Elektrody ve službách výzkumu biopolymerů, klinické a environmentální analýzy: Jak si správně vybrat aneb pár příběhů mezi rtutí a diamanty Karolina Schwarzová Katedra analytické chemie, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Karlova Miroslav Fojta Biofyzikální ústav AVČR, v.v.i.; CEITEC, Masarykova univerzita Elektrochemické metody … polarografie -I -E Cd0 Cd2+ 2e- identifikace elektrochemicky aktivní látky (co to je) kvantifikace (jaká je koncentrace) kapající rtuťová elektroda Nobelova cena 1959 Jaroslav Heyrovský Výsledek obrázku pro polarografická nádobka -I -E Cd2+ Cd0 2 e- •měření na stacionárním povrchu • •visící rtuťová kapková elektroda •jakékoli pevné elektrody Cd2+ Cd0 2 e- Elektrochemické metody … voltametrie Osnova •pracovní elektrody a jejich modifikace •potenciálové okno a čím je omezeno •adsorpce, pasivace, čištění a obnovování povrchu elektrody •adsorpce jako nepřítel a adsorpce jako kamarád •strukturní analýza nukleových kyselin pomocí adsorpčně-desorpčních dějů •katalytické vylučování vodíku na rtuti •využití v elektroanalýze chemicky modifikovaných nukleových kyselin, polysacharidů a glykoproteinů •elektrochemie peptidů a bílkovin, Brdičkova reakce, katalytické vlastnosti nemodifikovaných proteinů – pík H •pár poznámek k toxicitě rtuti • • Z čeho jsou pracovní elektrody? •rtuťové •pevné kovové (stříbrné, platinové, měděné, zlaté, bizmutové, antimonové) •amalgamové (rtuť + jiný kov) • • •uhlíkové: různé formy grafitu (sp2 uhlík), diamant (sp3 uhlík) •pastové elektrody •tištěné elektrody •pentilkové tuhy Modifikace povrchů elektrod - příklady •polyionty (elektrostatická adsorpce opačně nabitých analytů apod.) • •nanočástice, uhlíkové nanoobjekty • •vodivé polymery •(např. elektropolymerizovaný •anilín a další aromatické aminy); •„molecular imprinting“ • •imobilizace „bioreceptorů“ přes •–SH skupiny (obvykle na zlatě) • • Z čeho jsou pracovní elektrody? •rtuťové •pevné kovové (stříbrné, platinové, měděné, zlaté, bizmutové, antimonové) •amalgamové (rtuť + jiný kov) • • •uhlíkové: různé formy grafitu (sp2 uhlík), diamant (sp3 uhlík) •pastové elektrody •tištěné elektrody •pentilkové tuhy Z čeho jsou pracovní elektrody? •rtuťové •pevné kovové (stříbrné, platinové, měděné, zlaté, bizmutové, antimonové) •amalgamové (rtuť + jiný kov) • • •uhlíkové: různé formy grafitu (sp2 uhlík), diamant (sp3 uhlík) •pastové elektrody •tištěné elektrody •pentilkové tuhy Méně znamená často více! Potenciálové (pracovní) okno •oblast potenciálů, kde „se dá něco změřit“ (za daných podmínek na dané elektrodě) •kde neprobíhají pokud možno žádné jiné elektrochemické děje, než ty, které dávají signál analytu •ani rozklad elektrody •ani rozklad základního elektrolytu (rozpouštědla) -I -E rtuť uhlík vyvíjení vodíku H+ + e- → ½ H2 2 OHˉ - 2e- → H2O + ½ O2 Hg - 2e- → + Hg2+ velké vodíkové přepětí na rtuti jiné materiály se místo anodického rozpouštění pokrývají vrstvou oxidů (např. Au, v podstatě i uhlík) – záleží na podmínkách Adsorpce, pasivace a obnovování povrchu •adsorpce je hromadění molekul nějaké látky (plynu, rozpuštěné látky) na povrchu (mezifází), např. elektrody •adsorpce vs. absorpce • Výsledek obrázku pro adsorption fázové rozhraní aBsorpce aDsorpce aDsorpce aBsorpce Adsorpce, pasivace a obnovování povrchu •Adsorpce jako nepřítel: •„adsorption is nightmare of electrochemists“: komplikace při studiu mechanismů elektrodových dějů •adsorpce složek matrice, ve které stanovujeme látku, která nás zajímá, může zcela znemožnit analýzu (např. proteiny v biologických vzorcích) •pasivace elektrody: často v důsledku blokování povrchu adsorbovanými produkty elektrochemických přeměn (ty mohou být polymerní, tudíž jsou adsorbovány silně) Adsorpce, pasivace a obnovování povrchu •Obnovování povrchu: •v případě rtuťové kapkové elektrody není problém – nová kapka •pevné elektrody: •mechanicky (obrousit, přeleštit) •chemicky (např. „piranha solution“) •elektrochemicky (anodicky nebo katodicky) •většinou komplikace Výsledek obrázku pro polarografická nádobka Adsorpce, pasivace a obnovování povrchu •Adsorpce jako kamarád: •akumulace analytu na povrchu elektrody •na povrchu rtuti se ochotně akumuluje řada organických látek a všechny biopolymery (hydrofobní povrch rtuti ve vodném prostředí: similia similibus solvuntur → hydrofobní molekuly (jejich části) se ochotně z vody adsorbují na rtuť) •o velikosti odezvy rozhoduje koncentrace na povrchu, nikoli koncentrace v roztoku! • • • • • •dostatečně pevná adsorpce: přenosové (ex-situ) elektroanalytické techniky adsorpce DNA a jiných biopolymerů na povrchu elektrod je natolik pevná, že vydrží výměnu média přenos přenos měření v čistém základním elektrolytu adsorpce Adsorptive Transfer Stripping Adsorpce, pasivace a obnovování povrchu •Adsorpce jako kamarád: •adsorpčně/desorpční děje na povrchu elektrody lze měřit •analyticky užitečné kapacitní (tensametrické) signály •v případě nukleových kyselin na negativně nabitém povrchu rtuti jsou tyto signály vysoce citlivé k jejich struktuře •rozhoduje, které složky DNA se adsorpčně-desorpčních procesů účastní • puriny thymine (T) pyrimidiny cytosine (C) adenine (A) guanine (G) dvoušroubovice DNA 2-deoxyribose phosphate D:\dokumenty\OPVK\do přednášky\514px-DNA_chemical_structure.svg.png párování bází malý žlábek velký žlábek Co to jsou nukleové kyseliny? tn_Emil Emil Paleček (50. léta): objev polarografie DNA nature1 nature2 DSCF0004 http://foto.vlada.cz/g2data/albums/tiskove/listopad/ceska_hlava/EA7A3690.JPG Česká Hlava 2014 potential/V vs. SCE GHMDE Gox Aox CA -1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 1.5 1 3 Tox Cox uhlíkové elektrody rtuťové elektrody redukce adsorpce/desorpce oxidace oxidace redukčního produktu Přehled elektrochemie (přírodních) NK Podrýváme dogmata… redukce bází na uhlíku + další možnosti detekce produktů redukce nebo oxidace bází obyčejná grafitová elektroda: „méně je někdy více“… double-helix dvoušroubovice deformovaná dvoušroubovice jednořetězcová DNA 1 2 3 Píky 2 a 3: informace o struktuře DNA Adsorpčně-desorpční procesy DNA na negativně nabitém Hg povrchu Složky DNA, které mohou vstoupit do kontaktu s povrchem elektrody: cukr-fosfátová páteř hrany párů bází nespárované báze -cukr-fosfátová páteř DNA je negativně nabitá -báze jsou relativně hydrofobní Nucleic acids are electrochemically reducible/oxidizable •at mercury electrodes, bases A,C and G can be reduced; reduction of guanine is chemically reversible • •at carbon electrodes, purine bases can be oxidized • • •sugar residues in nucleic acids can be oxidized at copper electrode Nucleic acids are electrochemically reducible/oxidizable adenine and cytosine are irreversibly reduced CA guanine is reduced at even more negative potentials... …and its reduction product yields an anodic peak in cyclic voltammetry G Guanine and adenine residues yield specific oxidation peaks at carbon electrodes PSA Gox Aox Guanine and adenine residues yield specific oxidation peaks at carbon electrodes PSA Reduction DNA signals at the mercury electrodes are strongly influenced by DNA structure •this is due to location of the A and C electroactive sites within the Watson-Crick hydrogen bonding system square-wave voltammetry Reduction DNA signals at the mercury electrodes are strongly influenced by DNA structure DNA oxidation at carbon electrodes is less influenced by DNA structure •oxidation sites of guanine and adenine in dsDNA are located closer to the double helix surface and are accessible via the double helix grooves DNA oxidation at carbon electrodes is less influenced by DNA structure At mercury electrodes in weakly alkaline media, adsorption-desorption (tensammetric) signals of nucleic acids can be detected (e.g., using AC polarography, voltammetry, impedance) •depending on the conditions and on DNA structure, individual components of the polynucleotide chains may be involved in adsorption/desorption processes background electrolyte -at moderate ionic strenght, double-stranded DNA yields peak 1 due to desorption/reorientation of DNA segments adsorbed via the sugar-phosphate backbone 1 double-helix -distorted or regions of double-stranded DNA yield peak 2 (edges of base pairs involved in a stronger adsorption) double-helix 2 background electrolyte 2 background electrolyte single-stranded (denatured) DNA yields peak 1 (due to the sugar-phosphate backbone) and ss-specific peak 3 due to desorption/reorientation of DNA segments adsorbed via freely accessible bases 3 double-helix double helix deformed double helix single-stranded DNA 1 2 3 Peaks 2 and 3: information about DNA structure Summary of adsorption-desorption processes of DNA on negatively charged Hg surface DNA components, which may be in contact with electrode surface: sugar-phosphate backbone edges of the base pairs unpaired bases -sugar-phosphate backbone of DNA is negatively charged -bases are relatively hydrophobic 5 Adsorption/desorption behavior of DNA at electrodes is strongly related to negative charge of its sugar-phosphate backbone (together with a strong adsorption of nucleobases via hydrophobic forces) peptide nucleic acid: DNA analogue with neutral backbone DNA PNA (decamers, identical base sequence) AC Z at HMDE Modification of DNA in major groove •preparation of functionalized DNA – labeling, studying DNA-protein interactions etc. • •bulky aromatic groups bound to bases so that they are accessible through the major groove • •affects adsorption-desorption behavior of double-stranded DNA • CFT – extent of modification 1 3 ssDNA dsDNA DNA without breaks DNA with breaks intercalation: interaction of DNA with drugs RNA vs. DNA superhelical DNA Structural analysis of nucleic acids using adsorption/desorption DNA quadruplexes guanine tetrad Effects of DNA structure beyond the duplex: guanine quadruplexes K+ 15-mers with increasing length of dGn stretches negatively charged HMDE positively charged PGE Ana Brett et al. (e.g. Anal Chem 2014) Katalytické vylučování vodíku na rtuťových elektrodách oblast potenciálů, kde existuje katalyticky aktivní částice (R) •lze měřit díky dostatečně vysokému vodíkovému přepětí (=vysoká aktivační energie pro redukci protonů H+) • •katalýza: obecně usnadnění nějakého procesu snížením aktivační energie • •katalyzátory elektrochemicky generované v určité oblasti potenciálů • •katalyzátor se nepotřebovává → zprostředkuje redukci mnoha protonů → velký elektronový výtěžek → vysoká citlivost Katalytické vylučování vodíku na rtuťových elektrodách elektroda s nižším vodíkovým přepětím Katalytické vylučování vodíku doprovázející redukci komplexů přechodných kovů/jejich aduktů s DNA CV Osmium osmium platina •vývoj semisyntetických organismů schopných replikovat nepřirozené páry bází (Romesberg et al) •rozšíření písmen genetické abecedy na šest •kódování nepřirozených aminokyselin, syntéza nepřirozených proteinů •nová úroveň biotechnologií, vývoj léků •potřeba stanovovat jednoduše, přesně a citlivě malá množství nepřirozených bp v nadbytku normální DNA •elektrochemie na rtuťové elektrodě se ukazuje jako nejlepší volba! Nepřirozené páry bazí pro rozšíření genetického kódu: extrémně citlivé stanovení pomocí elektrokatalýzy na rtuti Výsledek obrázku +1 -1 -2 E/V -I W Y elektrochemická oxidace tryptofanu, tyrozinu a histidinu signály peptidů a proteinů obsahujících cystein (cystin) UHLÍKOVÉ ELEKTRODY RTUŤOVÉ ELEKTRODY redukce vazby S-Hg redukce vazby S-S (cystin) Brdičkova reakce (v přítomnosti Co) arginin prenatriová vlna pík H Soubor:L-cysteine-skeletal.png Výsledek obrázku pro tyrosine Výsledek obrázku H Výsledek obrázku Výsledek obrázku pro arginin Výsledek obrázku pro lysin katalytické vylučování vodíku lysin histidin Elektrochemie proteinů brdicka1 -prakticky od objevu polarografie -odvozena od elektrochemie jejich složek, tj. aminokyselin Brdičkova reakce •nutná přítomnost cysteinu a iontů kobaltu •ne úplně pochopený mechanismus: katalytické děje i přímá redukce stabilních komplexů (Cys)nCo(II) •2-3 charakteristické „vlny“, jejich intenzita závisí na počtu cysteinových zbytků, jejich přístupnosti, prostředí, ve kterém se nacházejí v rámci molekuly proteinu (okolní AK atd.) • •z (bio)analytického hlediska zaslouží tato technika zvláštní pozornost v souvislosti s proteiny a peptidy bohatými na cystein: metalothioneiny, fytochelatiny Soubor:L-cysteine-skeletal.png Co2+ Jednoduché stanovení metalothioneinů a fytochelatinů Metallothionein 2kak.png Brdičkova reakce a diagnostika rakoviny? - kdysi poměrně rozšířený diagnostický test - R. Kizek a kol. (MENDELU) - rakovina a metalothioneiny metalothionein (komplex se zinečnatými ionty) Jednoduché stanovení metalothioneinů a fytochelatinů fytochelatiny: každá cca druhá AK cystein Lze fytochelatiny stanovit elektrochemicky co nejjednoduším způsobem? •katalytický proces na rtuťové elektrodě (aminokyseliny nesoucí labilním proton: lyzin, arginin, histidin) • • •vysoká citlivost detekce peptidů a bílkovin •citlivost k •agregaci bílkovin •denaturaci bílkovin („unfolding“) •změnám redox stavu peptidů a bílkovin (-SH vs. –S-S-) •záměnám jednotlivých aminokyselin (rozlišení standardních a mutantních bílkovin) pík H a strukturně citlivá analýza proteinů Výsledek obrázku Výsledek obrázku pro arginin Výsledek obrázku pro lysin pík H a strukturně citlivá analýza proteinů obrovský rozdíl mezi nativními a denaturovanými proteiny (zejm. na HMDE modifikované DTT) agregace a-synucleinu (Parkinsonova choroba): elektrochemie unikátně rozliší časné fáze agregace Paleček, Ostatná a kol. pík H a strukturně citlivá analýza proteinů „unfolding“ proteinů v důsledku odstranění strukturně významného iontu zinku (protein p53, inkubace s EDTA; srovnání s trvale nestrukturovaným mutantem) DNA-protein interakce (specifický komplex p53-DNA nedává pík H) nestrukturovaný EDTA EDTA EDTA Paleček, Ostatná a kol. rtuťová elektroda – exponát do muzea? NE! ? Výsledek obrázku pro rtutová elektroda Toxicita rtuti •rtuť je toxická, ale v jaké formě? •kovová rtuť: chemicky stálá, tudíž bezpečná •páry: pozor na chronickou otravu, při náhodném nadýchání plně reverzibilní •soli a jejich roztoky: toxické •organické sloučeniny: TOXICKÉ!!! •státy EU i jiné zakazují rtuťové elektrody (s kovovou rtutí), ale nezakazují „úsporné žárovky“ •alternativy – rtuťové filmy (sic!), amalgamy, bismut Na rtuť z teploměru hasiči s respirátory?? Lidi neblázněte!!! NAVÍC TOXICKÉ JSOU I JINÉ VĚCI! Druhá tvář dnešní přednášky •diamanty: téma dozajista netoxické a biokompatibilní J • • • • Výsledek obrázku pro diamantový náhrdelník Výsledek obrázku pro ponte vecchio Výsledek obrázku pro diamant