Epigenetická informace Mitoticky i meioticky děděné změny genové exprese, které nesouvisí se změnou primární struktury DNA Epigenetickou kontrolu zprostředkovávají  modifikace makromolekul; DNA a histonů: METHYLACE DNA MODIFIKACE (methylace, acetylace, fosforylace, ubiquitinace) histonových proteinů  malé a nekódující molekuly RNA  architektura chromatinu Regulace aktivity a exprese genů během vývoje a diferenciance, reakce na změněné podmínky Spojka mezi genotypem a fenotypem 1 Historie termínu epigenetika Epigeneze – Aristoteles, 384-322 př. n. l. individuální vývoj organismů souvisí s postupným růstem jejich komplexity (individuální tvorba tvarů během ontogeneze) X Proreformismus – ontogeneze je řízena předem danými strukturami individuální (ontogeneze; tvorba a vývin tvarů během životního cyklu individua) VÝVOJ historický (evoluce,fylogeneze; fixace tvarů – selekce, genetika) 2 Historie termínu epigenetika Jean Baptiste Lamarck (1744-1829): • první pokus o výklad evoluční teorie • příroda se pod tlakem podmínek vyvíjí – teorie a • adaptivní změny jsou dědičné (teorie dědičnosti August Weismann (1834-1914): • sledování dědičnosti indukovaných změn v soma • teorie divergence zárodečné a somatické dráhy – bariéra Conrad Hal Waddington (1905-1975): • „epigenetika“, výsledná podoba organismu není vzniká postupnými kreativními procesy • „epigenetická krajina“ 3 epigenetická krajina http://chreoda.nosquare.net/?page=chreoda&action=history&time=20080812-1446.bak Richard B. Goldschmidt (1878-1958) • fenotypová změna souvisí s vlivy prostředí • vzniká jen omezený počet fenotypů 4 Methylace DNA Modifikace cytosinu v poloze 5, nejčastější modifikace DNA u eukaryot Postreplikativní modifikace (B. Vyskot, Epigenetika, 2010) SAM – S-adenosyl-methionin; v transmethylační reakci se konvertuje na S-adenosyl-homocystein 5 Methylace DNA Distribuce methylace v genomech: Methylace C v symetrických sekvencích – klíčové pro dědičnost methylačního obrazu - CpG (dublety) - CpHpG (triplety; rostliny; H = A,T,C) 6 Chan et al., Nat Rev Genet 2005 Methylace DNA Distribuce methylace v genomech: Methylace C v symetrických sekvencích – klíčové pro dědičnost methylačního obrazu - CpG (dublety) - CpNpG (triplety; rostliny) Methylace C v asymetrických sekvencích (rostliny, omezeně u živočichů) 7 2005 Chan et al., Nat Rev Genet Methylace DNA a exprese genů UMLČENÍ GENU POSTTRANSKRIPČNÍ upraveno podle Kasinathan a Henikoff, 2014 000 http://mmg-233-2014-genetics-genomics.wikia. com/wiki/DNA_Methylation TRANSKRIPČNÍ - inaktivní promotor (žádný transkript nebo pouze malé množství) - methylace DNA v oblasti promotoru - normální transkripční aktivita promotoru - nestabilní transkript - methylace DNA v transkribované oblasti (hlavně na 3´konci genu) 8 Živočišné DNA methyltransferázy Udržovací (maintenance): methylace hemimetylovaných vláken po replikaci DNA; cytosiny v symetrických motivech (správný embryonální vývoj, imprinting, inaktivace chr. X) (Bird A, Science, 1999) de novo: methylace dosud nemethylovaných úseků; musí existovat podnět (třeba přítomnost regulačních molekul RNA-dokázáno pouze v rostlinách; interakce DNA-DNA v repeticích; neobvyklé struktury DNA) Dnmt2 - u savců, rostlin; Drosophila – slabá non-CG methylace v časných fázích vývoje; S. pombe – mutace, kóduje nefunkční protein, ale je exprimován DnmtL – DNA methyltransferázový motiv, katalyticky inaktivní 2006 - v savčích buňkách Funkční kooperace s Dnmt3a/b, nezbytná pro genový imprinting methyluje tRNA (Asp) 9 Rostlinné DNA methyltransferázy MET1 (Methyltransferase 1) - udržovací methylace cytosinů v dubletech CG; homolog Dnmt1 CMT3 (Chromomethylase 3) - methylace cytosinů v tripletech CHG; unikátní pro rostliny DRM2 (Domains Rearranged Methyltransferase 2) - de novo methylace cytosinů ve všech sekvenčních motivech, musí existovat permanentní stimul – RNA?; homolog Dnmt3 - jinak řazené podjednotky – příčina odlišné substrátové specificity? DRM3 – VI, IX, X, I – V Dnmt3 – I – VI, IX, X (DDM1 (Decrease in DNA methylation 1) – kóduje protein, který je součástí komplexu remodelujícího chromatin, role v udržování CG i non-CH methylace) 10 FUNKČNÍ KOOPERACE MEZI METYLTRANSFERÁZAMI: MET1 je schopná (v kooperaci s DRM2), de novo methylace CG motivů Dnmt1 je také schopná de novo methylace CG, tuto schopnost posiluje pre-existující methylace v daném lokusu Nový model zachování stabilní methylace DNA: methylační vzory jsou děděny jako obecný status, důležitá je souhra mezi methyltransferázami. Dnmt1 je navázána na replikační vidlici – methylace hemimethylovaných míst (nezávisle na dalších epigentických modifik Dnmt3a/b – vazba na nukleosomy, methylace dalších cytosinů, podle epigenetických modifikací histonů. 11 Biologická role CpG a non-CpG methylace u rostlin CG: zajišťuje stabilní epigenetický obraz A.thaliana mutanty deficientní v udržování methylace CG – aktivace alternativních epigenetických mechanismů – non-CG methylace, H3K9Me2, architektura jádra (Mathieu O. et al, Cell 2007) Nefunkční MET1 – poruší se celý epigenetický obraz, fenotypické defekty – přetrvávají i po obnovení funkce enzymu. rostlina divokého typu met1 mutant 12 Biologická role CpG a non-CpG methylace u rostlin CG: zajišťuje stabilní epigenetický obraz A.thaliana mutanty deficientní v udržování methylace CG – aktivace alternativních epigenetických mechanismů – non-CG metylace, H3K9Me2, architektura jádra (Mathieu O. et al, Cell 2007) Nefunkční MET1 – poruší se celý epigenetický obraz, fenotypické defekty – přetrvávají i po obnovení funkce enzymu. Nefunkční CMT3 nebo DRM2 – bez fenotypu Nefunkční CMT3 a DRM2 - fenotypové změny po obnovení funkcí enzymů se methylační i fenotypový obraz vrací k normálu 13 DEMETHYLACE 1. PASÍVNÍ – ne-funkce udržovacích methyltransferáz Inhibitory DNA methyltransferáz Analogy cytosinu: 5-aza-deoxycytidine zebularine DHPA: methionin homocystein DHPA (S)-9-(2,3-dihydroxypropyl)adenin (inhibitor SAH-hydrolázy) cytosin SAH hydroláza 5-methylcytosin Prof. Antonín Holý 14 DEMETHYLACE 1. PASÍVNÍ – ne-funkce udržovacích methyltransferáz 2. AKTIVNÍ (v rostlinách) DEMETER (DME) REPRESOR OF SILENCING (ROS) DNA glykosylázová doména – odstraní 5-mC, lyáza otevře vlákno. Polymerázy a ligázy doplní mezeru. DME – vývoj rostliny; kontroluje parentální imprinting genů v endospermu – hypomethylace promotorů maternálních alel genů MEA (regulátor vývoje endospermu) a FWA (transkripční faktor, podílí se na kontrole doby kvetení). ROS – uvolňuje TGS transgenů s hypermetylovanými promotory Kim and Zilbermann, Trends Plant Sci 2014 15 (www.nature.com/reviews) 16 DEMETHYLACE 1. PASÍVNÍ – ne-funkce udržovacích methyltransferáz 2. AKTIVNÍ (v živočišných buňkách) TET – methylcytosine dioxygenase TDG /BER thymin DNA glycosylase / base excision repair 5 – hmC 2006 – objeven v myších a lidských mozcích Funkce (?) v regulaci exprese genů, korelace s acetylací histonů (pozitivní epigenetické značka) http://he-group.uchicago.edu 17 METODY STUDIA METHYLACE DNA 1. Digesce methylačně citlivými restrikčními endonukleázami - v rozpoznávací sekvenci mají cytosin, neštěpí, pokud je methylován CG: HpaII mCmCGG CfoI GmCGC SmaI CCmCGGG TaiI AmCGT CNG: MspI m CCGG CHH: Sau96I GG(A/T)mCmC (záleží na tom, co v sekvenci následuje) 18 (Fojtová et al, Pharmacol. Res., 2006) Metody studia methylace DNA 2. Modifikace DNA bisulfitem - cytosiny kovertovány na uracily, m C nereagují. 19 Metody studia methylace DNA 2. Modifikace DNA bisulfitem cytosiny kovertovány na uracily, m C nereagují. Modifikovaná DNA je namnožena pomocí PCR, uracily se párují s adeninem jako thyminy. Primery musí amplifikovat modifikovaný i nemodifikovaný templát; amplifikuje se každé vlákno zvlášť – nejsou komplementární. PCR produkt se klonuje a sekvenuje – cytosiny jsou pouze tam, kde byly původně mC. Výhoda analýzy: informace o lokalizaci methylovaných cytosinů v celé sekvenci, ne pouze v konkrétním restrikčním místě 20 METODY STUDIA METHYLACE DNA 21 (Fojtová et al, Nucleic Acids Res., 2006) METODY STUDIA METHYLACE DNA 3. Sekvenování DNA po modifikaci bisulfitem, imunoprecipitace pomocí protilátek proti mC nebo afinitní purifikace pomocí mC vazebného proteinu Výsledky analýzy genomu Arabidopsis:  cca 20% cytosinů v genomu je methylovaných  nejvíce mC je v transpozonech a repetitivních sekvencích  nejméně methylované jsou promotory endogenních genů  asi 1/3 genů obsahuje „body methylation“ (CG místa na 3´konci kódující oblasti) 22 Modifikace histonů ethylace – např. lysin v poloze 9 na histonu H3 (H3K9) Distribuce euchromatinových a heterochromatinových značek v Arabidopsis thaliana a myši (podle (Fransz et al., 2006)) A. thaliana Modifika ce H3K9 H4K20 5m-C Stupe ň myš euchromati n hererochromat in euchromati n heterochromati n mono - + + - di - + + - tri + - - + mono - + + - di + - + - tri + - - + - + - + Jde o druhově- a dokonce lokus-specifické, dynamické modifikace 23 Modifikace histonů Acetylace – přídavek acetylové skupiny kompenzuje kladný náboj lysinových zbytků – oslabení interakcí mezi DNA a histony Acetylovaný chromatin – euchromatin Deacetylovaný chromatin – heterochromatin Enzymy: histon acetyltransferázy histondeacetylázy 24 Biswas and Rao, Eur. J. Pharmacol., 2018 Writers, readers, erasers Fig. 1. Epigenetic tools. A representation of epigenetic writers, readers and erasers. These enzymes and protein domains carry out most of the epigenetic modifications on DNA and histone tails. Apart from the enzymes and protein domains highlighted here, other enzymes and protein domains are also available. DNMTs – DNA methyltransferases, HKMTs – Histone lysine methyltransferases, PRMTs – Protein arginine methyltransferases, HATs – Histone acetyltransferases, MBDs – Methyl-CpG-binding domains, PHD – Plant homeodomain, HKDMs – Histone lysine demethylases, HDACs – Histone deacetylases. 25 Dědičnost histonových modifikací 24.11.2021 (Martin and Zhang, 2007) semikonzervativní model „piggy back“ model (?) 26 Vztah mezi methylací DNA a modifikacemi histonů terochromatinová modifikace H3K9me2 rekrutuje lší enzymové aktivity (histodeacetylázu, HP1, DNA methyltransferázy) tvorba kompaktního uspořádání a fixace heterochromatinového avu Arabidopsis thaliana byly vyřazeny geny pro histon methyltransferázy UVH4, SUVH5, SUVH6) aktivace transpozonů ojená s jejich hypomethylací oteiny obsahující Jumonji doménu jsou schopny odstraňovat ethylové skupiny z histonů. V Arabidopsis byl identifikován protein M1 s Jumonji doménou, který reguluje (snižuje) hladinu ethylace CNG v transkribovaných oblastech ggy – back“ model vs. de novo methylace DNA řízená modifikacemi stonů 27 Biologická úloha RNA mRNA – kopíruje genetickou informaci z molekuly DNA, přenáší ji do místa, kde dojde k překladu do struktury proteinu tRNA – překládá kód sekvence bází do sekvence aminokyselin. cca 80 nukleotidů, koncová sekvence –CCA, na ni se váže příslušná AK rRNA – tvoří (s proteiny) ribozom. Prokaryota: 5S, 16S, 23S Eukaryota: 5S, 5.8S, 18S, 28S ribozym – (Ribonucleic acid enzyme), RNA s katalytickou funkcí 23S rRNA ve velké podjednotce ribozomu katalyzující syntézu peptidové vazby (peptidyl transferáza) RNázaP – štěpí RNA, maturace tRNA Nobelova cena za chemii (1989) představa RNA světa v jistém stádiu evoluce, kdy byly molekuly hlavními biologickými katalyzátory RNA 28 RNA INTERFERENCE - SHRNUTÍ Dlouhá dvouvláknová RNA (dsRNA; >200 nt) může umlčet expresi cílových genů v různých organismech (Caenorhabditis elegans, Drosophila, rostliny). Dlouhé dsRNA vstupují do metabolické dráhy nazývané RNA interference (RNAi). Dvouvláknová RNA je v reakci katalyzované enzymem Dicer štěpena na úseky dlouhé 20-25 nukleotidů, tzv. krátké interferující RNA (siRNA). siRNAs jsou začleněny do komplexu obsahující enzymy s ribonukleázovou aktivitou zvaného „RNA-induced silencing complexes“ (RISC). Dvouvláknové siRNA jsou rozvolněny, čímž dochází k aktivaci komplexu. siRNA navádějí RISC k molekulám RNA s komplementární sekvencí a dochází ke štěpení těchto molekul, a to blízko středu úseku, který je navázán k vláknu siRNA. http:// courses.biology.utah.edu/ bastiani/3230/DB %20Lecture/Lectures/ WormRNAi.html 29 Začalo to červem…….., ale na počátku byly kytky Guo, Kemphues, 1995 Fire, Mello, 1998 RNAi Jorgensen et al., 1990 Que, Jorgensen, 1998 PTGS Vlastnosti procesu RNA interference: * vlastní interferující molekulou je dsRNA (ne antisenseRNA) * efekt je vysoce specifický * velice potentní (několik molekul dsRNA v buňce stačí pro vyvolání efektivní odpovědi) * mobilní (je možno indukovat interferenci v buňkách a tkáních vzdálených od místa 30 injektáže) Šlechtění petunií – zintenzivnění barvy květů. Logický přístup – více kopií příslušného genu (chsA) – vyšší exprese ALE KOSUPRESE  přítomnost transgenu vede k omezení exprese homologních (trans)genů žíhané rostliny až zastavení syntézy barviva 31 Začalo to červem…….., ale na počátku byly kytky Guo, Kemphues, 1995 Fire, Mello, 1998 RNAi Jorgensen et al., 1990 Que, Jorgensen, 1998 PTGS Vlastnosti procesu RNA interference: * vlastní interferující molekulou je dsRNA (ne antisenseRNA) * efekt je vysoce specifický * velice potentní (několik molekul dsRNA v buňce stačí pro vyvolání efektivní odpovědi) * mobilní (je možno indukovat interferenci v buňkách a tkáních vzdálených od místa 32 injektáže) INJEKTÁŽE Caenorhabditis elegans (háďátko obecné) 1. + asRNA zablokování exprese XX + sense RNA zablokování exprese 2. + mix sense a antisense RNA  analogie s pokusy na petuniích  saturace translačních faktorů  několikanásobně vyšší umlčovací efekt  základem interference je dsRNA  existence amplifikačního kroku 33 Figure 1. Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. Each embryo is approximately 50 µm in length. (For details see: Fire et al. '98 "Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans " Nature 391: 806-11) 34 Začalo to červem…….., ale na počátku byly kytky Guo, Kemphues, 1995 Fire, Mello, 1998 RNAi Jorgensen et al., 1990 Que, Jorgensen, 1998 PTGS Vlastnosti procesu RNA interference: * vlastní interferující molekulou je dsRNA (ne antisense RNA) * efekt je vysoce specifický * velice potentní (několik molekul dsRNA v buňce stačí pro vyvolání efektivní odpovědi) * mobilní (je možno indukovat interferenci v buňkách a tkáních vzdálených od místa 35 injektáže) Molekulární základ RNAi http://www.ambion.com/techlib/ append/RNAi_mechanism.html 36 VZNIK dsRNA: - pokud je transgen uspořádán jako invertovaná repetice – transkripce přes střed IR LB nptII P35S nptII 3´chs P35S LB 3´chs RB - aberantní molekuly mRNA - předčasně terminované, nesprávně procesované substrát pro RdRP (RNA-dependent RNA polymerase) katalyzuje syntézu dsRNA (nebyla identifikována u Drosophila, u obratlovců nedávno) 37 Molekulární základ RNAi 38 DICER  vlastní iniciátor umlčení, identifikován v Drosophila  RNase III-like enzym (N-konec: helikázová doména, C-konec: RNaseIII doména a dsRNA vazebný motiv)  štěpení molekul dsRNA siRNA (21 - 25 nt)  evolučně konzervativní (houby, živočichové, rostliny)  ATP - dependentní nukleáza, funguje procesivně, ATP využívá k translokaci podél substrátu  C. elegans s mutací v genu kódujícím DICER – fenotypové defekty, důkaz zapojení RNAi do regulace vývojových procesů Živočichové, C. elegans, S. pombe – jeden DICER protein Drosophila – dva DICER Rostliny – čtyři!, mutace mají dramatický vliv na vývoj rostliny 39 Molekulární základ RNAi 40 RISC  RNA-induced silencing complex, efektorový komplex, destrukce cílové mRNA  aktivace RISC  jednovláknové siRNA - na základě komplementarity bazí navádí komplex k cílovému místu  helikáza, nukleázy s endo- a exo- aktivitou, protein recA (homology searching activity) ARGONAUTE – proteinová rodina, interakce s Dicer, součást komplexu RISC. 41 Proteiny rodiny ARGONAUT (Ago) Bazické proteiny (schopnost vazby na RNA) PAZ doména – protein-proteinové interakce asi přispívá i k vazbě siRNA PIWI doména – vazba siRNA v RISC Účastní se produkce siRNA, jejich „nasměrování“do příslušného efektorového komplexu i vlastní degradace mRNA, u rostlin procesu RDDM. Multigenové rodiny (Arabidopsis – 10 členů, Drosophila – 4, C. elegans – 3, člověk – 7, myš - 8). 42 Molekulární základ RNAi RDDM (RNA-directed DNA methylation); v rostlinách v rostlinách infikovaných rekombinantními viroidy nesoucími min. 300 nt homologii s kódující sekvencí methylace a PTGS pokud je homologie s promotorem TGS 43 RDDM • Vznik dsRNA transkripce přes IR (RNA pol II nebo RNA pol IV) vznik ze ssRNA (RdRP-RDR2) • dsRNA je procesována DICER, vznikající molekuly řídí methylaci DNA v komplementárních sekvencích (MET1 podílí se na CG de novo DRM2 de novo všechny kontexty DRD1 chromatin remodelující protein) • RNA nezávislý proces uchování methylačního obrazu (kromě CNN) 44 KO-EXISTENCE RNAi a methylace DNA Rostliny, obratlovci, Neurospora - methylovaná DNA a RNAi Drosophila, S. pombe – RNAi a Dnmt2 (?) C. elegans – RNAi, ale nemá gen pro DNA methyltransferázu S. cerevisiae – nemá methylaci ani RNAi Methylace DNA není univerzálním epigenetickým regulačním mechanismem existence alternativních mechanismů produkty genů skupiny Polycomb / Tritorax – udržení genů ve vypnutém / zapnutém stavu 45 SYSTÉMOVÉ UMLČENÍ - umlčení se přenáší z podnože na roub pokud existuje sekvenční homologie mezi umlčenou a umlčovanou genovou oblastí (tj. podnož i roub obsahují homologní transgeny) - signál je sekvenčně specifický roub s aktivním transgenem (např. jednokopiová inzerce) podnož nesoucí umlčený transgen (např. uspořádaný jako obrácená repetice) -umlčení se přenese i když jsou transgenní roub a podnož odděleny až 30 cm dlouhým stonkem z wild-type rostliny - signál je mobilní 46 microRNA endogenní malé molekuly RNA, kódovány geny ODLIŠNÝMI od těch, jež regulují. 21 nt, vazba na parciálně komplementární místa na 3´netranslatovaném konci cílové mRNA - represe translace. Vznik z vlásenkového prekursoru (70 bp), přepisován z intergenových oblastí. Živočichové – jeden prekursor společný pro několik miRNA. Rostliny – každá miRNA má svůj prekursor, maturované miRNA jsou methylované (HEN1). 47 microRNA ROSTLINY ŽIVOČICHOVÉ - degradace mRNA (AGO1) - represe translace cílové sekvence spojená s její destabilizací - vysoká komplementarita s cílovou sekvencí - limitovaná komplementarita s cílovou sekvencí - 2/3 regulují expresi transkripčních faktorů - širokospektrý účinek (vývoj) 48 http://courses.biology.utah.edu/bastiani/3230/DB%20Lecture/Lectures/WormRNAi.html siRNA A HETROCHROMATIN Heterochromatin obsahuje repetitivní sekvence a transpozony, transkripčně umlčená oblast. (Trans)geny inzertované do heterochromatinových oblastí – umlčení (Drosophila – PEV). RNAi – významná role ve formování a umlčení heterochromatinu X „umlčený“ heterochromatin není transkribován 49 RNAi a heterochromatin Mutantní forma kvasinky Schizosaccharomyces pombe, blokována RNAi (mutace v genech Dicer, Rdp1, ago) neschopnost tvorby heterochromatinových struktur v centromerách během buněčného dělení (Volpe et al., 2002, Science) Mutantní formy Tetrahymena thermophila molekuly siRNA jsou nezbytné pro procesy rearangementu DNA v průběhu konjugace jader (Mochizuki et al., 2002, Cell) 50 Telomerové transkripty Telomery jsou typický heterochromatin (?) (epigenetické modifikace, neobsahují geny, telomere position effect (TPE)) transkripčně neaktivní V savčích buňkách – TERRA (TElomeric Repeat containing RNA) 100 bp – 9 kb v jaderné frakci UUAGGG repetice (jenom slabý signál pro CCCUAA) počátek transkripce v subtelomerické oblasti aspoň část jich zůstává asociována s telomerami in vitro experimenty: TERRA ovlivňují aktivitu telomerázy (Azzalin et al. Science, 2007) 51 RNA polymerázy RNA pol. I – syntéza pre-rRNA 45S (28S, 18S, 5.8S rRNA) RNA pol. II – prekursory mRNA, ncRNA, miRNA RNA pol. III – tRNA, 5S rRNA a ostatní krátké RNA v jádře a cytoplasmě RNA polymerázy v mitochondriích a chloroplastech V rostlinách – RNA polymeráza IV transkripce heterochromatinových oblastí (intergenové sekvence, repetice) vznikají krátké transkripty substráty pro RDRP RNA polymeráza V transkripty zapojené do procesu RDDM 52 53 (Wierzbicki et al., Genes Develop., 2012) https://www.youtube.com/watch?v=cK-OGB1_ELE 54