE3) pLysSRare (Novagen) were performed in this Master´s thesis. Despite of the extensive testing of the PSL2 protein production a condition for the production of adequate quantity of PSL2 protein in his soluble form has not been successfully found. Because of this fact, it was acceded to design and prepare another 4 constructs. A design to insert two forms of gene psl2 into construct pET-44b was created. The advantage of these constructs was a content of the gene for the highly soluble NusA fusion protein. The first construct was designed with oligohistidine tag at the C-terminus, the second construct contains two N-terminal oligohistidine tags. These two constructs were designed for the PSL2 protein production in bacterial cells of E. coli. The preparation of the construct pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV_psl2 was managed by which the transformation of these strains of E. coli cells: Arctic Express (DE3) RIL and Rosetta2 (DE3) pLysSRare was performed. PSL2 protein production in soluble form was optimized, then the protein was purified and the structural and functional tests were done. Another 2 constructs for the production of the PSL2 protein in expression orgamisms L.tarentolae were prepared and designed during the Master´s thesis. Subsequently, one of the prepared vectors was successfully transfected into cells of these protozoa. 77 VII.Zoznam použitej literatúry 1. Sharon N, Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules. Glycobiology. 01. november 2004;14(11):53R – 62R. 2. Sumner JB, Howell SF. Identification of Hemagglutinin of Jack Bean with Concanavalin A. J Bacteriol. 01. august 1936;32(2):227–37. 3. Sharon N, Lis H. Lectins. Springer Science & Business Media; 2007. 464 s. 4. Lam SK, Ng TB. Lectins: production and practical applications. Appl Microbiol Biotechnol. 03. október 2010;89(1):45–55. 5. Berg JM, Tymoczko JL, Stryer L, Stryer L. Biochemistry. 5th ed. New York: W.H. Freeman; 2002. 1 s. 6. Sharon N. Lectins: carbohydrate-specific reagents and biological recognition molecules. J Biol Chem. 02. február 2007;282(5):2753–64. 7. Hu S, Wong DT. Lectin microarray. Proteomics Clin Appl. február 2009;3(2):148–54. 8. Jiang Q-L, Zhang S, Tian M, Zhang S-Y, Xie T, Chen D-Y, et al. Plant lectins, from ancient sugar-binding proteins to emerging anti-cancer drugs in apoptosis and autophagy. Cell Prolif. 01. február 2015;48(1):17–28. 9. Ng TB, Ngai PHK, Xia L. An agglutinin with mitogenic and antiproliferative activities from the mushroom Flammulina velutipes. Mycologia. 01. marec 2006;98(2):167–71. 10. Vasconcelos IM, Oliveira JTA. Antinutritional properties of plant lectins. Toxicon. 15. september 2004;44(4):385–403. 11. Einspahr H, Parks EH, Suguna K, Subramanian E, Suddath FL. The crystal structure of pea lectin at 3.0-A resolution. J Biol Chem. 15. december 1986;261(35):16518–27. 12. Varki A, Etzler ME, Cummings RD, Esko JD. Discovery and Classification of GlycanBinding Proteins. V: Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, et al., editori. Essentials of Glycobiology. 2nd vyd. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009 13. Van Damme E. Plant Lectins: A Composite of Several Distinct Families of Structurally and Evolutionary Related Proteins with Diverse Biological Roles. Crit Rev Plant Sci. november 1998;17(6):575–692. 14. Harper SM, Crenshaw RW, Mullins MA, Privalle LS. Lectin Binding to Insect Brush Border Membranes. J Econ Entomol. 01. október 1995;88(5):1197–202. 15. Velkov VV, Medvinsky AB, Sokolov MS, Marchenko AI. Will transgenic plants adversely affect the environment? J Biosci. september 2005;30(4):515–48. 16. Edwards GA, Hepher A, Clerk SP, Boulter D. Pea lectin is correctly processed, stable and active in leaves of transgenic potato plants. Plant Mol Biol. júl 1991;17(1):89–100. 78 17. Brady PG, Vannier AM, Banwell JG. Identification of the dietary lectin, wheat germ agglutinin, in human intestinal contents. Gastroenterology. august 1978;75(2):236–9. 18. Noah ND, Bender AE, Reaidi GB, Gilbert RJ. Food poisoning from raw red kidney beans. Br Med J. 19. júl 1980;281(6234):236–7. 19. Sen D, Mandal DK. Pea lectin unfolding reveals a unique molten globule fragment chain. Biochimie. marec 2011;93(3):409–17. 20. Pak JH, Hendrickson T, Dobres MS. Predicted sequence and structure of a vegetative lectin in Pisum sativum. Plant Mol Biol. marec 1992;18(5):857–63. 21. Khan F, Khan MI. Fungal Lectins: Current Molecular and Biochemical Perspectives. Int J Biol Chem. 01. január 2011;5(1):1–20. 22. Varrot A, Basheer SM, Imberty A. Fungal lectins: structure, function and potential applications. Curr Opin Struct Biol. október 2013;23(5):678–85. 23. Hamshou M, Smagghe G, Van Damme EJM. Analysis of lectin concentrations in different Rhizoctonia solani strains. Commun Agric Appl Biol Sci. 2007;72(3):639–44. 24. Pemberton RT. Agglutinins (lectins) from some british higher fungi. Mycol Res. 01. marec 1994;98(3):277–90. 25. Varki A, Cummings RD, Esko JD, Freeze HH, Stanley P, Bertozzi CR, et al., editori. Essentials of Glycobiology. 2nd vyd. Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2009 26. Ofek I, Doyle RJ. Bacterial Lectins as Adhesins. V: Bacterial Adhesion to Cells and Tissues. Springer US; 1994 [cit 07. máj 2016]. s. 94–135. 27. Lindhorst TK. CHAPTER 1. Small Molecule Ligands for Bacterial Lectins: Letters of an Antiadhesive Glycopolymer Code. V: Becer CR, Hartmann L, editori. RSC Polymer Chemistry Series. Cambridge: Royal Society of Chemistry; 2015 28. Knight SD, Bouckaert J. Structure, Function, and Assembly of Type 1 Fimbriae. V: Lindhorst TK, Oscarson S, editori. Glycoscience and Microbial Adhesion. Springer Berlin Heidelberg; 2009 29. Ohlsen K, Oelschlaeger TA, Hacker J, Khan AS. Carbohydrate Receptors of Bacterial Adhesins: Implications and Reflections. V: Lindhorst TK, Oscarson S, editori. Glycoscience and Microbial Adhesion. Springer Berlin Heidelberg; 2008 30. Bañuls A-L, Hide M, Prugnolle F. Leishmania and the Leishmaniases: A Parasite Genetic Update and Advances in Taxonomy, Epidemiology and Pathogenicity in Humans. V: J.R. Baker RM and DR, editor. Advances in Parasitology. Academic Press; 2007 31. Heyneman D. Immunology of leishmaniasis. Bull World Health Organ. 1971;44(4):499–514. 32. Basile G, Peticca M. Recombinant Protein Expression in Leishmania tarentolae. Mol Biotechnol. 25. september 2009;43(3):273–8. 33. Parodi AJ. N-glycosylation in trypanosomatid protozoa. Glycobiology. jún 1993;3(3):193–9. 79 34. Desjeux P. Leishmaniasis: current situation and new perspectives. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. september 2004;27(5):305–18. 35. Singleton P. Bacteria in biology, biotechnology, and medicine 36. Cooper GM. The Cell. 2nd vyd. Sinauer Associates; 2000. 37. E. coli Expression Strains Information | NEB [Internet]. [cit 07. máj 2016]. Cit z: https://www.neb.com/products/competent-cells/e-coli-expression-strains/e-coli-expression- strains 38. Manual GenElute Plazmid Miniprep Kit [Internet]. [cit 04. apríl 2016]. Cit z: https://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/pln70bul.pdf 39. Raymond KW. General Organic and Biological Chemistry. John Wiley & Sons; 2009. 1257 s. 40. ArcticExpress Competent Cells [Internet]. [cit 31. marec 2016]. Cit z: http://www.genomics.agilent.com/article.jsp?pageId=468 41. 70956 | RosettaTM (DE3)pLysS Competent Cells - Novagen [Internet]. [cit 31. marec 2016]. Cit z: http://www.merckmillipore.com/CZ/cs/product/Rosetta%e2%84%a2(DE3)pLysS- Competent-Cells,EMD_BIO-70956 42. Costa S, Almeida A, Castro A, Domingues L. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system. Front Microbiol. 19. február 2014 43. Lipman NS, Jackson LR, Trudel LJ, Weis-Garcia F. Monoclonal Versus Polyclonal Antibodies: Distinguishing Characteristics, Applications, and Information Resources. ILAR J. 01. január 2005;46(3):258–68. 44. Borotová P. Příprava a charakterizace glyceraldehyd-3-fosfátdehydrogenasy. 2015 [cit 10. máj 2016]. Cit z: https://is.muni.cz/auth/th/409183/prif_b/BakalarskaPraca_PBorotova.pdf 45. Fleková A. Klonování a charakterizace glykosyltransferas z lidského patogenu Aspergillus fumigatus. [cit 07. apríl 2016]. Cit z: https://is.muni.cz/auth/th/211761/prif_m/Diplomova_prace_Andrea_Flekova.pdf 46. Kelley LA, Mezulis S, Yates CM, Wass MN, Sternberg MJE. The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis. Nat Protoc. jún 2015;10(6):845–58. VIII.PRÍLOHY Príloha č. 1 Návrh primerov pre konštrukt pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV psl2  Restriktázy: SpeI HF a XhoI Templát: pMAT_N-6xHis_TEV_psl2: 5´ATGAAATTCCATCACCATCACCATCACGAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAA CTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTGCTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGG CTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCACTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCA CTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTCCATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTT CCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTTGAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTT TGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGAGATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGG GTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACAGATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTA ACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACATCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGA CTGTTAGATACAACTTCGTTTCCGGTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCAT CCAACACTTTGACTGCTGTTATCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAAC GTTGACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATT GCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGTAAC ATCGTTTCCCAGGTTTAA 3´ PRIMERY:  priamy: č.622 5´ GCCACTAGTATGAAATTCCATCACCATCACC 3´ Dĺžka 31 Obsah GC 45.2 % T. topenia 60.4 ºC  reverzný: č.623 5´ CGCTCGAGTTAAACCTGGGAAACGATG 3´ Dĺžka 27 Obsah GC 51.9 % T. topenia 61.2 ºC His kotva TEV proteáza psl2 C-koniec N-koniec Pufer (100% activity): CutSmart Návrh primerov pre konštrukt pET-44b_C-6xHis_TEV psl2  Restriktázy: SpeI HF a HindIII HF Templát: pRSET A_Thio(HP)TEV_psl2(bez 6xHis): 5´GAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTG CTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCA CTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTC CATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTT GAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGA GATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACA GATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACATCG GTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGTTAGATACAACTTCGTTTCCGGTTCCT TGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATCCAACACTTTGACTGCTGTTATCACTTACG AGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAACGTTGACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGAC GTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATTGCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCT TCACTTCCAACTTGGAGGCTACTGGTAACATCGTTTCCCAGGTTGCG 3´ PRIMERY:  priamy: č.624 5´ CGGACTAGTCCGGAGAACCTGTATTTTCAGTCC 3´ Dĺžka 33 Obsah GC 51.5 % T. topenia 63.4 ºC  reverzný: č.625 5´ CCAAGCTTCGCAACCTGGGAAACGATG 3´ LENGTH 27 Obsah GC 55.6 % T. topenia 63.7 ºC psl2 náhrada TAA stop kodónu za Ala TEV protease C-koniec N-koniec Pufer (100% activity): CutSmart Návrh primerov pre pLEXSY-IE-blecherry 4 N-6xHis_TEV_psl2 - sig.sekvencia  Restriktázy: NcoI a NotI-HF Templát: pMAT_N-6xHis_TEV_psl2: 5´ATGAAATTCCATCACCATCACCATCACGAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAA CTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTGCTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGG CTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCACTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCA CTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTCCATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTT CCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTTGAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTT TGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGAGATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGG GTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACAGATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTA ACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACATCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGA CTGTTAGATACAACTTCGTTTCCGGTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCAT CCAACACTTTGACTGCTGTTATCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAAC GTTGACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATT GCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGTAAC ATCGTTTCCCAGGTTTAA 3´ sekrécia proteínu do BUNKY: bez signálnej sekvencie PRIMERY:  priamy: č.626 5´ CGCCCATGGATGAAATTCCATCACCATCGAG 3´ Dĺžka 31 Obsah GC 51.6 % T. topenia 63.8 ºC  reverzný: č.627 5´ TTGCGGCCGCAATTAAACCTGGGAAACGATG 3´ Dĺžka 31 Obsah GC 51.6 % T. topenia 65.9 ºC His kotva TEV proteáza psl2 C-koniec Pufer (100% activity): CutSmart N-koniec Návrh primerov pre pLEXSY-IE-blecherry_4_M_N-6xHis_TEV_psl2 + sig.sekvencia  Restriktázy: XbaI a NotI-HF Templát: pMAT_N-6xHis_TEV_psl2: 5´ATGAAATTCCATCACCATCACCATCACGAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAA CTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTGCTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGG CTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCACTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCA CTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTCCATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTT CCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTTGAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTT TGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGAGATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGG GTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACAGATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTA ACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACATCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGA CTGTTAGATACAACTTCGTTTCCGGTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCAT CCAACACTTTGACTGCTGTTATCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAAC GTTGACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATT GCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGTAAC ATCGTTTCCCAGGTTTAA 3´ sekrécia proteínu do MÉDIA: so signálnou sekvenciou  priamy: č.628 5´ GGCTCTAGACAGATGAAATTCCATCACCATCACGAG 3´ Dĺžka 36 Obsah GC 47.2 % T. topenia 63.2 ºC  reverzný: č.629 5´ AAATATGCGGCCGCTATAAATTAAACCTGGGAAACGATG 3´ Dĺžka 39 Obsah GC 41 % T. topenia 63.7 ºC His kotva TEV proteáza psl2 Pufer (100% activity): CutSmart C-koniec N-koniec Príloha č.2 Vzorka č.4: pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 bez sign. sekvencie CLUSTAL O(1.2.1) multiple sequence alignment navrh ------------------------------------------------------------ výsledok GGGATGCTCCGCCTCGCTCGCACGCTCTTTCACGCTCCGGCTTTCCTTGCTGTGCCTTGC navrh --------CGCCCATGGATGAAATTCCATCACCATCACCATCACGAGAACCTGTATTTTC výsledok CACCAGATCTGCCATGGATGAAATTCCATCACCATCACCATCACGAGAACCTGTATTTTC * ************************************************* navrh AGTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTGCTATCACATTGCAGG výsledok AGTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTGCTATCACATTGCAGG ************************************************************ navrh GTAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCACTCAGATCCCAC výsledok GTAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCACTCAGATCCCAC ************************************************************ navrh CAACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTCCATTGTGGG výsledok CAACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTCCATTGTGGG ************************************************************ navrh ACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTTGAACC výsledok ACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTTGAACC ************************************************************ navrh CATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGAGA výsledok CATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGAGA ************************************************************ navrh TCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACA výsledok TCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACA ************************************************************ navrh GATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACA výsledok GATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACA ************************************************************ navrh TCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGTTAGATACAACTTCGTTTCCG výsledok TCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGTTAGATACAACTTCGTTTCCG ************************************************************ navrh GTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATCCAACACTTTGACTGCTGTTA výsledok GTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATCCAACACTTTGACTGCTGTTA ************************************************************ navrh TCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAACGTTGACTTGAAGGCTGTTT výsledok TCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAACGTTGACTTGAAGGCTGTTT ************************************************************ navrh TGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATTGCTGTTTCCCACAACA výsledok TGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATTGCTGTTTCCCACAACA ************************************************************ navrh TCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGTAACATCGTTTCCCAGG výsledok TCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGTAACATCGTTTCCCAGG ************************************************************ NcoI navrh TTTAATTGCGGCCGCAA------------------------------------------- výsledok TTTAATTTATAGCGGCCGCCCTCCTCCTCCTTTCTTGTTCCTTTCACGTCGCCTTCTCGG ******* ** navrh ------------------------------------------------------------ výsledok TTGTAGCTGGCAGACGACGAGTCTTACTTTTACGTGTACTTCTCTATAGATGATGTATGA navrh ------------------------------------------------------------ výsledok TCTCTCTGCATGCGTGTTCGTGCATGTGTCTGTGTGTTGTGAACGCGTGCGTCTCGCCTC navrh ------------------------------------------------------------ výsledok AACTCTCCGCGTGAAAGGGTTTGACTGCCCATGATGCGTGTGAATATCACCGCGCAGGTA navrh ------------------------------------------------------------ výsledok CGATCCATCAACCATAATTCGTTATTCTATTAGGCAATCATCGCGTAAGTAAACGCGCTT navrh výsledok T NotI Príloha č.3 Vzorka č.5: pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 bez sign. sekvencia CLUSTAL O(1.2.1) multiple sequence alignment navrh ------------------------------------------------------------ výsledok NGATGCTCCGCCTCGCTCGCACGCTCTTCACGCTCCCGGCTTTCCTTGCTGTGCCTTGCC navrh ----CGCCCATGGCGCATGAAATTCCATCACCATCACCATCACGAGAACCTGTATTTTCA výsledok ACCAGATCTGCCATGGATGAAATTCCATCACCATCACCATCACGAGAACCTGTATTTTCA * * ******************************************** navrh GTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTGCTATCACATTGCAGGG výsledok GTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACTGCTATCACATTGCAGGG ************************************************************ navrh TAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCACTCAGATCCCACC výsledok TAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAACTCCACTCAGATCCCACC ************************************************************ navrh AACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTCCATTGTGGGA výsledok AACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTCCACTCCAGTTCCATTGTGGGA ************************************************************ navrh CTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTTGAACCC výsledok CTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTTCTCCTTCGTCATCTTGAACCC ************************************************************ navrh ATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGAGAT výsledok ATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCATTGCTCCACCAGACACTGAGAT ************************************************************ navrh CCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACAG výsledok CCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGACTCCAAGACTTCCATCAACAG ************************************************************ navrh ATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACAT výsledok ATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTTCGACCCTTACATGAGACACAT ************************************************************ navrh CGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGTTAGATACAACTTCGTTTCCGG výsledok CGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGTTAGATACAACTTCGTTTCCGG ************************************************************ navrh TTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATCCAACACTTTGACTGCTGTTAT výsledok TTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATCCAACACTTTGACTGCTGTTAT ************************************************************ navrh CACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAACGTTGACTTGAAGGCTGTTTT výsledok CACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAACGTTGACTTGAAGGCTGTTTT ************************************************************ navrh GCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATTGCTGTTTCCCACAACAT výsledok GCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATTGCTGTTTCCCACAACAT ************************************************************ navrh CCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGTAACATCGTTTCCCAGGT výsledok CCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGTAACATCGTTTCCCAGGT ************************************************************ NcoI navrh TTAATTGCGGCCGCAA-------------------------------------------- výsledok TTAATTTATAGCGGCCGCCCTCCTCCTCCTTTCTTGTTCCTTTCACGTCGCCTTCTCGGT ****** ** navrh ------------------------------------------------------------ výsledok TGTAGCTGGCAGACGACGAGTCTTACTTTTACGTGTACTTCTCTATAGATGATGTATGAT navrh ------------------------------------------------------------ výsledok CTCTCTGCATGCGTGTTCGTGCATGTGTCCGTGTGTTGTGTACGCGTGCGTCTCGCCTCA navrh ------------------------------------------------------------ výsledok GCTCTCCGCGTGAAAGGGTTTGACTGCCCATGATGCGTGTGTATATCCACGCGCAGGCAC navrh ------------------------------------------------------------ výsledok GCACACACACCCCACAAACACACACCAACGGGCACACCCAGGGCACACAAACGCATCTCA navrh ------------------------------------------------------------ výsledok AGGCCGAGCCGCATACGTCTCTCGCACGGGCTCCGTTTATTTGATCATGTAGTTGAGTAT navrh ------------------------------------------------------------ výsledok TAAATTGGGAAAGACAAAAACTTATTATCTCGCATAATCCGGGTCCGAAAAAGTCGGATC navrh ------------------------------------------------------------ výsledok TTCTCCTCCTACTCTTCAGGCCAGCCAAGGGGCCATTGGGGTTGCCCTAACAACTAAGGA navrh ------------------------------------------------------------ výsledok CCAGTAGGGGGAGAAAGAGGGACATAAAAAGGATAATATCCTCCAATCAGTAAGGGTGGA navrh ------------------------------------------------------------ výsledok CAAAAGATTTAAAACAGAGGACTAGGGTCTATTTATAAGGATAGAATCACGGGCGAAACA navrh ------------------------------------------------------------ výsledok ACGAAAACACACACCTCACAACACACCAACGAGAGAACCTATAGTGAGAGATTGAGGTAA navrh -------------------------------------------- výsledok GCACAACAATGTGTGGTGAGGGGCCAGTCGGTATCGCTTACAAG NotI Príloha č.4 Vzorka č.6: pLEXSY_IE_blecherry4_N-6xHis_psl2 so sign. sekvencia CLUSTAL O(1.2.1) multiple sequence alignment návrh ------------------------------------------------------------ výsledok NGATGCTCTCGCTCGCTCGCACGCTCTTCACGCTCCTGCTTTCCTTGCTGTGCCTTGCCA návrh ------------------------------------------------------------ výsledok CCAGATCTGCCATGGCCTCGAGGCTCGTCCGTGTGCTGGCCGCCGCCATGCTGGTTGCAG návrh ----------------------- TGGCTCTAGACAGATGAAATTCCATCACCATCACCA výsledok CGGCCGTGTCGGTCGACGCTGGCGCCTCTCTAGACAGATGAAATTCCATCACCATCACCA ************************** návrh TCACGAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAA výsledok TCACGAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAA ************************************************************ návrh CACTGCTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGAC výsledok CACTGCTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGAC ************************************************************ návrh TAACTCCACTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTC výsledok TAACTCCACTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTC ************************************************************ návrh CACTCCAGTTCCATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTT výsledok CACTCCAGTTCCATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTT ************************************************************ návrh CTCCTTCGTCATCTTGAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCAT výsledok CTCCTTCGTCATCTTGAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCAT ************************************************************ návrh TGCTCCACCAGACACTGAGATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGA výsledok TGCTCCACCAGACACTGAGATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGA ************************************************************ návrh CTCCAAGACTTCCATCAACAGATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTT výsledok CTCCAAGACTTCCATCAACAGATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTT ************************************************************ návrh CGACCCTTACATGAGACACATCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGT výsledok CGACCCTTACATGAGACACATCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGT ************************************************************ návrh TAGATACAACTTCGTTTCCGGTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATC výsledok TAGATACAACTTCGTTTCCGGTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATC ************************************************************ návrh CAACACTTTGACTGCTGTTATCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAA výsledok CAACACTTTGACTGCTGTTATCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAA ************************************************************ návrh CGTTGACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCAC XbaI výsledok CGTTGACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCAC ************************************************************ návrh TATTGCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTAC výsledok TATTGCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTAC ************************************************************ návrh TGGTAACATCGTTTCCCAGGTTTAATTTATAGCGGCCGCATATTT--------------- výsledok TGGTAACATCGTTTCCCAGGTTTAATTGCGGCCGCCCTCCTCCTCCTTTCTTGTTCCTTT *************************** ** ** * * * návrh ------------------------------------------------------------ výsledok CACGTCGCCTTCTCGGTTGTAGCTGGCAGACGACGAGTCTTACTTTTACGTGTACTTCTC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok TATAGATGATGTATGATCTCTCTGCATGCGTGTTCGTGCATGTGTCCGTGTGTTGTGTAC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok GCGTGCGTCTCGCCTCAGCTCTCCGCGTGAAAGGGTTTGACTGCCCATGATGCGTGGGGT návrh ------------------------------------------------------------ výsledok ATTCCCCGCGCAAGGACCGAACAAACACACACAACACCTACCTTATCAAGTTATAAACAG návrh ------------------------------------------------------------ výsledok GGATCTTAACCGTATTTCTTGGCAGAACCGAAACAATCCTCCACCCAGATCCCTCTATAT návrh ------------------------------------------------------------ výsledok TATAACTTAGGTATTACATAATCATATTGGAAAACCAGAACATAGTTACTAACTAATATC návrh ----------------------------- výsledok TTCATACAAAAATCCATTATCCTTTGACT NotI Príloha č.5 Vzorka č.2: pET-44b_N-6xHis_NusA_6xHis_TEV psl2 a. priamy CLUSTAL O(1.2.1) multiple sequence alignment výsledok GGGCGTATTGCTGGTCGGTGACGAGCGACTAGTATGAAATTCCATCACCATCACCATCAC návrh ---------------------------------ATGAAATTCCATCACCATCACCATCAC *************************** výsledok GAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACT návrh GAGAACCTGTATTTTCAGTCCTTGTCCTTCAACTTCCCAAAGATCACTCCAGGTAACACT ************************************************************ výsledok GCTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAAC návrh GCTATCACATTGCAGGGTAACGCTAAGATTTTGGCTAACGGTGTTTTGGCTTTGACTAAC ************************************************************ výsledok TCCACTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTCCACT návrh TCCACTCAGATCCCACCAACTACTACTTTCCCATCCACTGGTAGAGCCTTGTACTCCACT ************************************************************ výsledok CCAGTTCCATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTTCTCC návrh CCAGTTCCATTGTGGGACTCTGCTACTGGTAACGTTGCTTCCTTCGTTACAAGTTTCTCC ************************************************************ výsledok TTCGTCATCTTGAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCATTGCT návrh TTCGTCATCTTGAACCCATCCGGTAGAGTTCCAACTGACGGTTTGGTTTTCTTCATTGCT ************************************************************ výsledok CCACCAGACACTGAGATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGACTCC návrh CCACCAGACACTGAGATCCCAAACAACTCCCAATCCCAGTACTTGGGTGTTGTTGACTCC ************************************************************ výsledok AAGACTTCCATCAACAGATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTTCGAC návrh AAGACTTCCATCAACAGATTCGTTGGTTTGGAGTTCGACTTGTACGCTAACTCCTTCGAC ************************************************************ výsledok CCTTACATGAGACACATCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGTTAGA návrh CCTTACATGAGACACATCGGTATCGATATCAACTCCTTGATCTCCACTAAGACTGTTAGA ************************************************************ výsledok TACAACTTCGTTTCCGGTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATCCAAC návrh TACAACTTCGTTTCCGGTTCCTTGACTAAGGTTACTATCATCTACGACTCCCCATCCAAC ************************************************************ výsledok ACTTTGACTGCTGTTATCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAACGTT návrh ACTTTGACTGCTGTTATCACTTACGAGAACGGTCAGATTTCCACTATCTCCCAGAACGTT ************************************************************ výsledok GACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATT návrh GACTTGAAGGCTGTTTTGCCAAAGGACGTTTCCGTTGGTTTCTCCGCTACTTCCACTATT ************************************************************ výsledok GCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGT návrh GCTGTTTCCCACAACATCCACTCTTGGTCCTTCACTTCCAACTTGGAGGCTACTACTGGT ************************************************************ výsledok AACATCGTTTCCCAGGTTTAACTCGAGCACCACCACCACCACCACTAATGTTAATTAAGT návrh AACATCGTTTCCCAGGTTTAA--------------------------------------- ********************* výsledok TGGGCGTTCCTAGGCTGATAAAACAGAATTTGCCTGGCGGCAGTAGCGCGGTGGTCCCAC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok CTGACCCCATGCCGAACTCAGAAGTGAAACGCCGTAGCGCCGATGGTAGTGTGGGGTCTC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok CCCATGCGAGAGTAGGGAACTGCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGGCTCAGTCGAAAGAC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok TGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCCG návrh ------------------------------------------------------------ výsledok CCGGGAGCGGATTTGAACGTTGCGAACAACGCCCCCGGAAGGGTGGCGGGTAAGGACCCC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok TGCCTAAAATGGC návrh ------------- Vzorka č.2: pET-44b_N-HisTag_TEV psl2 b. reverzný CLUSTAL O(1.2.1) multiple sequence alignment výsledok GGCATGTGGACCGCGCTACCTGCCGCCAGGCAAATTCTGTTTTATCAGCCTAGGAACGCC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok CAACTTAATTAACATTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTAAACCTGGGAAACGATG návrh -----------------------------------------TTAAACCTGGGAAACGATG ******************* výsledok TTACCAGTAGTAGCCTCCAAGTTGGAAGTGAAGGACCAAGAGTGGATGTTGTGGGAAACA návrh TTACCAGTAGTAGCCTCCAAGTTGGAAGTGAAGGACCAAGAGTGGATGTTGTGGGAAACA ************************************************************ výsledok GCAATAGTGGAAGTAGCGGAGAAACCAACGGAAACGTCCTTTGGCAAAACAGCCTTCAAG návrh GCAATAGTGGAAGTAGCGGAGAAACCAACGGAAACGTCCTTTGGCAAAACAGCCTTCAAG ************************************************************ výsledok TCAACGTTCTGGGAGATAGTGGAAATCTGACCGTTCTCGTAAGTGATAACAGCAGTCAAA návrh TCAACGTTCTGGGAGATAGTGGAAATCTGACCGTTCTCGTAAGTGATAACAGCAGTCAAA ************************************************************ výsledok GTGTTGGATGGGGAGTCGTAGATGATAGTAACCTTAGTCAAGGAACCGGAAACGAAGTTG návrh GTGTTGGATGGGGAGTCGTAGATGATAGTAACCTTAGTCAAGGAACCGGAAACGAAGTTG ************************************************************ výsledok TATCTAACAGTCTTAGTGGAGATCAAGGAGTTGATATCGATACCGATGTGTCTCATGTAA návrh TATCTAACAGTCTTAGTGGAGATCAAGGAGTTGATATCGATACCGATGTGTCTCATGTAA ************************************************************ výsledok GGGTCGAAGGAGTTAGCGTACAAGTCGAACTCCAAACCAACGAATCTGTTGATGGAAGTC návrh GGGTCGAAGGAGTTAGCGTACAAGTCGAACTCCAAACCAACGAATCTGTTGATGGAAGTC ************************************************************ výsledok TTGGAGTCAACAACACCCAAGTACTGGGATTGGGAGTTGTTTGGGATCTCAGTGTCTGGT návrh TTGGAGTCAACAACACCCAAGTACTGGGATTGGGAGTTGTTTGGGATCTCAGTGTCTGGT ************************************************************ výsledok GGAGCAATGAAGAAAACCAAACCGTCAGTTGGAACTCTACCGGATGGGTTCAAGATGACG návrh GGAGCAATGAAGAAAACCAAACCGTCAGTTGGAACTCTACCGGATGGGTTCAAGATGACG ************************************************************ výsledok AAGGAGAAACTTGTAACGAAGGAAGCAACGTTACCAGTAGCAGAGTCCCACAATGGAACT návrh AAGGAGAAACTTGTAACGAAGGAAGCAACGTTACCAGTAGCAGAGTCCCACAATGGAACT ************************************************************ výsledok GGAGTGGAGTACAAGGCTCTACCAGTGGATGGGAAAGTAGTAGTTGGTGGGATCTGAGTG návrh GGAGTGGAGTACAAGGCTCTACCAGTGGATGGGAAAGTAGTAGTTGGTGGGATCTGAGTG ************************************************************ výsledok GAGTTAGTCAAAGCCAAAACACCGTTAGCCAAAATCTTAGCGTTACCCTGCAATGTGATA návrh GAGTTAGTCAAAGCCAAAACACCGTTAGCCAAAATCTTAGCGTTACCCTGCAATGTGATA ************************************************************ výsledok GCAGTGTTACCTGGAGTGATCTTTGGGAAGTTGAAGGACAAGGACTGAAAATACAGGTTC návrh GCAGTGTTACCTGGAGTGATCTTTGGGAAGTTGAAGGACAAGGACTGAAAATACAGGTTC ************************************************************ výsledok TCGTGATGGTGATGGTGATGGAATTTCATACTATTCGCTTCGTCGCCGAACCAGCAAATA návrh TCGTGATGGTGATGGTGATGGAATTTCAT------------------------------- ***************************** výsledok TTACGGGCAGCCTTAATCATTGCTCCGGCTTTTTCAGCAGGCAACCCTTCGAAATCGGCC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok GGATCTTCAATGCCCTGTTCGGCTAGATCTTCCGACTTACGAACTCTACGGCCGGCCAGT návrh ------------------------------------------------------------ výsledok TTTAATTTCGAGTGCTAGATCGTCCGCTTCTAGGTTCAGGCGAATCGTCAACCCGGTTGT návrh ------------------------------------------------------------ výsledok TTGTCACCTAAGCCTTTCTTCCGTGAGCTGATCAGAGGTGTGCAATGGGTCTTTTTAGTC návrh ------------------------------------------------------------ výsledok GGTTGA návrh ------ Príloha č.6 E. coli Rosetta2(DE3) pLysRare test rozpustnosti proteínu PSL2: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 Legenda: E. coli Rosetta2(DE3) pLysRare: 1- BI 2- CI, 25 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 3- CS, 25 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 4- CI, 25 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 5- CS, 25 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 6- CI, 25 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 7- CS, 25 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 8- CI, 30 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 9- CS, 30 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 10- CI, 30 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 11- CS, 30 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 12- CI, 30 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 13- CS, 30 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 14- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 15- CI, 25 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 16- CS, 25 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 17- CI, 25 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 18- CS, 25 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 19- CI, 25 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 20- CS, 25 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 21- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 22- CI, 30 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 23- CS, 30 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 24- CI, 30 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 25- CS, 30 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 26- CI, 30 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 27- CS, 30 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 28- CI, 25 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 29- CS, 25 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 30- CI, 25 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 31- CS, 25 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 32- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 33- CI, 25 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 34- CS, 25 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 35- CI, 30 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 36- CS, 30 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 37- CI, 30 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 38- CS, 30 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 39- CI, 30 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 40- CS, 30 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 41- CI, 18 °C, 20h, 0,10 mM IPTG 42- CS, 18 °C, 20h, 0,10 mM IPTG 43- CI, 18 °C, 20h, 0,25 mM IPTG 44- CS, 18 °C, 20h, 0,25 mM IPTG 45- CI, 18 °C, 20h, 0,50 mM IPTG 46- CS, 18 °C, 20h, 0,50 mM IPTG 47- CI, 18 °C, 24h, 0,10 mM IPTG 48- CS, 18 °C, 24h, 0,10 mM IPTG 49- CI, 18 °C, 24h, 0,25 mM IPTG 50- CS, 18 °C, 24h, 0,25 mM IPTG 51- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 52- CI, 18 °C, 24h, 0,50 mM IPTG 53- CS, 18 °C, 24h, 0,50 mM IPTG 45 kDa 45 kDa 45 kDa 45 kDa E. coli BL21(DE3) test rozpustnosti proteínu PSL2: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 Legenda vzoriek E. coli BL21(DE3): 1- CI, 25 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 2- CS, 25 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 3- CI, 25 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 4- CS, 25 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 5- CI, 25 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 6- CS, 25 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 7- CI, 25 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 8- CS, 25 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 9- CI, 25 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 10- CS, 25 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 11- CI, 25 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 12- CS, 25 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 13- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 14- BI 15- CI, 25 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 16- CS, 25 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 17- CI, 25 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 18- CS, 25 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 19- CI, 25 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 20- CS, 25 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 21- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 22- CI, 30 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 23- CS, 30 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 24- CI, 30 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 25- CS, 30 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 26- CI, 30 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 27- CS, 30 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 28- CI, 18 °C, 20h, 0,10 mM IPTG 29- CS, 18 °C, 20h, 0,10 mM IPTG 30- CI, 18 °C, 20h, 0,25 mM IPTG 31- CS, 18 °C, 20h, 0,25 mM IPTG 32- CI, 18 °C, 20h, 0,50 mM IPTG 33- CS, 18 °C, 20h, 0,50 mM IPTG 34- CI, 18 °C, 24h, 0,50 mM IPTG 35- CS, 18 °C, 24h, 0,50 mM IPTG 36- CI, 18 °C, 24h, 0,10 mM IPTG 37- CS, 18 °C, 24h, 0,10 mM IPTG 38- CI, 18 °C, 24h, 0,25 mM IPTG 39- CS, 18 °C, 24h, 0,25 mM IPTG 40- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 41- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 42- CI, 30 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 43- CS, 30 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 44- CI, 30 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 45- CS, 30 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 46- CI, 30 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 47- CS, 30 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 48- CI, 30 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 49- CS, 30 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 50- CI, 30 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 51- CS, 30 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 52- CI, 30 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 53- CS, 30 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 45 kDa 45 kDa 45 kDa 45 kDa E. coli Tuner(DE3) test rozpustnosti proteínu PSL2: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 Legenda vzoriek E. coli Tuner(DE3): 1- CI, 25 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 2- CS, 25 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 3- CI, 25 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 4- CS, 25 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 5- CI, 25 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 6- CS, 25 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 7- CI, 25 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 8- CS, 25 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 9- CI, 25 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 10- CS, 25 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 11- CI, 25 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 12- CS, 25 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 13- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 14- BI 15- CI, 25 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 16- CS, 25 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 17- CI, 25 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 18- CS, 25 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 19- CI, 25 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 20- CS, 25 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 21- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 22- CI, 30 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 23- CS, 30 °C, 3h, 0,10 mM IPTG 24- CI, 30 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 25- CS, 30 °C, 4h, 0,10 mM IPTG 26- CI, 30 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 27- CS, 30 °C, 5h, 0,10 mM IPTG 28- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 29- CI, 30 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 30- CS, 30 °C, 3h, 0,25 mM IPTG 31- CI, 30 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 32- CS, 30 °C, 4h, 0,25 mM IPTG 33- CI, 30 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 34- CS, 30 °C, 5h, 0,25 mM IPTG 35- CI, 30 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 36- CS, 30 °C, 3h, 0,50 mM IPTG 37- CI, 30 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 38- CS, 30 °C, 4h, 0,50 mM IPTG 39- CI, 30 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 40- CS, 30 °C, 5h, 0,50 mM IPTG 41- CI, 18 °C, 24h, 0,10 mM IPTG 42- CS, 18 °C, 24h, 0,10 mM IPTG 43- CI, 18 °C, 24h, 0,25 mM IPTG 44- CS, 18 °C, 24h, 0,25 mM IPTG 45- CI, 18 °C, 24h, 0,50 mM IPTG 46- CS, 18 °C, 24h, 0,50 mM IPTG 47- CI, 18 °C, 20h, 0,10 mM IPTG 48- CS, 18 °C, 20h, 0,10 mM IPTG 49- CI, 18 °C, 20h, 0,25 mM IPTG 50- CS, 18 °C, 20h, 0,25 mM IPTG 51- Štandard 6,5 – 200 kDa (AppliChem) 52- CI, 18 °C, 20h, 0,50 mM IPTG 53- CS, 18 °C, 20h, 0,50 mM IPTG 45 kDa 45 kDa 45 kDa 45 kDa Príloha č.7 22. 2. 2016 Vzorky: Vondrová PSL2 + tioredoxin (pRSET A), PSL2 + 6xHis+NusA cca 86kDa (pET-44b) Gel: 1D, 10 % In-gel digesce (trypsin, 40°C, 2 hod, bez R+A, V) Analýza: MALDI MS/MS – databáze NCBI, taxonomie all entries MALDI MS/MS – lokální databáze dodaných sekvencí, bez enzymové specifity Dominantními složkami vzorků 2-4 jsou proteiny z E. coli, očekávaný protein PSL2 + tioredoxin byl identifikován pouze ve vzorcích 2 a 4. Ve vzorku 1 byl nalezen pouze GADPH z Candidy albicans. Dominantní a jedinou detekovanou složkou vzorku 5 je očekávaný protein. Pro zlepšení pokrytí sekvence či detekci minoritních komponent vzorků by bylo možné provést ještě LC-MS/MS analýzu (dejte, prosím, vědět, zda má být provedena). Vzorek 1 1. gi|487460005 Mass: 35811 Score: 235 Matches: 3(2) Sequences: 3(2) pI = 6,6 12 % type I glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase [Escherichia coli] Odpovídá několika formám proteinu. 1. 382 Mass: 39349 Score: 290 Matches: 4(3) Sequences: 4(3) pI = 6,7 16 % GAPDH Candida albicans Vzorek 2 1. gi|26110363 Mass: 44822 Score: 651 Matches: 9(6) Sequences: 9(6) pI = 5,3 33 % Elongation factor Tu [Escherichia coli CFT073] Odpovídá několika formám proteinu. 2. gi|169172 Mass: 28487 Score: 222 Matches: 2(1) Sequences: 2(1) pI = 5,9 16 % vegetative lectin [Pisum sativum] Identifikace na 1 peptid se signifikantním MASCOT score. Odpovídá několika formám proteinu. 3. gi|148071 Mass: 11886 Score: 155 Matches: 2(1) Sequences: 2(1) pI = 4,7 27 % thioredoxin [Escherichia coli] Identifikace na 1 peptid se signifikantním MASCOT score. Odpovídá několika formám proteinu. 1. 1468 Mass: 39918 Score: 392 Matches: 5(5) Sequences: 5(5) pI = 5,4 23 % Vondrova 1402 PSL2 thioredoxin (pRSET A) Pokrytí sekvence (potvrzené úseky/nejisté úseky/nedetekované úseky): 1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA HWCGPCKMIA PILDEIADEY 51 QGKLTVAKLN IDHNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL 101 KEFLDANLAG SGSGENLYFQ GSENLYFQSL SFNFPKITPG NTAITLQGNA 151 KILANGVLAL TNSTQIPPTT TFPSTGRALY STPVPLWDSA TGNVASFVTS 201 FSFVILNPSG RVPTDGLVFF IAPPDTEIPN NSQSQYLGVV DSKTSINRFV 251 GLEFDLYANS FDPYMRHIGI DINSLISTKT VRYNFVSGSL TKVTIIYDSP 301 SNTLTAVITY ENGQISTISQ NVDLKAVLPK DVSVGFSATS TIAVSTTSTL 351 GPSLPTWKLL LVTSFPRFKE A Vzorek 3 1. gi|335576468 Mass: 38383 Score: 1083 Matches: 8(7) Sequences: 8(7) pI = 4,7 45 % outer membrane porin OmpF OmpF [Shigella flexneri J1713] Odpovídá několika formám proteinu. 2. gi|26110363 Mass: 44822 Score: 75 Matches: 1(1) Sequences: 1(1) pI = 5,3 3 % Elongation factor Tu [Escherichia coli CFT073] Identifikace na 1 peptid. Odpovídá několika formám proteinu. No results. Vzorek 4 1. gi|26110363 Mass: 44822 Score: 493 Matches: 7(5) Sequences: 7(5) pI = 5,3 26 % Elongation factor Tu [Escherichia coli CFT073] Odpovídá několika formám proteinu. 2. gi|169172 Mass: 28487 Score: 371 Matches: 3(3) Sequences: 3(3) pI = 5,9 22 % vegetative lectin [Pisum sativum] Odpovídá několika formám proteinu. 3. gi|148071 Mass: 11886 Score: 307 Matches: 3(2) Sequences: 3(2) pI = 4,7 43 % thioredoxin [Escherichia coli] Odpovídá několika formám proteinu. 1. 1468 Mass: 39918 Score: 711 Matches: 8(7) Sequences: 8(7) pI = 5,4 32 % Vondrova 1402 PSL2 thioredoxin (pRSET A) Pokrytí sekvence (potvrzené úseky/nejisté úseky/nedetekované úseky): 1 MSDKIIHLTD DSFDTDVLKA DGAILVDFWA HWCGPCKMIA PILDEIADEY 51 QGKLTVAKLN IDHNPGTAPK YGIRGIPTLL LFKNGEVAAT KVGALSKGQL 101 KEFLDANLAG SGSGENLYFQ GSENLYFQSL SFNFPKITPG NTAITLQGNA 151 KILANGVLAL TNSTQIPPTT TFPSTGRALY STPVPLWDSA TGNVASFVTS 201 FSFVILNPSG RVPTDGLVFF IAPPDTEIPN NSQSQYLGVV DSKTSINRFV 251 GLEFDLYANS FDPYMRHIGI DINSLISTKT VRYNFVSGSL TKVTIIYDSP 301 SNTLTAVITY ENGQISTISQ NVDLKAVLPK DVSVGFSATS TIAVSTTSTL 351 GPSLPTWKLL LVTSFPRFKE A Vzorek 5 1. gi|545292061 Mass: 54863 Score: 1264 Matches: 14(10) Sequences: 14(10) pI = 4,5 49 % transcription termination protein NusA [Escherichia coli] Odpovídá několika formám proteinu. 2. gi|169172 Mass: 28487 Score: 345 Matches: 3(2) Sequences: 3(2) pI = 5,9 18 % vegetative lectin [Pisum sativum] Odpovídá několika formám proteinu. 1. 1469 Mass: 83894 Score: 2194 Matches: 26(22) Sequences: 25(22) pI = 4,8 48 % Vondrova 1402 PSL2 6xHis NusA (pET-44b) Pokrytí sekvence (potvrzené úseky/nejisté úseky/nedetekované úseky): 1 MGSSHHHHHH SSMNKEILAV VEAVSNEKAL PREKIFEALE SALATATKKK 51 YEQEIDVRVQ IDRKSGDFDT FRRWLVVDEV TQPTKEITLE AARYEDESLN 101 LGDYVEDQIE SVTFDRITTQ TAKQVIVQKV REAERAMVVD QFREHEGEII 151 TGVVKKVNRD NISLDLGNNA EAVILREDML PRENFRPGDR VRGVLYSVRP 201 EARGAQLFVT RSKPEMLIEL FRIEVPEIGE EVIEIKAAAR DPGSRAKIAV 251 KTNDKRIDPV GACVGMRGAR VQAVSTELGG ERIDIVLWDD NPAQFVINAM 301 APADVASIVV DEDKHTMDIA VEAGNLAQAI GRNGQNVRLA SQLSGWELNV 351 MTVDDLQAKH QAEAHAAIDT FTKYLDIDED FATVLVEEGF STLEELAYVP 401 MKELLEIEGL DEPTVEALRE RAKNALATIA QAQEESLGDN KPADDLLNLE 451 GVDRDLAFKL AARGVCTLED LAEQGIDDLA DIEGLTDEKA GALIMAARNI 501 CWFGDEAMKF HHHHHHENLY FQSLSFNFPK ITPGNTAITL QGNAKILANG 551 VLALTNSTQI PPTTTFPSTG RALYSTPVPL WDSATGNVAS FVTSFSFVIL 601 NPSGRVPTDG LVFFIAPPDT EIPNNSQSQY LGVVDSKTSI NRFVGLEFDL 651 YANSFDPYMR HIGIDINSLI STKTVRYNFV SGSLTKVTII YDSPSNTLTA 701 VITYENGQIS TISQNVDLKA VLPKDVSVGF SATSTIAVSH NIHSWSFTSN 751 LEATTGNIVS QV Príloha č.8 Vzorky: Vondrová – HisTag-NusA-HisTag-Tev-psl2 In-gel digesce (trypsin, 40°C, 2 hod, bez R+A, V) Analýza: MALDI MS/MS – databáze NCBI, taxonomie all entries MALDI MS/MS – lokální databáze dodaných sekvencí, bez enzymové specifity V obou vzorcích byl jako dominantní a jediná detekovaná komponenta nalezen očekávaný protein. Rozdíly proti dodané sekvenci (deamidace N, oxidace W) mohou být důsledkem stáří vzorku. Ve vzorku 2 chyběl oproti vzorku 1 intenzivní signál peptidu 510-530 obsahujícího druhý His-tag, tento rozdíl v pokrytí sekvence se nepodařilo na základě získaných dat vysvětlit. Pro zlepšení pokrytí sekvence by bylo možné provést ještě podrobnější LC-MS/MS analýzu (dejte, prosím, vědět, zda má být provedena). Vzorek 1 1. gi|545292061 Mass: 54863 Score: 2146 Matches: 20(13) Sequences: 19(13) pI = 4,5 46 % transcription termination protein NusA [Escherichia coli] Odpovídá několika formám proteinu. 2. gi|169172 Mass: 28487 Score: 112 Matches: 1(1) Sequences: 1(1) pI = 5,9 6 % vegetative lectin [Pisum sativum] Identifikace na 1 peptid. Odpovídá několika formám proteinu. 1. 1493 Mass: 83894 Score: 2250 Matches: 23(22) Sequences: 22(21) pI = 4,9 36 % Vondrova 1480 HisTag_NusA_HisTag_Tev_psl2 Pokrytí sekvence (potvrzené/nejisté/ nedetekované úseky/detekované se změnou v sekvenci): 1 MGSSHHHHHH SSMNKEILAV VEAVSNEKAL PREKIFEALE SALATATKKK 51 YEQEIDVRVQ IDRKSGDFDT FRRWLVVDEV TQPTKEITLE AARYEDESLN 101 LGDYVEDQIE SVTFDRITTQ TAKQVIVQKV REAERAMVVD QFREHEGEII 151 TGVVKKVNRD NISLDLGNNA EAVILREDML PRENFRPGDR VRGVLYSVRP 201 EARGAQLFVT RSKPEMLIEL FRIEVPEIGE EVIEIKAAAR DPGSRAKIAV 251 KTNDKRIDPV GACVGMRGAR VQAVSTELGG ERIDIVLWDD NPAQFVINAM 301 APADVASIVV DEDKHTMDIA VEAGNLAQAI GRNGQNVRLA SQLSGWELNV 351 MTVDDLQAKH QAEAHAAIDT FTKYLDIDED FATVLVEEGF STLEELAYVP 401 MKELLEIEGL DEPTVEALRE RAKNALATIA QAQEESLGDN KPADDLLNLE 451 GVDRDLAFKL AARGVCTLED LAEQGIDDLA DIEGLTDEKA GALIMAARNI 501 CWFGDEAMKF HHHHHHENLY FQSLSFNFPK ITPGNTAITL QGNAKILADG 551 VLALTNSTQI PPTTTFPSTG RALYSTPVPL WDSATGNVAS FVTSFSFVIL 601 NPSGRVPTDG LVFFIAPPDT EIPNNSQSQY LGVVDSKTSI NRFVGLEFDL 651 YANSFDPYMR HIGIDINSLI STKTVRYNFV SGSLTKVTII YDSPSNTLTA 701 VITYENGQIS TISQNVDLKA VLPKDVSVGF SATSTIAVSH NIHSWSFTSN 751 LEATTGNIVS QV Vzorek 2 1. gi|446953797 Mass: 54853 Score: 1572 Matches: 16(11) Sequences: 16(11) pI = 4,5 43 % transcription termination protein NusA [Escherichia coli] Odpovídá několika formám proteinu. 2. gi|169172 Mass: 28487 Score: 121 Matches: 2(1) Sequences: 2(1) pI = 5,9 12 % vegetative lectin [Pisum sativum] Identifikace na 1 peptid se signifikantním MASCOT score. Odpovídá několika formám proteinu. 1. 1493 Mass: 83894 Score: 1628 Matches: 22(16) Sequences: 22(16) pI = 4,9 35 % Vondrova 1480 HisTag_NusA_HisTag_Tev_psl2 Pokrytí sekvence (potvrzené/nejisté/ nedetekované úseky/ detekované se změnou v sekvenci): 1 MGSSHHHHHH SSMNKEILAV VEAVSNEKAL PREKIFEALE SALATATKKK 51 YEQEIDVRVQ IDRKSGDFDT FRRWLVVDEV TQPTKEITLE AARYEDESLN 101 LGDYVEDQIE SVTFDRITTQ TAKQVIVQKV REAERAMVVD QFREHEGEII 151 TGVVKKVNRD NISLDLGNNA EAVILREDML PRENFRPGDR VRGVLYSVRP 201 EARGAQLFVT RSKPEMLIEL FRIEVPEIGE EVIEIKAAAR DPGSRAKIAV 251 KTNDKRIDPV GACVGMRGAR VQAVSTELGG ERIDIVLWDD NPAQFVINAM 301 APADVASIVV DEDKHTMDIA VEAGNLAQAI GRNGQNVRLA SQLSGwELNV 351 MTVDDLQAKH QAEAHAAIDT FTKYLDIDED FATVLVEEGF STLEELAYVP 401 MKELLEIEGL DEPTVEALRE RAKNALATIA QAQEESLGDN KPADDLLNLE 451 GVDRDLAFKL AARGVCTLED LAEQGIDDLA DIEGLTDEKA GALIMAARNI 501 CWFGDEAMKF HHHHHHENLY FQSLSFNFPK ITPGNTAITL QGNAKILADG 551 VLALTNSTQI PPTTTFPSTG RALYSTPVPL WDSATGNVAS FVTSFSFVIL 601 NPSGRVPTDG LVFFIAPPDT EIPNNSQSQY LGVVDSKTSI NRFVGLEFDL 651 YANSFDPYMR HIGIDINSLI STKTVRYNFV SGSLTKVTII YDSPSNTLTA 701 VITYENGQIS TISQNVDLKA VLPKDVSVGF SATSTIAVSH NIHSWSFTSN 751 LEATTGNIVS QV w = W + 2 oxidace Príloha č.9 Vzorky: Pokorná - Psl2 + HisTag + NusTag + HisT In-gel digesce (trypsin, 40°C, 2 hod, bez R+A, V) Analýza: MALDI MS/MS – databáze NCBI, taxonomie all entries MALDI MS/MS – lokální databáze dodaných sekvencí, bez enzymové specifity Dominantní složkou všech tří vzorků jsou různě dlouhé N-terminální fragmenty očekávaného proteinu. Stopy jiného proteinu (z E. coli) byly pozorovány pouze ve vzorku 2. Vzorky 1-3 1. gi|485893092 Mass: 54832 Score: 1570 Matches: 19(13) Sequences: 17(13) pI = 4,5 44 % transcription termination protein NusA [Escherichia coli] Odpovídá několika formám proteinu. 2. gi|18028158 Mass: 52000 Score: 119 Matches: 1(1) Sequences: 1(1) pI = 4,8 3 % GroEL [Escherichia coli] Identifikace na 1 peptid. Tento peptid byl nalezen pouze ve vzorku č. 2. Odpovídá několika formám proteinu. 1. 1530 Mass: 83894 Score: 1893 Matches: 27(24) Sequences: 25(22) pI = 4,9 37 % Wimmerova 2003 Psl2, HisTag, NusTag, HisT Pokrytí sekvence (potvrzené/nejisté/ nedetekované úseky): Identifikované peptidy ve všech třech vzorcích/jenom ve vzorcích 1 a 2/jenom ve vzorku 1: 1 MGSSHHHHHH SSMNKEILAV VEAVSNEKAL PREKIFEALE SALATATKKK 51 YEQEIDVRVQ IDRKSGDFDT FRRWLVVDEV TQPTKEITLE AARYEDESLN 101 LGDYVEDQIE SVTFDRITTQ TAKQVIVQKV REAERAMVVD QFREHEGEII 151 TGVVKKVNRD NISLDLGNNA EAVILREDML PRENFRPGDR VRGVLYSVRP 201 EARGAQLFVT RSKPEMLIEL FRIEVPEIGE EVIEIKAAAR DPGSRAKIAV 251 KTNDKRIDPV GACVGMRGAR VQAVSTELGG ERIDIVLWDD NPAQFVINAM 301 APADVASIVV DEDKHTMDIA VEAGNLAQAI GRNGQNVRLA SQLSGWELNV 351 MTVDDLQAKH QAEAHAAIDT FTKYLDIDED FATVLVEEGF STLEELAYVP 401 MKELLEIEGL DEPTVEALRE RAKNALATIA QAQEESLGDN KPADDLLNLE 451 GVDRDLAFKL AARGVCTLED LAEQGIDDLA DIEGLTDEKA GALIMAARNI 501 CWFGDEAMKF HHHHHHENLY FQSLSFNFPK ITPGNTAITL QGNAKILANG 551 VLALTNSTQI PPTTTFPSTG RALYSTPVPL WDSATGNVAS FVTSFSFVIL 601 NPSGRVPTDG LVFFIAPPDT EIPNNSQSQY LGVVDSKTSI NRFVGLEFDL 651 YANSFDPYMR HIGIDINSLI STKTVRYNFV SGSLTKVTII YDSPSNTLTA 701 VITYENGQIS TISQNVDLKA VLPKDVSVGF SATSTIAVSH NIHSWSFTSN 751 LEATTGNIVS QV